GCDH 基因新變異致戊二酸血癥Ⅰ型的遺傳學分析及產前診斷

董興盛 王德剛 李志明 熊怡 滿婷婷

戊二酸血癥Ⅰ型（GAⅠ）是一種常染色體隱 性遺傳的代謝性疾病，由于戊二酰輔酶A 脫氫酶（GCDH）基因缺陷使GCDH 活性降低甚至缺失，導致戊二酸、3- 羥基戊二酸在體內蓄積，引起紋狀體等神經核團損害，導致神經退行性病變［1］。本研究對GAⅠ家系中的先證者進行全外顯子組測序及核心成員突變位點Sanger 測序驗證，經分析確定變異為致病性，通過產前羊水DNA 的GCDH 基因分析及遺傳咨詢，提供優(yōu)生優(yōu)育指導，現報道如下。

對象與方法

一、一個GAⅠ家系先證者的臨床資料收集

收集一個GAⅠ家系先證者的病史和體格檢查資料。本研究經中山市博愛醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（KY-2019-010-37），先證者父母已簽署知情同意書。

二、基因測序分析

1. 先證者外周血基因檢測

采用血液DNA 純化試劑盒（QIAgen，德國）提取先證者及家系核心成員的外周血，具體操作按試劑盒說明書進行。利用Covaris LE220 超聲波儀（Massachusetts，美國）將待測基因組DNA打斷成小片段DNA，進行DNA 文庫構建。利用定制的基因片段捕獲探針（ Roche NimbleGen，Madison，美國）進行外顯子組捕獲，再由高通量測序儀BGISEQ-500（華大基因，中國）完成測序。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。變異位點Sanger 測序驗證：采用 Primer5 軟件設計2對引物，擴增GCDH 基因的2 個位點。引物序列：GCDH-F1 為5′-GGCTAAGTGTAAGGACCTCTGG-3′，GCDH-R1 為5′-CACCTTCGTTGCGATTGG-3′；GCDH-F2 為5′-TGACCGTCTCGCTCATCCC-3′，GCDH-R2 為5′-CCGTTGACTCAGCCCACA-3′。使用PTC-200PCR 儀（Bio-Rad，美國）進行PCR，反應條件為96 ℃預變性5 min，96 ℃變性20 s，59.8/58.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38 個循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物通過ABI3730 全自動測序儀（美國，ABI 公司）進行正反雙向測序。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）發(fā)布的遺傳變異分類標準與指南對篩選出來的變異進行遺傳致病性分析［2］。

2. 產前診斷

對先證者孕18 周母親行羊膜穿刺術抽取羊水，用前述方法提取胎兒羊水DNA，并使用Sanger 測序方法對胎兒行GCDH 基因測序分析。排除母體污染標準：胎兒各位點等位基因熒光峰分別來自父母，胎兒各位點無來自母親的第2 個熒光檢測峰。

三、文獻檢索

選擇“戊二酸血癥Ⅰ型/ Glutarate disease typeⅠ”“ GCDH”及“ 產前診斷/ Prenatal diagnosis”為檢索詞，對以下數據庫截至 2022 年6 月收錄的論文進行檢索：PubMed、CNKI、萬方數據知識服務平臺、維普中文科技期刊數據庫，收集并分析檢索到的GAⅠ產前診斷文獻資料。

結 果

一、一個GAⅠ家系先證者的臨床資料

本研究家系來自中國福建省。2021 年3 月，先證者母親孕17 周，攜先證者來本院產前診斷中心就診咨詢，其孕期常規(guī)產檢結果均正常，尋求遺傳學咨詢以避免再次生育患病后代?；純海ㄏ茸C者）女，1 歲7 個月。6 月齡時，不能抬頭，可以翻身，可以抓物。7 月齡時，運動發(fā)育倒退，不能翻身，不能抓物。8 月齡時，尿有機酸分析提示戊二酸升高（66.8 μmol/L，參考值范圍0.5～5.9 μmol/L）；血?；鈮A譜檢測提示戊二酰肉堿升高（0.75 μmol/L，參考值范圍0.05～0.40 μmol/L），游離肉堿降低（5.65 μmol/ L，參考值范圍10.00～58.00 μmol/L）；頭顱MRI 發(fā)現雙側額顳葉腦白質低髓鞘化，雙側豆狀核（蒼白球為主）對稱性異常增高信號?，F先證者19 月齡，不會叫“爸、媽”，抬頭不穩(wěn)，不能翻身，不能獨坐，不能爬行，不能站立，不能抓物。先證者雙親均體健，否認近親結婚，否認遺傳病家族史。先證者體格檢查：體質量9.5 kg，身高77 cm，頭圍47 cm。頸軟無抵抗，豎頭不穩(wěn)。心、肺聽診無異常，腹平軟，肝、脾不大，四肢肌張力稍低。

二、先證者的全外顯子組測序結果

家系中的先證者通過全外顯子組測序，檢測到GCDH（NM_000159.3）基因位于4 號外顯子的雜合變異c.206_207delAC（p.Thr70Leufs*117）和位于9 號外顯子的雜合變異c.892G>A（p.Ala298Thr）。見表1。

表1 先證者全外顯子組測序結果

三、家系核心成員Sanger 測序驗證結果

先證者基因Sanger 測序結果和全外顯子組測序結果一致。先證者父親檢出GCDH：c.206_207delAC（p.Thr70Leufs*117）雜合變異；先證者母親檢出GCDH：c.892G>A（p.Ala298Thr）雜合變異。見圖1。

圖1 先證者及其父母的 GCDH 基因測序結果

四、致病性分析

先證者檢出GCDH 基因的2 個復合雜合變異（分別遺傳自父親、母親）：①GCDH 基因（NM_000159.3）c.206_207delAC，第4 號外顯子區(qū)的第206～207 位堿基GA 缺失，導致其蛋白質第70 位的蘇氨酸變成亮氨酸，并產生移碼突變，翻譯117 個氨基酸后終止（p.Thr70Leufs*117）。該變異在gnomAD、ExAC 及1000G 數據庫中未見收錄。該移碼預測可引起轉錄子降解，可使用PSV1 證據。根據2015 年ACMG 發(fā)布的序列變異解讀指南，變異證據包括PM2、PSV1、PP4，該變異判讀為致病變異。②GCDH 基因（NM_000159.3）c.892G>A，位于第9 號外顯子的錯義變異，導致蛋白質翻譯在第298 位的丙氨酸變成蘇氨酸。該變異在gnomAD數據庫中東亞人群中等位基因頻率為0.0001，屬于隱性遺傳病中極低頻位點。根據2015 年ACMG發(fā)布的序列變異解讀指南，變異證據包括PM1、PM2、PM3-strong 及PP4-moderate，該變異判讀為致病變異。見表2。

表2 GCDH 基因c.206_207delAC 及c.892G>A 變異致病性分析

五、產前診斷結果

針對GCDH 基因的2 個位點進行Sanger 測序，胎兒羊水DNA 未測出母體細胞污染，產前診斷結果為胎兒的GCDH 基因變異的復合雜合變異c.206_207delAC 和c.892G>A，見圖2。經遺傳咨詢，胎兒父母要求終止妊娠。

圖2 家系圖及胎兒GCDH 基因測序結果

六、文獻檢索結果

文獻檢索收集到GCDH 基因測序分析產前診斷GAⅠ的文獻5 篇，包括9 例GAⅠ家系。其中4例家系中5 例胎兒通過GCDH 基因測序分析診斷為GAⅠ， 4 例GAⅠ胎兒家屬選擇終止妊娠，僅有1例胎兒家屬要求繼續(xù)妊娠并足月分娩。見表3。

表3 GAⅠ產前診斷的文獻資料總結

討 論

GAⅠ是一種因GCDH 基因變異導致的罕見常染色體隱性遺傳的代謝性疾病。該病在全球發(fā)病率約為1∶110 000［8-9］。GCDH 基因定位于染色體19p13.2，約7 kb，包含11 個外顯子，編碼438 個氨基酸組成的前體蛋白，其中N 端44 個氨基酸是線粒體定位信號，在進入線粒體后被切除［5］。4 個單體構成的同源四聚體即GCDH，是一種同源四聚體黃素蛋白，屬于?；鵆oA 脫氫酶家族，負責催化戊二酰CoA 脫氫和脫羧成為巴豆酰輔酶A 和CO2［10］。GCDH 單體的二級結構分成3 個結構域：N端α-螺旋（R 45 ～ Q 167）、C 端α-螺旋（ S 282 ～K 438）及中間的β-片層（L168 ～S 281），C 端ɑ-螺旋結構域是主要的催化活性中心［7］。GCDH 基因發(fā)生變異時，酶的正常結構受到影響，導致戊二酸和3-羥基戊二酸在體內蓄積。戊二酸和3-羥基戊二酸與興奮性精神遞質谷氨酸結構相似，導致谷氨酸受體過度激活，抑制γ-氨基丁酸（GABA）的合成，使抑制性神經遞質減少，從而對神經元造成損傷［11］。目前人類基因組突變數據庫（HGMD）已報道人類GCDH 基因致病變異290 種，其中錯義突變是最常見的類型。不同的種族群體存在不同的GCDH 基因變異熱點，c.1244-2A>C是中國人群中較為常見的熱點變異，c.1296C>T在美國人群較為常見，c.1204C > T 在歐洲人群中最為常見，c.914C>T 在日本人群中的攜帶率高達12.1%［12-17］。

本例家系患者檢出了GCDH 基因的c.206_207delAC（p.Thr70Leufs*117）及c.892G>A（p.Ala298Thr）變異。其中c.206_207delAC 變異為首次報道，在GCDH 基因c.206_207 位置的缺失導致移碼，GCDH 蛋白第70 位的蘇氨酸變成亮氨酸，之后翻譯117 個氨基酸即終止（p.Thr70Leufs*117）。該移碼突變導致編碼肽鏈減少251 個氨基酸殘基，形成截斷蛋白。有研究顯示，GCDH 基因的移碼突變可導致基因功能喪失，GCDH 活性完全缺失的GAⅠ患者出現更嚴重的表型［18］。c.892G>A 變異是已有文獻報道的已知變異，在多例GAⅠ患者中觀察到了這種變異［19-22］。該位點在不同物種中高度保守，位于GCDH 蛋白單體的C 端α-螺旋結構域。該結構域是GCDH 主要的催化活性中心，變異會影響該酶的催化活性。Christensen 等［20］發(fā)現c.892G>A 變異純合子的GAⅠ患者的成纖維細胞中GCDH 活性明顯降低，僅為正?；钚缘?%～10%。

GAⅠ的臨床表現多樣，患兒常于6～18 月齡時發(fā)病，主要的臨床特征為大頭畸形、肌張力異常、進行性運動障礙等，這是由于GCDH 活性降低或缺失導致戊二酸、3 -羥-戊二酸、戊烯二酸及戊二酰肉堿等有機酸在體內升高［23］。由于患者的表型譜變異度大，即使具有相同基因型的家系患者之間的表型可能有很大差異。大頭畸形是GAⅠ的一個主要臨床特征，也是70%GAⅠ患兒在新生兒期出現的第一個體征，所以對于大頭畸形的新生兒應注意排除GAⅠ［24］。本例先證者新生兒期頭圍正常，故未行GAⅠ相關的篩查和基因診斷。根據ACMG 指南，GAⅠ的診斷必須基于GCDH 活性降低和（或）檢測出2 個GCDH 等位基因的致病變異［9］。先證者的GCDH 基因結果符合診斷，臨床表現與GAⅠ一致，如肌張力減退、運動發(fā)育遲緩、體液中戊二酸和戊二酰肉堿濃度升高、頭顱MRI提示腦白質和蒼白球的改變。結合GCDH 基因的結果和臨床表現，先證者確診GAⅠ。

GAⅠ可通過檢測羊水中戊二酸水平或羊膜細胞中戊二酰輔酶A 脫氫酶的活性進行產前診斷，但臨床存在戊二酸鹽排泄正常和有顯著殘留活性的GAⅠ患者，因此僅依靠生化指標難以得到精確的產前診斷結果［3］。2000 年Busquets 等［3］首次通過GCDH 基因測序分析在產前診斷GAⅠ。本研究總結了通過GCDH 基因測序分析進行GAⅠ產前診斷的文獻，5 例胎兒通過GCDH 基因測序分析產前診斷為GAⅠ，其中4 例胎兒父母選擇終止妊娠；僅有1 例胎兒家屬要求繼續(xù)妊娠，該例孕晚期時胎兒超聲檢查結果顯示大頭畸形、額顳葉萎縮和大腦外側裂增寬，足月剖宮產分娩，出生后接受谷氨酸特殊配方奶粉治療，由兒科內分泌科醫(yī)師定期監(jiān)測隨訪［4］。本研究的先證者母親再生育時，也通過GCDH 基因測序分析進行產前診斷，結果明確胎兒為GCDH 基因的復合雜合變異（c.206_207delAC 和c.892G>A），診斷胎兒罹患GAⅠ。妊娠20 周時胎兒超聲檢查未見明顯異常。經遺傳咨詢，胎兒父母要求終止妊娠，妊娠22 周引產。家屬拒絕進行尸檢，故未對引產胎兒進行尸檢。

綜上所述，分子遺傳學檢測是GAⅠ的有效確診方法。本研究報道1 例GAⅠ家系中GCDH 基因復合雜合變異，并發(fā)現1 個新的移碼突變，豐富了HGMD，有助于更好地了解該疾病的分子病理學，并為該家系的遺傳咨詢及產前診斷提供了遺傳學依據，從而有效地避免該家系再次生育缺陷兒。