阿霉素誘導(dǎo)心肌病小鼠模型的構(gòu)建

張慶領(lǐng)，張?jiān)迄i，周贊東，張 躍，劉 彤

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科，天津市心血管病離子與分子機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津心臟病學(xué)研究所，天津 300211

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，全球癌癥患者生存率顯著提高［1］。美國的癌癥患者平均5年生存率是66%［2］；國家癌癥中心2022年數(shù)據(jù)顯示，中國過去10余年惡性腫瘤生存率呈逐漸上升趨勢，目前中國惡性腫瘤患者的5年相對生存率約為40.5%［3］。然而，在腫瘤幸存者中心血管疾病的發(fā)生率和死亡率僅次于腫瘤復(fù)發(fā)，乳腺癌患者10年后因心臟疾病所致死亡的風(fēng)險(xiǎn)已超過腫瘤本身［4］；兒童腫瘤患者治療后，其因心臟病死亡發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為正常人的8倍［5］；青年腫瘤幸存者心血管發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加20倍［6］。因此，如何降低腫瘤治療伴隨的心臟毒性是臨床實(shí)踐中亟待解決、備受關(guān)注的關(guān)鍵問題之一。

在現(xiàn)行諸多腫瘤化療方案中，阿霉素（adriamycin）又稱多柔比星（doxorubicin），是臨床較常用的化療藥物之一［7-10］。阿霉素是從波賽鏈真菌變種鏈真菌發(fā)酵液中提取的一種糖苷類抗生素，既可抑制RNA合成，也可阻止DNA復(fù)制，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物［11］，在臨床上廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療［12］。藥物代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿霉素細(xì)胞毒性主要與“血藥濃度-時(shí)間”曲線下面積相關(guān)，但其急性心臟毒性主要與峰濃度相關(guān)［13］。由阿霉素毒性引起的心肌損傷，即阿霉素誘導(dǎo)的心肌病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和幸存時(shí)間。阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的發(fā)病機(jī)制及治療策略是研究者關(guān)注的主要方向，然而已發(fā)表的文獻(xiàn)對阿霉素誘導(dǎo)的心肌病模型構(gòu)建的給藥累積劑量、給藥頻次、造模周期各不相同，目前國際上尚無公認(rèn)、統(tǒng)一、穩(wěn)健的阿霉素誘導(dǎo)的心肌病模型構(gòu)建方法。本研究通過臨床患者常用阿霉素化療方案用藥累積劑量等量換算為小鼠用藥劑量，設(shè)置相同累積劑量下不同給藥周期，研究比較各組小鼠一般情況、血流動力學(xué)、心電生理檢查、超聲心動圖、心肌組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)的病理生理學(xué)改變；綜合分析選擇最佳阿霉素誘導(dǎo)的心肌病小鼠模型，為未來研究阿霉素誘導(dǎo)的心肌病發(fā)病機(jī)制及干預(yù)策略、提高動物福利、減少實(shí)驗(yàn)成本等提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型構(gòu)建分組

40只8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在（23±2）℃，自然光暗周期為12 h/12 h，鼠籠墊料隔天更換1次。

根據(jù)歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會（European Society for Medical Oncology，ESMO）指南［14］推薦，蒽環(huán)類藥物的最大累積劑量限制為450 ～ 550 mg/ m2，本研究按推薦的最大累積劑量取550 mg/m2；根據(jù)體表面積（body surface area，BSA）公式計(jì)算成年人（60 kg/170 cm）體表面積。通過計(jì)算得出最大累積劑量為15.125 mg/kg。因此，我們在后面文章中使用了最大累積劑量為15 mg/kg進(jìn)行造模。

實(shí)驗(yàn)動物分別編號并隨機(jī)分組，分為4組：①對照組（Control,CON），為等劑量生理鹽水腹腔注射（n=10）；② 阿霉素（D107159，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）模型組1（model 1，M1），單次給藥15 mg/kg腹腔注射，總劑量為15 mg/kg（n=10）［15］；③阿霉素模型組2（model 2，M2），單次5 mg/kg腹腔注射，連續(xù)3d給藥，總劑量為15 mg/kg（n=10）；④ 模型組3（model 3，M3），單次7.5 mg/kg腹腔注射，隔天給藥，共2次，總劑量為15 mg/kg（n=10）［16］；所有模型組動物均于最后1次給藥1周后處死。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意，實(shí)驗(yàn)操作符合3R原則。

1.2 小鼠一般情況觀察

造模前分別進(jìn)行小鼠基線體重測量。造模后每天測量小鼠體重；同時(shí)觀察小鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、毛發(fā)、日?；顒忧闆r、排便情況，同時(shí)記錄各組小鼠存活情況。

1.3 小鼠超聲心動圖

留取小鼠胸骨旁左心室長軸、短軸切面B型和M型模式標(biāo)準(zhǔn)圖像，測量室間隔厚度、左心室后壁厚度、左心室收縮末期直徑及左心室舒張末直徑。左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）由M型超聲圖像測量得出。

1.4 電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)

5%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉滿意后，連接小鼠肢體導(dǎo)聯(lián)，描記體表心電圖。之后給予氣管插管，小動物呼吸機(jī)輔助呼吸；經(jīng)胸骨正中切口小心快速開胸，充分暴露心臟，使用EMapScope 3.0操作系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，將多電極陣列標(biāo)測系統(tǒng)置于右心室外膜進(jìn)行右室傳導(dǎo)電標(biāo)測描記。同樣的方法進(jìn)行左心室電生理標(biāo)測。通過分析體表心電圖及Mapping數(shù)據(jù)評估阿霉素對心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響。

1.5 組織學(xué)

取小鼠心臟組織，用4%中性甲醛溶液固定，用石蠟包埋24 h。然后將包埋的組織切成5 μm切片。切片用H-E染色，光鏡檢查。通過H-E染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，評估阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷情況。通過Masson染色觀察心肌膠原纖維。經(jīng)過核染、漿染、分色、復(fù)染等步驟，心肌組織中纖維成分被染為藍(lán)色，正常的心肌組織為紅色。通過計(jì)算膠原纖維分?jǐn)?shù)［藍(lán)色面積/（藍(lán)色面積 +紅色面積）×100%］評估心肌纖維化程度。H-E染色和Masson染色均為每張玻片取40倍物鏡視野下隨機(jī)拍攝5張照片。應(yīng)用Image J處理圖像，分別計(jì)算每個視野下膠原纖維分?jǐn)?shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測

采用ELISA 法檢測血清心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、N 末端 B 型利鈉肽原（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NT-proBNP）。所有小鼠于最后1次阿霉素給藥1周后進(jìn)行心臟取血。應(yīng)用肝素抗凝，經(jīng)高速離心機(jī)10000 r/min，在4 ℃下離心5 min。分離上清液150 ～ 300 μL存儲于-80 ℃深低溫冰箱。于24 h內(nèi)應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的心臟標(biāo)志物NT-proBNP、cTnI水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Fiji軟件處理圖像，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8軟件制作統(tǒng)計(jì)圖表。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用Bonferroni校正后的單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于小鼠阿霉素誘導(dǎo)的心肌病造模方式的總結(jié)

我們在“Web of Science 核心合集”數(shù)據(jù)庫中分別使用檢索式1“adriamycin（主題）AND cardiotoxicity（主題）AND 2018—2022（出版年）”和檢索式2“doxorubicin（主題）AND cardiotoxicity（主題）AND 2018—2022（出版年）”檢索最近5年數(shù)據(jù)資料，共檢索有關(guān)阿霉素（多柔比星）心臟毒性的研究2732篇（其中檢索1包含228篇，檢索式2包含2504篇）文章。排除綜述類文章446篇（檢索式1包含39篇，檢索式2包含407篇）。在剩余的2286篇中，我們篩選高被引用文獻(xiàn)20篇納入統(tǒng)計(jì)。排除非小鼠模型7篇，最終納入13篇文獻(xiàn)（表1）。

表1 阿霉素小鼠模型造?？偨Y(jié)Tab.1 Summary of doxorubicin mouse model in document literature

2.2 一般情況改變

實(shí)驗(yàn)分組如圖1A所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的終體重占基線體重的百分率評價(jià)阿霉素對小鼠體重的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較CON（105.96%±0.92%），M1組（84.36%±5.40%）、M2組（92.58%± 2.26%）和M3組（85.25%±2.17%）體重顯著下降（圖1B）。給予阿霉素后，小鼠一般情況惡化，包括進(jìn)食差，精神狀態(tài)欠佳、萎靡，活動強(qiáng)度減弱，逐漸出現(xiàn)死亡動物等。M1、M2在給藥后第3天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至造模結(jié)束時(shí)，M1小鼠死亡率為60%，M2死亡率為50%，M3死亡率為20%（圖1C）。

圖1 小鼠一般情況監(jiān)測Fig.1 Mice general condition monitoring

2.3 心電生理改變

各組間體表心電圖描記見圖2 A。相較于CON、M1和M2，體表心電圖檢測結(jié)果顯示，M3的PR間期［（0.0642±0.0038）svs（0.0423±0.0009）s、（0.0527±0.0079）s、（0.0620±0.0012）s，P均＜0.05，圖2B和表2］、QT間期［（0.0475±0.0002）svs（0.0220±0.0009）s、（0.0386±0.0044）s、（0.0444±0.0030）s，P均＜0.05，圖2C］及QTc間期［（0.6377±0.0042）svs（0.1485±0.0086）s、（0.1522±0.0076）s、（0.1433±0.0117）s］時(shí)限顯著延長（表2）；P波時(shí)限［（0.0153±0.0012）svs（0.0140±0.0013）s、（0.0120±0.0007）s、（0.0121±0.0003）s，P均＞0.1］、Q R S 時(shí)限［（0.0103±0.0006）sv s（0.0112±0.0010）s、（0.0105±0.0008）s、（0.0105±0.0001）s，P均＞0.1］、R R 間期［（0.1648±0.0175）sv s（0.1485±0.0086）s、（0.1522±0.0076）s、（0.1433±0.0117）s，P均＞0.1，表2］ 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組小鼠體表心電圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Electrocardiogram and statistical results of each group

表2 各組小鼠心臟超聲和體表心電圖參數(shù)比較Tab.2 Comparison of echocardiography and electrocardiogram parameters in each group

續(xù)表2 各組小鼠心臟超聲和體表心電圖參數(shù)比較

在體心外膜電傳導(dǎo)（mapping）結(jié)果如圖所示（圖3 A）。與C O N 相比，模型組傳導(dǎo)速度顯著下降［（0.89±0.12）mm/msvs（0.59±0.05）mm/ms、（0.28±0.07）mm/ms、（0.55±0.10）mm/ms，P均＜0.05，圖3B］，傳導(dǎo)異質(zhì)性增加［（2.01±0.16）ms/mmvs（4.43±0.35）ms/mm、（3.99±0.20）ms/mm、（3.29±0.22）ms/mm，P均＜0.05，圖3C］；異質(zhì)性指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D）。

圖3 各組小鼠心室心外膜電傳導(dǎo)圖像和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Ventricular epicardial electrical conduction images and statistical results of mice in each group

2.4 心功能改變

各組小鼠超聲心動圖結(jié)果見圖4 A。M3的LVEF較CON、M1和M2組，顯著下降（40.40%±2.24%vs54.72%±1.64%、46.00%±4.41%和54.68%±3.38%，圖4B）。此外，M3 左心室短軸縮短率與CON、M1、M2 相比顯著下降（19.40%±1.20%vs27.88%±1.05%、22.57%±2.50%和27.86%±2.20%，圖4C）。胸骨旁左心室長軸和短軸切面顯示，IVS、LVPW、LVID在收縮和舒張期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖4 各組小鼠胸骨旁左心室短軸切面M型超聲圖像和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 M-model ultrasound images and statistical results of parasternal left ventricle in short axis section of mice in each group

2.5 阿霉素給藥組血清NT-proBNP顯著升高

臨床上常應(yīng)用心臟標(biāo)志物來評估心肌損傷和心功能惡化程度，如CK和CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP、MPO等。本研究選用了臨床上較常使用的血清NT-proBNP、cTnI用以評估阿霉素心肌病模型中實(shí)驗(yàn)對象心功能和心肌損傷水平［28］。阿霉素各給藥組血清NTproBNP水平［M1組（1271.36±11.76）pg/ mL、M2組為（1270.85±36.19）pg/mL，M3組為（1225.26±24.19）pg/mL］較CON［（638.13±12.69）pg/mL］顯著升高（P均＜0.05，圖5A），提示阿霉素給藥后實(shí)驗(yàn)動物模型出現(xiàn)了心力衰竭。

各阿霉素給藥組血清cTnI 水平［M1 組為（41.24±2.39）ng/L、M2組為（40.84±2.12）ng/L、M3組為（47.04±6.60）ng/L］與CON［（38.85±1.14）ng/L］相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖5B）。

圖5 血清NT-proBNP、cTnI檢測結(jié)果Fig.5 The levels of Serum NT-proBNP and cTnI

2.6 心肌組織形態(tài)學(xué)改變

既往研究［29］表明，阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷，在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞胞漿空泡化、肌原纖維紊亂和丟失。本實(shí)驗(yàn)中動物心肌組織H-E染色結(jié)果見圖6。與CON相比，模型組心肌均可見心肌細(xì)胞空泡化變性，細(xì)胞徑向增大（圖6B），部分肌纖維走向紊亂；其中M3心肌細(xì)胞空泡化程度及數(shù)量顯著高于CON、M1和M2（81個/視野vs3 個/視野、65個/視野、34個/視野，P＜0.05），細(xì)胞徑向增大最明顯（圖6B）。與M1相比，M2、M3中阿霉素所致的心肌細(xì)胞空泡化數(shù)量減少，心肌細(xì)胞纖維排列紊亂較輕。Masson染色未見心肌纖維顯著的纖維化改變，纖維化面積各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A、C），考慮可能與造模時(shí)間較短有關(guān)。

圖6 各組心室組織H-E染色及Masson染色結(jié)果Fig.6 H-E staining and Masson staining of left ventricular tissue in each group

3 討 論

阿霉素作為最常用的化療藥物，其心臟毒性涉及諸多病理生理學(xué)過程，主要表現(xiàn)為心肌炎、心肌病、急性和慢性充血性心力衰竭［29-33］，及各種心律失常，包括自主神經(jīng)功能紊亂引起的竇性心動過速［34］、房性期前收縮和心房纖顫［35-36］、房室傳導(dǎo)阻滯［37］、室性心律失常［36］，且非持續(xù)性室性心動過速較常見［36，38］。另外，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、受體參與阿霉素心臟毒性發(fā)生發(fā)展過程，包括鐵代謝障礙和鐵死亡［24,39］、鈣超載［40-41］、氧化應(yīng)激［42-43］、腺苷酸活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（AMPK signaling pathway）［44］、NRG-1/HER2/Erb B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［45-46］、拓?fù)洚悩?gòu)酶2β［47-48］、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）［49-52］、YAP1［53］及P53［54］等。雖然針對阿霉素心臟毒性的基礎(chǔ)研究很多，但目前美國食品藥品管理局（Food And Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床防治阿霉素心臟毒性的藥物僅有右雷佐生（dexrazoxane，DXZ）［55］。然而DXZ也可以抑制作為阿霉素靶點(diǎn)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，導(dǎo)致阿霉素抗癌效率降低［56］；另外，DXZ顯示出致癌潛力，具有發(fā)展為急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征的風(fēng)險(xiǎn)［57］。因此，阿霉素心臟毒性的機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)未來仍需更深入的研究闡明，而公認(rèn)、統(tǒng)一、穩(wěn)健的阿霉素誘導(dǎo)的心肌病模型的建立是一切研究的前提。

結(jié)合臨床評估心臟功能及心臟損傷的常用指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)分別通過小鼠整體情況、心電生理、心臟超聲及心臟組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)整體評估不同給藥方式和劑量造模的優(yōu)劣。

臨床上阿霉素常見的給藥方式是通過靜脈。動物實(shí)驗(yàn)中，給藥方式有鼠尾靜脈注射、腹腔注射等。靜脈注射單次注射藥量峰濃度高；腹腔注射藥物吸收緩慢，血藥濃度峰濃度相對較低，而阿霉素急性心臟毒性與其峰濃度相關(guān)［13］，因此腹腔注射給藥安全性高、成模率高。腹腔注射給藥其他優(yōu)勢還包括：①降低了給藥難度；② 尾靜脈注射易造成鼠尾缺血壞死進(jìn)而繼發(fā)感染，而腹腔注射可避免此情況。

臨床上心臟超聲評估心力衰竭程度、室壁厚度及心室腔內(nèi)徑是金標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)合小鼠心臟超聲變化比較造模方式的優(yōu)劣。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示給予阿霉素后QT間期顯著延長，這可能是阿霉素引起惡性室性心律失常的基礎(chǔ)。臨床研究［58］也發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類藥物治療與QT間期的改變相關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。對使用蒽環(huán)類藥物治療的患者發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)室速的分析中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)室速最普遍的誘因就是QT間期延長［59］。然而，阿霉素所致QT間期延長的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究探索。

臨床上常使用心臟標(biāo)志物評估心力衰竭及心肌損傷程度。臨床研究［28］發(fā)現(xiàn)，接受阿霉素治療的兒童心功能不全與正常心功能相比，心功能不全者的血漿NT-pro-BNP 水平顯著升高（P＜0.008），所有患者的cTnI水平均低于正常值，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此我們也認(rèn)為，血漿NT-pro-BNP濃度可能是評估阿霉素心肌病心功能不全有用且敏感的指標(biāo)。

心肌組織形態(tài)學(xué)觀察可見給予阿霉素后心肌細(xì)胞顯著空泡化變性，但纖維化病變不顯著。既往研究［60］顯示，急性損害很少見到纖維化改變，而較長造模周期（持續(xù)給藥4周，甚至給藥結(jié)束后第12周處死）中可觀察到心肌顯著纖維化改變［61］；本實(shí)驗(yàn)中未觀察到心肌纖維化改變可能的原因是給藥時(shí)間短，估計(jì)短期用藥對心肌成纖維細(xì)胞影響不大，因此不能觀察到心肌纖維化改變；而心肌細(xì)胞和心肌肌原纖維的丟失也可能是心肌肌組織排列疏松的原因［62］。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，給予阿霉素后心肌細(xì)胞徑向增大，這與Shen等［63］的研究觀測到阿霉素處理后的心肌細(xì)胞徑向減小相左。然而我們的結(jié)果同Wang等［23］的研究觀測到阿霉素處理后心肌細(xì)胞增大的結(jié)果相一致。鑒于目前就阿霉素所致心肌細(xì)胞的變化尚存在分歧，因此今后需要開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素7.5 mg/ kg，隔天給藥2次，腹腔注射給藥組成模率最高。阿霉素單次15 mg/kg或5 mg/kg，每天1次（連續(xù)3 d）給藥時(shí)，均因?yàn)檠帩舛确鍧舛雀?，短時(shí)間小鼠難以代謝，瞬時(shí)藥物毒性大，易造成動物死亡。而低于7.5 mg/kg的長時(shí)程給藥，由于給藥間期較長，血藥濃度呈周期性變化，不能一直維持有效血藥濃度。

腹腔注射阿霉素構(gòu)建阿霉素誘導(dǎo)的心肌病小鼠模型方法簡便、可靠。本研究結(jié)果為未來探索阿霉素誘導(dǎo)的心肌病發(fā)病機(jī)制及干預(yù)策略奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。