藥用植物四環(huán)三萜皂苷生物合成及代謝研究進展＊

楊 玲，范 偉，孟珍貴，龍光強，李龍根，張廣輝，楊生超，陳軍文＊＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點實驗室 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心 昆明 650201）

三萜皂苷是以糖苷鍵將三萜皂苷元和糖結(jié)合從而形成的配糖體，其中包括四環(huán)三萜（達瑪烷型為主）和五環(huán)三萜（齊墩果烷型為主）兩大類，圖1所示分別為達瑪烷和齊墩果烷以及各自代表性的三萜皂苷：20（S）-原人參二醇和黃甘草皂苷。近幾十年還發(fā)現(xiàn)了由于氧化、環(huán)裂解、甲基轉(zhuǎn)位、重排及降解等產(chǎn)生的高度氧化的新骨架類型三萜皂苷。三萜皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從植物中直接提取或通過化學(xué)合成間接獲得都較為困難[1]。因此，闡明四環(huán)三萜皂苷的生物合成途徑及代謝調(diào)控對于了解三萜皂苷的整體代謝框架具有重要意義。

四環(huán)三萜皂苷（Tetracyclic triterpenoid saponins）作為三萜皂苷中重要的一類，其主要包括達瑪烷型（Dammaranes）、羊毛脂烷型（Lanostanes）、環(huán)菠蘿蜜烷/環(huán)阿屯烷型（Cycloartanes）、大戟烷型（Euphane）、葫蘆烷型（Cucurbitanes）、楝烷型（Meliacanes）、甘遂烷型（Tirucallanes）等。目前四環(huán)三萜皂苷主要存在于雙子葉植物中，靈芝屬中也有大量報道發(fā)現(xiàn)，如許多常用藥用植物如人參（Panax quinquefolius）[2]、黃芪（Astragalus membranaceus）[3,4]、三七（Panax pseudoginseng）[5]、麥 冬（Ophiopogon japonicus）[6,7]、升麻（Cimicifuga foetida）[8,9]、靈芝（Ganoderma lucidum）[10,11]等都含有四環(huán)三萜皂苷類成分。

圖1 三萜皂苷中達瑪烷與齊墩果烷型皂苷結(jié)構(gòu)示意圖

雖然很多藥用植物的有效成分屬于四環(huán)三萜皂苷化合物，但在藥用植物中其往往含量偏低，天然藥用植物資源十分有限，嚴(yán)重影響了其活性成分的開發(fā)利用。藥用植物資源匱乏及其種植所面臨的一系列問題推進了基因工程等技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域的廣泛利用。目前三萜皂苷代謝工程研究仍處于前期初步探索過程中，對大多數(shù)四環(huán)三萜皂苷的合成途徑和代謝調(diào)控機制尚未進行深入研究，相關(guān)酶基因及其表達調(diào)控的研究報道還比較少，而通過代謝工程或基因工程進行四環(huán)三萜皂苷生物合成的工廠化生產(chǎn),具有廣闊的市場前景。本文綜述了藥用植物四環(huán)三萜皂苷的一些代表性成果，探究其在次生代謝工程及基因工程領(lǐng)域內(nèi)的研究方法與策略，以期對藥用植物四環(huán)三萜皂苷后續(xù)研究提供一定的參考價值。

1 四環(huán)三萜皂苷及其生物合成

目前研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)三萜皂苷的代謝合成主要通過甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway,MVA途徑）和類異戊二烯途徑（Isoprenoid Biosynthetic Pathway,MEP途徑），形成異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）前體物，生成2，3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqua?lene），再經(jīng)后續(xù)的一系列關(guān)鍵酶及相關(guān)酶，如達瑪烯二醇合成酶（DS）、環(huán)阿屯合酶（CS）、羊毛甾醇合酶（LS）、細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP450）、糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）等進行三萜骨架修飾，從而合成多種結(jié)構(gòu)和功能各異的四環(huán)三萜皂苷[12,13]。

1.1 達瑪烷型三萜皂苷

達瑪烷型如五加科植物人參、三七和西洋參（Panax quinquefolius）等的根、莖、葉、花、果實中均含有多種人參皂苷[14-18]，酸棗（Ziziphus jujuba）仁中的酸棗仁皂苷(jujuboside)A和B[19]，以及絞股藍(lán)中的絞股藍(lán)（Gy?nostemma pentaphyllum）皂苷[20,21]，其苷元絕大多數(shù)屬于達瑪烷型四環(huán)三萜，達瑪烷型三萜皂苷結(jié)構(gòu)從環(huán)氧鯊烯由全椅式構(gòu)象形成達瑪烷骨架，主要分為20（S）-原人參二醇和20（S）-原人參三醇。達瑪烷型皂苷在心腦血管系統(tǒng)、抗衰老及抗腫瘤等方面具有廣泛應(yīng)用[22-25]，迄今為止其研究仍關(guān)注在少數(shù)幾種植物中，深入挖掘達瑪烷型皂苷生物合成及代謝機理將有助于后續(xù)對達瑪烷型皂苷的開發(fā)利用。

1.2 環(huán)阿屯烷型三萜皂苷

環(huán)阿屯烷型基本骨架在C19位甲基與C9位脫氫形成三元環(huán)，其母核結(jié)構(gòu)在C13，C14位分別連接有β、α-CH3，環(huán)阿屯烷型三萜皂苷在豆科、五味子科、毛茛科、大戟科、楝科、仙茅科等植物中均有報道其化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性的相關(guān)研究[26-29]，如黃芪具有補氣強壯之功效，從其中分離鑒定出20個左右的皂苷，多數(shù)皂苷元為環(huán)黃芪醇[30]；環(huán)阿屯烷型三萜除在中藥黃芪中發(fā)現(xiàn)外，在升麻族植物中廣泛存在[31]；白芨（Bletilla striata）鑒定出環(huán)阿屯型三萜并且研究了其抗血管生成活性[32]。

1.3 其他四環(huán)三萜皂苷

圖2 人參皂苷Rb1和Rg1生物合成途徑

羊毛脂烷亦稱羊毛脂甾烷，與達瑪烷型極為相似，不同點在于其C18甲基連在C13位，有研究表明在靈芝中分離出羊毛脂烷型三萜皂苷，是羊毛甾烷的高度氧化化合物[33-35]。此外，從葫蘆科雪膽屬雪膽（Hemsleya chinensis）中雪膽甲素、雪膽乙素均屬于葫蘆烷型[36-39]；有研究發(fā)現(xiàn)無患子（Sapindus mukorossi）中含有大戟烷型三萜皂苷[40]；楝烷型三萜皂苷主要在楝科植物中有所報道[41-43]；而甘遂烷型三萜皂苷在植物分布中比較罕見，在臭椿屬（Ailanthus Desf.）中有分離得到[44-47]，從生源合成來看，甘遂烷型三萜等原檸檬苦素是形成四降三萜的前體物質(zhì)[48]。目前羊毛脂烷型、葫蘆烷型、大戟烷型、楝烷型、甘遂烷型三萜皂苷相關(guān)文獻報道較少，大多數(shù)研究還停留在其化學(xué)成分的提取分離鑒定及生物活性分析方面，對于生物合成與代謝調(diào)控的研究尚淺。

1.4 四環(huán)三萜皂苷生物合成

在四環(huán)三萜皂苷生物合成過程中，值得注意的是2，3-氧化鯊烯經(jīng)環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶（OSCs）的催化發(fā)生環(huán)化反應(yīng)這一關(guān)鍵步驟[49-51]。不同四環(huán)三萜化合物其立體構(gòu)型是復(fù)雜多樣的，而作為多基因家族的OSCs，可使環(huán)氧角鯊烯發(fā)生環(huán)化，從而生成各類骨架的三萜化合物，然后通過細(xì)胞色素P450單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶一系列相關(guān)酶的作用等對骨架進行氧化置換和糖基化等化學(xué)修飾，最終生成不同類型的四環(huán)三萜皂苷類化合物。由于受到多種因素的調(diào)節(jié)，且在這一合成的動態(tài)變化過程中所涉及到的各種中間產(chǎn)物和酶具有復(fù)雜性，因此目前對四環(huán)三萜皂苷的合成機理認(rèn)識尚不清晰。

以典型的四環(huán)三萜皂苷——人參皂苷Rb1和Rg1為例[52]由人參皂苷Rb1和Rg1生物合成途徑（圖2），可見以，2,3-氧化鯊烯為分支點，不同的OSCs催化2,3-氧化鯊烯，獲得達瑪烯二醇（Dammaranediol），再經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶的化學(xué)修飾，生成人參皂苷Rb1和Rg1[53-55]。全化學(xué)合成在人參皂苷生產(chǎn)中尚未得到實現(xiàn)，因此對那些含量少而活性強的人參皂苷單體的研究具有一定的難度。雖然目前對四環(huán)三萜皂苷生物合成途徑的研究逐漸深入，但由于其中、下游合成途徑中的多基因家族酶的結(jié)構(gòu)及類型復(fù)雜多樣，導(dǎo)致離其合成具體步驟的闡明還有一段距離。因此，若要將生物代謝工程及基因工程的方法應(yīng)用到四環(huán)三萜皂苷的合成中，還需對四環(huán)三萜皂苷類化合物生物合成過程中在碳環(huán)骨架建立后所涉及的各種復(fù)雜的官能團反應(yīng)進行深入研究。

2 皂苷的代謝調(diào)控

目前有大量文獻報道關(guān)于五環(huán)三萜皂苷的合成及代謝調(diào)控，相對四環(huán)三萜皂苷研究而言，要更為深入[56]。根據(jù)四環(huán)三萜皂苷相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在其代謝合成途徑中，一方面與外界環(huán)境因素息息相關(guān)，這些因素包括激素、誘導(dǎo)子和環(huán)境刺激等[57-60]，而這些作用具體是通過哪種途徑實現(xiàn)的目前尚未研究清楚，需要進一步探索。另一方面關(guān)鍵酶基因從基因轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上對其進行調(diào)控[61]，即通過基因工程調(diào)節(jié)合成路徑中一些關(guān)鍵化合物的代謝流，利用調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控關(guān)鍵酶編碼基因的表達水平，或使關(guān)鍵酶編碼基因過表達，都有可能有利于四環(huán)三萜皂苷類化合物的大量合成。在代謝途徑中酶的調(diào)節(jié)作用是極為重要的，但由于目前路徑研究尚未清楚，特別是受一些下游合成路徑中涉及的復(fù)雜酶類的影響，導(dǎo)致四環(huán)三萜皂苷類化合物全合成研究成為一大難題。

2.1 四環(huán)三萜皂苷的代謝調(diào)控

2.1.1 關(guān)鍵酶基因的調(diào)控

根據(jù)已推斷出的四環(huán)三萜皂苷類化合物生物合成路徑[62]，人們對其中部分關(guān)鍵酶及其基因進行了深入研究。參與四環(huán)三萜皂苷生物合成路徑的關(guān)鍵酶，總體上可分為上游催化IPP和DMAPP合成的關(guān)鍵酶；中游催化IPP、DMAPP生成和萜類碳環(huán)骨架化合物以及中間體形成的關(guān)鍵酶；下游催化中間體和萜類化合物進行復(fù)雜的結(jié)構(gòu)修飾從而獲得不同四環(huán)三萜皂苷的關(guān)鍵酶。近年來，眾多學(xué)者關(guān)注與研究的熱點仍與四環(huán)三萜皂苷整個生物合成途徑的闡明相關(guān)，特別是關(guān)于三萜碳環(huán)骨架合成及環(huán)上復(fù)雜官能團化等相關(guān)酶基因的鑒定與克隆，了解這些相關(guān)酶及其基因在合成途徑中的作用對四環(huán)三萜皂苷類化合物的代謝調(diào)控及更好發(fā)揮其藥用價值具有深遠(yuǎn)意義。

迄今為止，關(guān)于四環(huán)三萜皂苷類化合物的代謝過程中上游關(guān)鍵酶研究已經(jīng)比較清楚，而中下游關(guān)鍵酶對代謝的影響尚未明確。有研究表明，過量表達SS基因，可促進刺五加（Eleutherococcus senticosus）中三萜皂苷類化合物的大量合成，表明SS基因在絞股藍(lán)皂苷生物合成途徑中具有關(guān)鍵性地位[63]。蔣軍富等利用RTPCR和RACE技術(shù)，對絞股藍(lán)SE基因進行了克隆及序列分析[64]。Han等發(fā)現(xiàn)PgSQE1的表達受阻將導(dǎo)致人參皂苷的產(chǎn)生減少，其參與調(diào)節(jié)人參皂苷的生物合成[65]。Liu等研究2年生人參中PgSS和PgSQE1基因表達水平最高，可間接調(diào)控皂苷合成，PgDS轉(zhuǎn)錄水平與人參皂苷Rg1，Re和Rf顯著相關(guān)，PgSS基因表達與人參皂苷Rb1合成呈負(fù)相關(guān)[66]。Dhar等對催眠睡茄（Withania somnifera）進行分析確定了角鯊烯合酶、角鯊烯環(huán)氧化酶、環(huán)蒿醇合酶、細(xì)胞色素P450還原酶等在其不同發(fā)育階段的代謝產(chǎn)物中的表達模式[67]。缺乏相關(guān)基因的克隆及分析，是了解其生物合成、代謝調(diào)控及限制生物技術(shù)手段干預(yù)合成的主要瓶頸之一。

氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）是調(diào)控代謝流進入四環(huán)三萜皂苷途徑的重要分支位點，而DS是OSC家族成員之一，是合成達瑪烷型人參皂苷的關(guān)鍵靶酶，也是導(dǎo)致三萜產(chǎn)物多樣性的一個重要原因。Luo在研究中表明DS在四年生三七根部高表達，并獲得了參與三萜皂苷合成的候選基因，包括CYP450s和UGTs[68]。此外，在這些關(guān)鍵酶當(dāng)中，值得注意的是P450s和GTs這兩類在植物代謝過程中占據(jù)重要地位的多基因家族，其中P450s可以利用氧氣和NAD（P）H催化三萜骨架羥基化，使其實現(xiàn)區(qū)域?qū)Ｒ恍约傲Ⅲw專一性，是四環(huán)三萜皂苷生物合成路徑中的關(guān)鍵酶[69-73]。Han等在報道中提到，原人參二醇合成酶CYP716A47屬于一個細(xì)胞色素P450單加氧酶，其參與催化達瑪烯二醇II羥基化在C12位產(chǎn)生原人參二醇[74]。目前，對CYP450的晶體結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的蛋白結(jié)合位點并未給出明確的說明，導(dǎo)致有關(guān)四環(huán)三萜皂苷生物合成途徑的下游修飾機制未能完全闡明。

2.1.2 其他調(diào)控因素

研究表明，某些激素，如茉莉酸甲酯（MeJA）等，對四環(huán)三萜皂苷合成代謝中關(guān)鍵酶基因的表達具有調(diào)節(jié)作用[75]。在人參不定根組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中施加一定濃度的MeJA后，促進了人參SS基因的表達[76]。Choi等研究表明SE等三個基因與三萜皂苷合成高度相關(guān)，而MeJA通過誘導(dǎo)SE基因高表達從而提高三萜皂苷合成量[77]。Oktae等利用MeJA處理人參不定根，發(fā)現(xiàn)PgSS、PgSE和DS基因表達水平改變從而對人參皂苷Rb1、Rg1含量造成不同影響[78]。關(guān)于激素對合成代謝的調(diào)控目前尚在研究初始階段，大部分研究集中在少數(shù)幾種激素，然而不同激素對四環(huán)三萜皂苷的生物合成影響需要更進一步研究，并且激素之間的互作也要引起大家的重視。

其他外界刺激如光照、土壤水分、金屬離子、外源物質(zhì)等對藥用植物中四環(huán)三萜皂苷合成的影響也逐漸引起人們重視[79-81]。例如，陽生植物對光照的需求較高，光強較大時三萜皂苷的合成較為旺盛，如絞股藍(lán)在相對光照度為70%左右時絞股藍(lán)總苷量最高[82]。光反應(yīng)產(chǎn)物是次生代謝的必需物質(zhì)，因此光照強度影響植物體三萜皂苷生物合成機理極有可能與光反應(yīng)產(chǎn)物相關(guān)。李佳洲等研究發(fā)現(xiàn)土壤水分含量為0.45W時有利于人參皂苷Rg1的積累，人參皂苷Rb1則在0.70W處理下積累最多[83]，可見土壤不同水分含量下四環(huán)三萜皂苷積累有所差異。此外，有研究表明，金屬鎘（Cd）脅迫誘導(dǎo)內(nèi)源NO的產(chǎn)生，而NO促進SE的表達，抑制DS的表達水平，即抑制了2，3-氧化鯊烯向達瑪烷型三萜皂苷的代謝流[84]。胡向陽等利用殼聚糖處理從而提高人參皂苷合成中皂苷的積累，發(fā)現(xiàn)其SE轉(zhuǎn)錄水平提高[85]。由于研究尚未透徹，需要人們更進一步對于這些因素做出準(zhǔn)確合理的分析。

四環(huán)三萜皂苷類化合物種類較多且合成途徑長而復(fù)雜，這給控制其代謝流的遺傳操作帶來極大挑戰(zhàn)。明確相關(guān)酶基因表達在組織和發(fā)育過程中的調(diào)控機制，對基因時空調(diào)控作用的各種順式和反式作用因子進行研究，從而進一步補充和完善四環(huán)三萜皂苷類化合物生物合成途徑及其網(wǎng)絡(luò)，將為今后實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)四環(huán)三萜皂苷類化合物奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與展望

近年來，藥用植物皂苷在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，市場需求日益增高，這一現(xiàn)狀導(dǎo)致如何提高藥用植物中皂苷含量成為目前研究熱點。在藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中，制約四環(huán)三萜皂苷產(chǎn)量提高的原因是多方面的，但歸根結(jié)底還是由于其生物合成途徑和代謝機制尚未明確、基因工程手段還有待完善。通過對藥用植物四環(huán)三萜皂苷合成途徑的研究，進一步明確其代謝機制，從而推動藥用植物皂苷代謝工程的發(fā)展，促進藥材種植規(guī)范化、品種優(yōu)良化、資源可持續(xù)化的發(fā)展。因此，未來可以從以下幾個方面深入研究。

3.1 藥用植物四環(huán)三萜皂苷類次生代謝物多樣性

藥用植物分布廣泛，而四環(huán)三萜皂苷種類多且生物合成途徑復(fù)雜，導(dǎo)致目前研究較為清楚的仍只是其中的很小一部分，僅鑒定和克隆了少數(shù)基因，對其代謝途徑的整體調(diào)控以及次生代謝途徑之間的協(xié)調(diào)作用等方面依舊存在很多盲區(qū)，而利用系統(tǒng)生物學(xué)方法開展預(yù)見性代謝工程將會拓寬未來的研究領(lǐng)域。

3.2 合成誘導(dǎo)機制多樣性

一種四環(huán)三萜皂苷類化合物的合成可能受幾種因素的誘導(dǎo)，一種因素又可誘導(dǎo)不同類型皂苷的合成積累，同一因素對不同藥用植物的誘導(dǎo)作用也具有差異性，這給藥用植物四環(huán)三萜皂苷在代謝調(diào)控機制方面的研究帶來極大挑戰(zhàn)，使得實際應(yīng)用藥用植物次生代謝調(diào)控生產(chǎn)皂苷類化合物增加了一定難度。探究藥用植物次生代謝的具體路徑及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從不同側(cè)面整合與分析代謝過程及其調(diào)控手段，提高各種調(diào)控之間的聯(lián)合使用，在未來藥用植物研究中具有一定指導(dǎo)意義。

3.3 基因工程手段局限性

某些藥用植物繁殖周期長，在遺傳育種上難度大，不同類型的四環(huán)三萜皂苷合成可能具有單獨的合成途徑和獨特的酶促反應(yīng)機制，導(dǎo)致基因工程手段的實施具有一定的盲目性和局限性，極大影響了研究工作的進程。未來研究中要運用各種代謝調(diào)控手段干擾代謝流，將四環(huán)三萜皂苷的化學(xué)成分研究與基因表達分析充分結(jié)合，不斷將新興技術(shù)融合應(yīng)用到實驗研究中。

雖然對很多藥用植物四環(huán)三萜皂苷生物合成途徑已有了一定的研究，但由于其合成中、下游途徑中的多基因家族酶的結(jié)構(gòu)及類型的復(fù)雜性，大多數(shù)合成具體步驟尚未得到清晰的闡明。隨著對藥用植物四環(huán)三萜皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因調(diào)控研究的深入，闡明其生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因及其協(xié)同性，利用人工手段調(diào)控關(guān)鍵酶基因表達水平，嘗試經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化、發(fā)根培養(yǎng)等一系列工業(yè)化生產(chǎn)去實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)藥用植物皂苷，這將是未來可能實現(xiàn)的一大突破?？梢灶A(yù)見，隨著對藥用植物四環(huán)三萜皂苷合成代謝網(wǎng)絡(luò)的深入全面解析和相關(guān)關(guān)鍵酶基因的克隆，以及現(xiàn)代生物技術(shù)手段的不斷完善推進，藥用植物四環(huán)三萜皂苷代謝工程將更加有效、更好地滿足人類的需求。