產(chǎn)地加工與炮制一體化工藝對秦皮飲片抗炎作用的影響＊

趙重博，王 晶，鄒俊波，吳建華，李曉堯，史亞軍，王昌利

（陜西中醫(yī)藥大學藥學院 咸陽 712046）

秦皮為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹 Fraxinus chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹Fraxinus szaboana Lingelsh.或宿柱白蠟樹Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮，主產(chǎn)于陜西，春秋兩季采收[1]，尤以3-4年生的干皮藥材質(zhì)量為好。秦皮為清熱燥濕藥，傳統(tǒng)用于治療濕熱瀉痢、目赤腫痛等癥，現(xiàn)臨床上多用于治療腸炎、慢性支氣管炎、細菌性痢疾、目赤腫痛、牛皮癬等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明秦皮有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、利尿的作用[3]，這與秦皮所含的香豆素類、酚類、皂苷、鞣質(zhì)、生物堿等成分有關(guān)，其中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素等香豆素類成分是秦皮藥材質(zhì)量控制的指標成分[4]。

秦皮飲片的炮制方法為秦皮藥材除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切絲，干燥。而目前市場上的秦皮飲片多存在不去粗皮或粗皮去不凈的現(xiàn)象，嚴重影響秦皮的臨床療效和調(diào)劑時的劑量準確性。皮類藥材市場上多以面積大小來顯示藥材等級[5]，由于秦皮藥材價格便宜，且采收費時費力，導致藥農(nóng)在采收時只采生長年限長（尤其5年以上[6]）的樹皮，雖然這些樹皮面積大，但是纖維性很強、栓皮部位很厚。秦皮藥材產(chǎn)地加工的時候為彰顯藥材等級，多進行簡單的切割壓成整張的大樹皮后干燥，盡可能地保證樹皮的完整，不要求去粗皮直接干燥。這樣的樹皮在飲片廠即使反復悶潤也很難刮去粗皮，因此很多飲片廠生產(chǎn)的秦皮不去粗皮，這樣不僅難以保證有效部位的含量，且秦皮切絲多采取橫切，干燥后秦皮絲出現(xiàn)分層或韌皮部與栓皮部分離的現(xiàn)象，既不美觀，也容易掉渣。且秦皮藥材長時間反復悶潤，由于秦皮甲素等香豆素類成分可溶于水，容易導致此類有效成分的流失。

有學者對秦皮進行了產(chǎn)地加工與飲片炮制一體化技術(shù)研究[7]，認為采用一體化加工的秦皮飲片相較于傳統(tǒng)加工炮制方法的秦皮飲片中的有效成分含量有所增加。但僅從化學成分含量的角度對傳統(tǒng)工藝和一體化生產(chǎn)工藝進行了比較，沒有對這2種工藝加工的飲片藥理作用進行研究。因此本實驗對一體化加工和傳統(tǒng)方式加工的秦皮飲片進行了主要功效的研究，進一步評價一體化生產(chǎn)方式的可行性，在確保飲片質(zhì)量及其功效的前提下建立規(guī)范的秦皮飲片生產(chǎn)工藝。

1 材料

1.1 儀器

U3000型反相高效液相色譜儀（美國戴安）；AR1140型電子天平（萬分之一，梅特勒-托利多儀器，（上海）有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海欣齊科學儀器有限公司)；KH-400-KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；QE-300 g粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；iMark酶標儀18485（美國BIO-RAD公司）。

1.2 動物

SD大鼠，50只，雄性，SP F級，體重（165±15）g，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，動物合格證號SCXK（陜）2012－003。

1.3 試藥

秦皮藥材于2017年7月采自于陜西省寶雞市，由陜西中醫(yī)藥大學藥學院王昌利教授鑒定為木犀科植物宿柱白蠟樹Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥干皮，憑證標本保存于陜西中醫(yī)藥大學炮制教研室。傳統(tǒng)秦皮飲片（秦皮-1）和產(chǎn)地加工炮制一體化秦皮飲片（秦皮-2）均為實驗室自制。秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，HPLC≥98%，批號：秦皮甲素110740-200104、秦皮乙素110741-200607，秦皮素111731-200501）；秦皮苷對照品購自西瑪實驗室，HPLC≥98%；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司，批號F20090417）；甲醇、磷酸均為分析純（成都市科龍化工有限公司）；乙腈為色譜純（賽默飛世爾中國有限公司）；水為娃哈哈純凈水；阿司匹林腸溶片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號為BJ27748）；λ-角叉菜膠（美國Sigma公司，22049-5G-F）；白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 傳統(tǒng)秦皮飲片制備

取新鮮秦皮藥材，自然干燥，快速淋洗去除附著雜質(zhì)，加水悶潤至內(nèi)外水分一致，刮去粗皮，切寬絲，70℃恒溫烘箱中干燥4 h，記為秦皮-1。

2.1.2 一體化加工秦皮飲片制備

取新鮮秦皮藥材，刮去粗皮，快速淋洗去除附著雜質(zhì)，切6 mm絲，70℃恒溫烘箱中干燥4 h，記為秦皮-2。

2.2 秦皮飲片水提物的制備取

兩種秦皮飲片各稱取500 g，分別依次加水浸泡30 min，再加10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，合并水煎液濃縮，真空干燥，即得傳統(tǒng)秦皮飲片水提物（秦皮-1#）和一體化加工秦皮飲片水提物（秦皮-2#）50.2 g，47.3 g。

2.3 藥理作用比較

2.3.1 造模及給藥

SD大鼠50只適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為5組，即空白組、模型組、傳統(tǒng)秦皮飲片水提物組、一體化工藝秦皮飲片水提物組、阿司匹林組，每組各10只。稱重并給藥，各組實驗動物給藥劑量如下，兩組秦皮飲片提取物組7.2 g·kg-（1按生藥量算）[8]，阿司匹林組0.225 g·kg-1（去薄膜包衣），模型組和空白組灌胃10 mL·kg-1生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)8 d。最后一次灌胃結(jié)束1 h后，除空白組外，其余大鼠右足趾部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.1 mL致炎[9]，空白組注射0.1 mL生理鹽水，標記右足測量部位，分別在致炎前與致炎后1，2，3，4，5 h測量右足厚度，參考文獻方法計算大鼠足腫脹度[10]。足腫脹度＝致炎后足厚度－致炎前足厚度。

2.3.2 血樣采集及指標測定

足腫脹測定完成后，以1%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，血樣在室溫下靜置1 h。3000 rpm離心10 min，小心吸取上清液即得到血清，保存-20℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說明書測定血清中的IL-1β，TNF-α，MDA含量及SOD（超氧化物歧化酶）活性。

2.3.3 統(tǒng)計處理

2.4 主要化學成分的含量測定

2.4.1 色譜條件[11-12]

色譜柱：Betasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（12：88）；檢測波長：334 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷對照品適量，加甲醇溶解并配制成含秦皮甲素0.33 mg ·mL-1、秦 皮 苷 0.13 mg ·mL-1、秦 皮 乙 素0.21 mg·mL-1、的秦皮素0.16 mg·mL-1混合標準品溶液，混勻備用。

2.4.3 供試品溶液的制備

分別取秦皮-1#樣品和秦皮-2#樣品約0.5 g粉末（過三號篩），精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，再精密加入50 mL甲醇，密塞，稱定總重量，加熱回流1 h，放冷，拆下，再稱定總重量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得秦皮-1#溶液和秦皮-2#溶液。

2.4.4 樣品測定

分別精密吸取秦皮香豆素混標溶液、秦皮-1#樣品溶液和秦皮-2#樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖像和數(shù)據(jù)并進行計算。

2.5 理化鑒別檢查

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版收載的秦皮飲片項下的規(guī)定對秦皮-1#和秦皮-2#飲片樣品分別進行檢查，包括性狀、鑒別、檢查和浸出物測定。

2.5.1 性狀

按照《中華人民共和國藥典》2015年版收載的秦皮飲片項下的性狀描述與制備的秦皮飲片進行對比并記錄。

2.5.2 鑒別

（1）熒光反應：

分別取秦皮-1#和秦皮-2#飲片粉末，加熱水浸泡，浸出液在日光下觀察出現(xiàn)的情況。

（2）薄層鑒別：

供試品溶液的制備：稱取2種秦皮飲片樣品粉末1 g，加10倍量甲醇回流10 min，濾過，取續(xù)濾液即可。

對照品溶液的制備：精密稱定秦皮甲素標準品、秦皮乙素標準品、秦皮素標準品各20 mg至10 mL容量瓶，加甲醇補至刻度，制成每1 mL含秦皮甲素標準品、秦皮乙素標準品及秦皮素標準品分別為2 mg的對照品混合溶液。

測定法：，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（6·1·0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm)下檢視。

2.5.3 檢查

（1）水分測定：

分別取3份秦皮-1#和秦皮-2#飲片粉末，每份5 g（過二號篩），平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，開啟瓶蓋在105℃的烘箱干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再開啟瓶蓋在105℃的烘箱干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供秦皮-1#和秦皮-2#飲片含水量（%)。

（2）總灰分：

分別取3份秦皮-1#和秦皮-2#飲片粉末，每份3g（過二號篩），置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量，在馬弗爐中程序升溫至完全炭化，逐漸升高溫度至600℃,使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算秦皮-1#和秦皮-2#飲片中總灰分的含量（%)。

2.5.4 浸出物

分別取3份秦皮-1#和秦皮-2#飲片粉末，每份3 g（過二號篩），精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加95%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，靜置1h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。分別計算秦皮-1#和秦皮-2#飲片醇溶性浸出物的含量(%)。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同工藝秦皮飲片抗炎測定結(jié)果

測定各組大鼠的右足厚度，計算各組大鼠的足腫脹度，結(jié)果見表1，測定各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、SOD、MDA的活性，結(jié)果見表2。

大鼠注射角叉菜膠后，除空白組外，各組大鼠右足相繼表現(xiàn)出腫脹的現(xiàn)象，在第4個小時的時候，一體化秦皮飲片組和傳統(tǒng)秦皮飲片組的大鼠足腫脹程度開始出現(xiàn)抑制，而阿司匹林組在2 h就表現(xiàn)出抑制作用。血清炎癥因子的檢測結(jié)果表面，模型組與空白組比較，IL-1β、TNF-α、MDA的活性均顯著升高，SOD的活性顯著降低；與模型組相比，一體化秦皮飲片組、傳統(tǒng)秦皮飲片組、阿司匹林組的IL-1β、TNF-α、MDA的活性均顯著降低，SOD的活性顯著升高；一體化秦皮飲片組與傳統(tǒng)秦皮飲片組相比，IL-1β、TNF-α、MDA的活性有所降低，SOD的活性有所升高，但兩組間的差異均無顯著性。

3.2 不同工藝秦皮飲片香豆素類成分含量測定結(jié)果

不同工藝秦皮水提物樣品秦皮-1#和秦皮-2#的高效液相結(jié)果見圖1。分別按10.04%（500 g傳統(tǒng)秦皮飲片得秦皮水提物50.2 g）和9.46%（500 g一體化秦皮飲片得秦皮水提物47.3 g）還原為秦皮飲片的量，即秦皮-1樣品中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的質(zhì)量分數(shù)分別為0.72%，0.43%，0.21%，0.18%，四種成分之和為1.54%；這些成分在秦皮-2樣品中的質(zhì)量分數(shù)分別為1.13%，0.62%，0.37%，0.19%，四種成分之和為2.31%，即一體化秦皮飲片的主要香豆素類成分為傳統(tǒng)秦皮飲片水提物的1.5倍，且《中華人民共和國藥典》規(guī)定的秦皮甲素和秦皮乙素的總量約為其1.6倍。

表1 各組大鼠足腫脹度（s，cm）

表1 各組大鼠足腫脹度（s，cm）

注：與模型組比較，*P＜0.05；一體化秦皮飲片組與傳統(tǒng)秦皮飲片組相比，▲P＜0.05

5 h 0.38±0.03 0.31±0.07*0.28±0.07*0.22±0.04*組別模型組秦皮-1#秦皮-2#阿司匹林組1 h 0.11±0.08 0.15±0.06 0.13±0.09 0.12±0.04 2 h 0.21±0.04 0.25±0.04 0.27±0.06 0.27±0.06 3 h 0.28±0.07 0.33±0.05 0.31±0.13 0.25±0.07*4 h 0.34±0.05 0.34±0.11 0.31±0.09 0.23±0.08*

表2 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、SOD、MDA含量（s，n mol/mL）

表2 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、SOD、MDA含量（s，n mol/mL）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；一體化秦皮飲片組與傳統(tǒng)秦皮飲片組相比，▲P＜0.05

MDA 9.56±0.79 12.16±1.58*10.27±0.47 10.07±0.46**9.77±0.47**組別空白組模型組秦皮-1#秦皮-2#阿司匹林組IL-1β 8.59±0.22 9.25±0.34*8.96±0.16**8.95±0.13**8.60±0.45**TNF-α 10.73±0.64 11.69±0.70*11.11±0.23**11.03±0.47**10.88±0.57**SOD 11.45±2.25 9.07±0.58*9.93±0.72**9.70±0.31**10.06±0.53**

圖2 秦皮飲片

3.3 不同工藝秦皮飲片理化鑒別檢查結(jié)果

3.3.1 性狀比較

秦皮-1#和秦皮-2#飲片的外觀性狀圖見圖2，其中：

秦皮-1#：本品長短不一的寬絲，絲寬9-12 mm。外表面灰棕色或黑棕色。內(nèi)表面黃白色或棕色，平滑。切面纖維性。質(zhì)硬。氣微，味苦。

秦皮-2#：本品長短不一的寬絲，絲寬5-6 mm。外表面灰棕色或黑棕色。內(nèi)表面黃白色或棕色，平滑。切面纖維性。質(zhì)硬。氣微，味苦。

由以上結(jié)果可知秦皮-1#和秦皮-2#均符合《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下的性狀描述。但可明顯看出，相比秦皮-2#飲片，秦皮-1#飲片存在少部分栓皮，且飲片碎渣較多，這與飲片廠反復干燥且粗皮分離不徹底有一定的關(guān)系。

3.3.2 鑒別比較

（1）熒光反應：秦皮-1#和秦皮-2#飲片的熒光反應圖見圖3，兩者在日光下觀察，均可見碧藍色熒光。

（2）薄層鑒別：秦皮-1#和秦皮-2#飲片的薄層色譜圖見圖4，兩者在與秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮素相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

由以上結(jié)果可知秦皮-1#和秦皮-2#均符合《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下的鑒別項要求。

3.3.3 檢查比較

（1）水分測定結(jié)果：秦皮-1#水分測定結(jié)果為4.07%±0.25%，秦皮-2#水分測定結(jié)果為4.75%±0.19%，由以上結(jié)果可知秦皮-1#和秦皮-2#均符合《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下的水分的要求。

（2）總灰分測定結(jié)果：秦皮-1#總灰分測定結(jié)果為5.35%±0.42%，秦皮-2#總灰分測定結(jié)果為5.42%±0.36%，由以上結(jié)果可知秦皮-1#和秦皮-2#均符合《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下的總灰分的要求。

3.3.4 醇溶性浸出物含量比較

醇溶性浸出物含量測定結(jié)果：秦皮-1#浸出物測定結(jié)果為10.43%±2.27%，秦皮-2#浸出物測定結(jié)果為11.56%±3.73%，由以上結(jié)果可知秦皮-1#和秦皮-2#均符合《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下的浸出物的要求。

4 討論

本試驗以角叉菜膠致大鼠足腫脹作為炎癥模型，以降低足腫脹程度和TNF-α、IL-1β、MDA、SOD作為評價指標，考察一體化生產(chǎn)的秦皮飲片與傳統(tǒng)秦皮飲片的抗炎藥效差異。TNF-α和IL-1β是重要的促炎因子，TNF-α是由巨噬細胞產(chǎn)生的一種能刺激破骨細胞和抑制成骨細胞的細胞因子，能夠參與炎癥的發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)和發(fā)熱。IL-1β又稱淋巴細胞刺激因子，主要通過刺激炎癥和自身免疫病相關(guān)基因的表達，在免疫調(diào)節(jié)及炎癥進程中扮演著重要的角色。SOD和MDA為可作為自由基基礎代謝情況的評價指標，SOD是氧自由基清除體系的關(guān)鍵因子，可降低細胞受到自由基的損害。自由基受損時，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，脂質(zhì)過氧化物反應在炎癥及免疫調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用，MDA是脂質(zhì)過氧化物反應產(chǎn)生的因子，用MDA活性來評價脂質(zhì)過氧化反應及細胞受損的程度；然而自由基引起脂質(zhì)過氧化及一些基因的表達，在炎癥和免疫過程中起著重要的作用。SOD能催化具有抗炎作用的氧及過氧化氫的生成，得以減輕炎性癥狀[13-14]。一體化秦皮飲片和傳統(tǒng)秦皮飲片水提物能夠顯著降低炎癥大鼠血清中IL-1β、TNF-α、MDA的水平，能夠抑制急性炎癥的發(fā)展程度，同時升高SOD的水平，降低細胞受到自由基的損害發(fā)揮抗炎作用。且結(jié)果表明一體化秦皮飲片組的抗炎效果略優(yōu)于傳統(tǒng)秦皮飲片組，但兩者的抗炎作用之間的差異沒有顯著性。

圖3 秦皮飲片沸水熒光反應

圖4 秦皮飲片TLC圖

有研究表明，秦皮香豆素類成分（尤其是秦皮甲素和秦皮乙素）具有消炎、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)免疫的功效[15-18]，這與本次藥理實驗結(jié)果與成分定量測定結(jié)果具有一致性，兩種飲片水提物中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素等4種主要有效成分的含量，這四種香豆素類成分在一體化加工秦皮飲片總量約為傳統(tǒng)秦皮飲片的1.5倍，且一體化加工秦皮飲片秦皮甲素和秦皮乙素的含量約為傳統(tǒng)秦皮飲片的1.6倍。結(jié)合藥理實驗結(jié)果分析，秦皮飲片中香豆素類成分的含量差異是導致其抗炎消腫效果差異的原因，其抗炎機制可能與降低血清中IL-1β、TNF-α、MDA的水平和升高SOD的水平等有關(guān)。

按照《中華人民共和國藥典》2015年版秦皮飲片項下相關(guān)項目對傳統(tǒng)加工方式和產(chǎn)地一體化加工方式的秦皮飲片進行檢查，結(jié)果表明兩種方法制備的秦皮飲片均符合藥典相關(guān)規(guī)定，總體來說產(chǎn)地一體化加工方式的秦皮飲片質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)加工方式的秦皮飲片，但是水分檢查項傳統(tǒng)加工方式的秦皮飲片低于產(chǎn)地一體化加工方式的秦皮飲片，但是也導致秦皮飲片在保存的時候會出現(xiàn)掉渣等情況影響外觀。

本文通過對不同加工方式的秦皮飲片進行主要藥效作用與化學成分研究，結(jié)果表明兩者在抗炎消腫功效上以及化學成分組成上均具有較好的相似性。同時，秦皮產(chǎn)地加工與炮制一體化的生產(chǎn)方式，解決了飲片傳統(tǒng)生產(chǎn)方式中原料藥材軟化時間長且軟化程度不一致導致飲片質(zhì)量不穩(wěn)定的問題以及曬干藥材粗皮難以去處的問題，并且大大縮短了加工周期，為秦皮飲片生產(chǎn)模式的變革提供借鑒。