HBV 相關(guān)中和抗體在慢性乙型肝炎抗病毒治療中的研究進(jìn)展

趙宇迪 黃明星

乙型肝炎（乙肝）是全球主要的公共衛(wèi)生威脅。WHO 在2021 年發(fā)布的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，截至2019 年在全球范圍內(nèi)有超過(guò)2.95 億人患有慢性乙肝（慢乙肝），每年有超過(guò)82.1 萬(wàn)人死于HBV 感染或乙肝相關(guān)并發(fā)癥［1］。在未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)性治療的情況下，8%～20%的患者在5 年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，其中20%的患者為失代償期，兩者的5 年內(nèi)病死率分別為15%和> 60%，對(duì)患者的生命健康安全造成了嚴(yán)重威脅［2］。現(xiàn)階段乙肝抗病毒藥物的治療已經(jīng)可以達(dá)到長(zhǎng)期抑制HBV DNA 復(fù)制水平的目標(biāo)，但是對(duì)于大部分HBeAg 陽(yáng)性的患者，仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)HBeAg 的完全清除［3］。人體自身的免疫系統(tǒng)可以通過(guò)Fc 介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用和吞噬細(xì)胞的吞噬作用清除被感染的肝細(xì)胞，而通過(guò)體外合成特異性和中和活性強(qiáng)的中和抗體可以有效地模擬這一進(jìn)程，從而有效降低病毒表面抗原載量［4-5］。本文就中和抗體在慢乙肝中的治療現(xiàn)狀及新藥物研發(fā)的進(jìn)展進(jìn)行一一綜述，以探究中和抗體未來(lái)可能的發(fā)展方向及應(yīng)用前景。

一、目前慢乙肝的主要治療方法以及存在的挑戰(zhàn)

目前慢乙肝的一線治療用藥包括聚乙二醇干擾素（Peg-IFN）和核苷類似物（NAs）。這兩類藥物雖然是針對(duì)HBV 的一線用藥，但是其對(duì)HBV 持續(xù)復(fù)制的源泉——模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）微小染色體庫(kù)作用有限［6］。盡管IFN 可在一定程度上清除cccDNA，但極少量的cccDNA也會(huì)導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)［7］。雖然現(xiàn)階段已有研究機(jī)構(gòu)針對(duì)cccDNA 進(jìn)行研究，例如直接靶向cccDNA 的CRISPR 或其他基因編輯方法在實(shí)驗(yàn)室研究中就已展現(xiàn)出潛力［8］。此外近年研究表明，通過(guò)耗竭cccDNA 池實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的病毒學(xué)治愈也成為一個(gè)可能的方向［9］。但就目前而言，針對(duì)cccDNA 的藥物依舊處于研究階段，慢乙肝的“完全性治愈”依舊難以實(shí)現(xiàn)，在這種情況下，“功能性治愈”成為慢乙肝治療的階段性目標(biāo)。

“功能性治愈”是指感染者體內(nèi)的病毒被完全抑制，機(jī)體免疫功能正常，即使不接受治療，用常規(guī)方法也難以在患者體內(nèi)檢出病毒［10］。在美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)-歐洲肝病學(xué)會(huì)關(guān)于慢乙肝治療終點(diǎn)的研討會(huì)上，學(xué)者們將慢乙肝的“完全性治愈”定義為患者血清中檢測(cè)不到HBsAg，并根除HBV DNA，包括肝內(nèi)cccDNA 和整合在宿主染色體上的HBV DNA［11］。同時(shí)，研究表明在一部分病例中，幾乎所有被HBV 感染的肝細(xì)胞都被CD8+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所殺滅，這表明HBV 不需要完全根除，通過(guò)擴(kuò)大和調(diào)控免疫反應(yīng)可阻止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)功能性治愈，這成為慢乙肝免疫治療的新方案［12］。

目前新的治療方法如中和抗體、小干擾RNA療法、HBV 核心抑制劑、HBV 衣殼抑制劑、治療性HBV 疫苗等免疫療法相繼進(jìn)入研究者視野［13-14］。其中，中和抗體特異性結(jié)合HBsAg 阻止HBV 對(duì)機(jī)體的感染。有研究表明，使用中和抗體可減少肝臟和循環(huán)中的病毒抗原載量，恢復(fù)后天免疫系統(tǒng)功能［15］。

二、HBV 相關(guān)中和抗體

多克隆抗體如乙肝Ig（HBIG）因其成本高、比活性低、可能傳播血源性疾病等原因，不宜長(zhǎng)期應(yīng)用于治療。相對(duì)而言，單克隆抗體HBV 相關(guān)中和抗體的價(jià)格更加低廉、特異性更高、中和活性更強(qiáng)，是當(dāng)前更具價(jià)值的慢乙肝抗病毒免疫治療方案。

1.單克隆抗體的作用靶點(diǎn)

在HBV 感染的進(jìn)程中，功能性受體牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP）和硫酸肝素蛋白聚糖（HPSG）在HBV 感染侵襲細(xì)胞中起著相當(dāng)重要的作用。而HBV 和這兩個(gè)作用靶點(diǎn)的結(jié)合又和HBV表面的S 蛋白和L 蛋白息息相關(guān)。S 蛋白主要的抗原決定簇為S 域內(nèi)的aa99-169，其中一簇構(gòu)象表位的α 決定簇（aa124-147）可被天然HBV 感染或接種疫苗產(chǎn)生的抗體識(shí)別，介導(dǎo)抗體對(duì)病毒的中和作用。L 蛋白（前S1 區(qū)+前S2 + S 結(jié)構(gòu)域）定位于傳染性HBV 顆粒，并與病毒的形成和傳播息息相關(guān)。根據(jù)與病毒蛋白結(jié)合位點(diǎn)的不同可以進(jìn)一步將單克隆抗體分為2 類，一類是針對(duì)S 蛋白上α結(jié)構(gòu)域的抗體，而另一類是針對(duì)L 蛋白上前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗體。

2.靶向α 結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體

在接種疫苗或者感染HBV 后，人體自身會(huì)產(chǎn)生抗體，這種抗體的靶點(diǎn)就是α 結(jié)構(gòu)域，經(jīng)FDA認(rèn)證的疫苗基本為靶向α 結(jié)構(gòu)域，在一項(xiàng)疫苗接種和自然轉(zhuǎn)陰志愿者的研究中，HBV 疫苗可以被S 蛋白完全阻斷，結(jié)果表明在這兩類人群中，由機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體主要是靶向α 結(jié)構(gòu)域［5］。

Cerino 等［16］和Wang 等［17］分別使用抗體提純和噬菌體文庫(kù)重組法提取出較強(qiáng)活性的ADRI-2F3 和G12 中和抗體，并在早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了相當(dāng)不錯(cuò)的成績(jī)，但是這2 種抗體在抗原識(shí)別表位上都表現(xiàn)出單一性。隨著研究的進(jìn)展，二者在高水平病毒載量的小鼠中降低病毒表面抗原濃度的能力表現(xiàn)出明顯的不足，甚至出現(xiàn)了免疫逃逸毒株。說(shuō)明抗體識(shí)別表位的單一可能會(huì)與免疫逃逸有所關(guān)聯(lián)，如何解決免疫逃逸的難題是這些單一表位識(shí)別的中和抗體必須克服的問(wèn)題。

對(duì)于上述問(wèn)題，Hehle 等［4］和Wang 等［15］各自提出了解決方案。Hehle 等［4］從疫苗接種者和高血清抗體病毒攜帶者的外周血B 淋巴細(xì)胞中，通過(guò)單細(xì)胞流式細(xì)胞分選技術(shù)獲得S-HBsAg 結(jié)合的IgG+記憶性B 淋巴細(xì)胞，再將其重組表達(dá)克隆制備和篩選獲得了強(qiáng)有力的交叉中和抗體 Bc1.187。大多數(shù)已知的“α”決定簇的表位包括一個(gè)主要區(qū)域，跨越半胱氨酸138～147，被 Bc1.187 識(shí)別，從而減少逃逸的發(fā)生。Wang 等［15］則是通過(guò)對(duì)159 名志愿者的血清進(jìn)行 ELISA 篩選出20 種有高中和活性的抗體，再進(jìn)一步通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 分成了3 類相互排斥的克隆抗體，表明 HBsAg 上至少存在3個(gè)顯性非重疊抗原位點(diǎn)。其后的研究通過(guò)對(duì)常見(jiàn)的44 種免疫逃逸毒株的丙氨酸分析，得到了H017和H019 這2 種具有最大的廣度和互補(bǔ)性的抗體，其聯(lián)合應(yīng)用相比于單一應(yīng)用能有效避免免疫逃逸。結(jié)果表明，抗HBs bNAb 單一治療確實(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫逃逸突變的出現(xiàn)，而基于不同識(shí)別位點(diǎn)的H017 和H019 治療的小鼠則沒(méi)有出現(xiàn)免疫逃逸，這也說(shuō)明了識(shí)別不同位點(diǎn)的抗體聯(lián)合治療應(yīng)用可以有效避免免疫逃逸的發(fā)生。

3. 靶向前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗體

與人體中普遍存在的抗HBsAg α 結(jié)構(gòu)域不同，前S1 區(qū)主要存在于成熟感染性 HBV 中，因此其水平遠(yuǎn)低于HBsAg［17］。此外，前 S1 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)病毒與肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞受體的相互作用，在 HBV 病毒顆粒的組裝和釋放中起重要作用。另有研究顯示，慢乙肝患者表現(xiàn)出較少的 HBV 大面積抗原 preS1結(jié)構(gòu)域的免疫耐受，這說(shuō)明抗S1 蛋白的抗體可能在免疫耐受及避免誘導(dǎo)免疫逃逸方面有其優(yōu)勢(shì)之處，使其成為除抗HBsAg 以外的HBV 治療潛在新靶點(diǎn)［18］。

在一項(xiàng)關(guān)于前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域?yàn)橹委煱悬c(diǎn)的治療性疫苗研究中，前S1 多肽在HBV 攜帶小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)大的免疫應(yīng)答［18］?？骨癝1 蛋白在體內(nèi)快速清除 HBV 顆粒，在體外阻斷 HBV 感染肝細(xì)胞；接種前 S1 多肽的小鼠甚至HBsAg 耐受性降低；隨后連續(xù)予HBV 攜帶小鼠注射抗原特異性前S1 多肽和HBsAg 疫苗，最終誘導(dǎo)HBsAg 的血清學(xué)轉(zhuǎn)化，清除慢性HBV 感染。這些結(jié)果提示以前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的治療性疫苗可以用于慢乙肝的控制，并且在免疫耐受方面擁有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)之處。

而除治療性疫苗之外，以前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的抗體研究同樣正在火熱進(jìn)行中，并且這種抗體表現(xiàn)出與前者同樣的特性。Zhang 等［19］采用組合方法篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，在黑猩猩體內(nèi)篩選出一個(gè)中和抗體表位，該抗體BX-182 對(duì)黑猩猩具有亞型特異性保護(hù)作用。BX-182 呈亞型特異性，能夠阻斷HBV adw 亞型的傳染性，但不能阻斷ayw 亞型在黑猩猩中的傳染性，這種亞型特異性可能和抗體識(shí)別的基因表位有關(guān)。雖然研究?jī)H局限于動(dòng)物本身，并且有亞型特異性，這種人工合成的、針對(duì)黑猩猩的抗體在人體內(nèi)是否具有效果仍有待驗(yàn)證，但是基于前S1 區(qū)的抗體已經(jīng)初步顯示了可行性。而在其后，Chi 等［20］對(duì)小鼠源性的HzKR127 Fab 中的所有互補(bǔ)性決定區(qū)殘基進(jìn)行了全面的丙氨酸掃描突變。進(jìn)一步揭示了主要結(jié)合決定子在抗原結(jié)合中的特異性作用，有助于抗體最大限度進(jìn)行人源化和親和力成熟的合理設(shè)計(jì)。這種抗體有著較強(qiáng)的親和力，但是改造尚未成熟，仍需進(jìn)一步探討結(jié)構(gòu)和處理。

近年，Li 等［21］利用一個(gè)大型的非免疫噬菌體展示人抗體庫(kù)鑒定了一組特異性針對(duì)前S1 區(qū)結(jié)構(gòu)域的中和性抗體，最終確定了6 種中和性抗體。這些單克隆抗體的中和效力與其抗原決定簇的位置和前S1 受體結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，其中一種主要的中和性抗體2H5，對(duì)HBV 和丁型肝炎病毒均表現(xiàn)出很強(qiáng)的中和能力。再通過(guò)進(jìn)一步對(duì)2H5 進(jìn)行改造，篩選出中和活性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性高的2H5A-14。在后續(xù)的研究中，這種抗體表現(xiàn)出200 倍強(qiáng)于Kr127的特性，并且對(duì)HBV 的三大流行基因型B、C、D和95%的基因型有免疫作用，還可以通過(guò)自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用。在免疫逃逸方面，以Phe23 為核心的保守序列作為靶點(diǎn)，不易產(chǎn)生免疫逃逸。

三、展 望

目前有關(guān)HBV 相關(guān)中和抗體的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，但是對(duì)于免疫活性的研究已經(jīng)初具成效，但是，如何避免免疫耐受仍舊是一個(gè)抗體研發(fā)過(guò)程中需要克服的困難。在目前的抗體研究中，Hehle 等［4］、Wang 等［15］及Li 等［21］均提出了解決方案。另有研究表明，針對(duì)特異位點(diǎn)的抗體可以在一定程度上避免免疫逃逸突變［22］。在關(guān)于前S1 蛋白結(jié)構(gòu)域的研究中，氨基酸位點(diǎn)1（aa8-16）針對(duì)大多數(shù)亞型有較高的親和力，N 端高度保守（除了D）和位點(diǎn)3（aa35-41）僅針對(duì)某一種亞型C 端增強(qiáng)效力［23］。基于抗原特異性存儲(chǔ)器B 細(xì)胞分選的方法可快速產(chǎn)生大量的功能單克隆抗體，這對(duì)針對(duì)特異靶點(diǎn)進(jìn)行定向的抗體改造很有意義。此外，部分中和抗體可能會(huì)通過(guò)Fc 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［21］。對(duì)于中和抗體的研究仍存在一些難題，例如部分中和抗體及其所介導(dǎo)的補(bǔ)體免疫反應(yīng)尚不明確，目前的研究大部分還局限于動(dòng)物中，一些人工合成的抗體在人體內(nèi)的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。2021 年歐洲肝病學(xué)會(huì)年會(huì)報(bào)告，中和抗體治療乙肝患者取得成功，為乙肝患者帶來(lái)了“功能性治愈”的曙光［23］。中和抗體與富馬酸替諾福韋二吡呋酯聯(lián)用的療效在高病毒載量的HBV攜帶小鼠上也得到了肯定［24］。HBsAg 的降低可以增強(qiáng)疫苗對(duì)病毒的抵抗能力。中和抗體可以明顯地減少抗原高負(fù)荷以減低患者免疫系統(tǒng)的負(fù)荷，減緩患者CD8+T 淋巴細(xì)胞的耗竭，有效延緩患者的進(jìn)程，最終達(dá)到功能性治愈的終點(diǎn)——HBsAg的完全清除［25］。綜上所述，HBV 相關(guān)中和抗體在功能性治愈的免疫療法中表現(xiàn)出相當(dāng)不錯(cuò)的潛力，將會(huì)成為乙肝患者治療的一項(xiàng)新選擇。