Circ-0003910在HER2陽性乳腺癌中的表達、定位、生物學作用及蛋白質(zhì)組學研究

朱 藝，肖 斌，劉嘉慧，黃 玲，孫朝暉，李林海

1.廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院，清遠市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東 清遠 511500；2.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510000；3.玉溪市中心血站，云南 玉溪 653100；

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的主要原因。2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的癌癥［1］。乳腺癌可根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達情況及Ki-67增殖指數(shù)進行分子分型，其中HER2陽性型乳腺癌惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，是乳腺癌治療的重點和難點［2-3］。HER2能夠影響PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/MAPK等信號轉(zhuǎn)導通路，并且HER2陽性乳腺癌中波形蛋白（vimentin）、轉(zhuǎn)錄因子Slug、轉(zhuǎn)錄因子Twist表達明顯高于癌旁組織，鈣黏蛋白E（E-cadherin）的表達明顯低于癌旁組織，提示HER2陽性乳腺癌細胞更容易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)進程［4］，該型乳腺癌細胞更常出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和浸潤等。為了改善HER2陽性乳腺癌的治療現(xiàn)狀，有必要研究和探討HER2陽性型乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，普遍存在于真核細胞轉(zhuǎn)錄組中，與基因表達調(diào)控［5］、信號轉(zhuǎn)導機制等細胞進程密切相關(guān)［6］。CircRNA的表達失調(diào)在胃癌［7］、肝癌［8］、肺癌［9］等多種腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展也與circRNA的表達異常相關(guān)，許多研究［10-11］證實circRNA能夠通過多種機制影響腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。Circ-CCDC9可吸附miR-6792-3p，與微囊蛋白1（caveolin-1，CAV1）形成分子海綿調(diào)節(jié)網(wǎng)，抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制胃癌的進展，因此circ-CCDC9是胃癌的新型生物標志物和治療靶點［12］。Circ-TADA2A-E6是三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的抑癌基因，在TNBC中呈顯著低表達，能夠正向調(diào)節(jié)靶基因細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制蛋白-3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）的表達，從而削弱乳腺癌的侵襲性［13］，但circRNA在HER2陽性型乳腺癌細胞中的作用機制仍不清楚。

本研究以高通量circRNA芯片為切入點，重點關(guān)注circ-0003910在乳腺癌組織和細胞中的表達水平，探究circ-0003910的表達與乳腺癌細胞遷移和侵襲的關(guān)系，通過蛋白質(zhì)組學鑒定circ-0003910調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，為HER2陽性型乳腺癌的診斷與治療提供一定的指導依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）和人乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、MCF-7、BT-474，SK-BR-3，UACC-812）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，MCF-10A專用培養(yǎng)基購自武漢普賽諾生命科技有限公司，1%青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司，Lipofectamine?3000購自美國ThermoFisher公司，SYBR Green染料試劑盒和PrimeScript RT試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。過表達circ-0003910 pSin-puro質(zhì)粒由江西南昌聚焦生物科技有限公司構(gòu)建。Circ-0003910的siRNA、RNA熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）試劑盒與探針購自廣州銳博生物科技有限公司，BaseScope二代紅色試劑盒（323900）購自美國ACD公司，139例乳腺癌組織芯片（HBreD139Su01）及90例正常乳腺組織芯片（HBre-Duc090Sur-01）購自上海芯超生物科技有限公司。

1.2 CircRNA芯片實驗

提取4種乳腺癌細胞系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光標記，并進行標記效率質(zhì)檢，質(zhì)控合格后進行芯片雜交。采用Agilent Scanner G2505C掃描儀掃描芯片，使用Agilent Feature Extraction（11.0.1.1版本）采集圖像，并讀取數(shù)值。經(jīng)歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理后，使用散點圖和差異倍數(shù)篩選出兩組間差異表達倍數(shù)大于2（fold change＞2）circRNA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、UACC-812用DMEM培養(yǎng)，BT-474用RPMI-1640培養(yǎng)，正常乳腺上皮細胞MCF-10A用MCF-10A專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，均在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液。細胞置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中，隔天換液，細胞匯合度達到80%～ 90%時傳代。

1.4 FISH實驗

SK-BR-3細胞爬片后用4%多聚甲醛固定20 min，預(yù)冷的0.5%Triton X-100通透細胞，37 ℃探針預(yù)雜交以及探針雜交。采用DAPI進行細胞核DNA染色20 min后挑片，根據(jù)玻片大小用適量抗熒光淬滅劑封片，避光置于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.5 BaseScope實驗

139例乳腺癌患者的手術(shù)時間從2001年1月—2004年8月，隨訪周期9.0～ 12.5年，最長隨訪時間至2013年7月，芯片附帶有每個樣本的ER、PR、HER2與Ki-67的免疫組織化學檢測數(shù)據(jù)。首先將組織芯片進行烤片60 min，隨后二甲苯與無水乙醇脫蠟20 min；經(jīng)雙氧水處理10 min后，用現(xiàn)配的靶標修復(fù)試劑在98～ 102 ℃緩慢沸騰進行靶標修復(fù)15～ 30 min，再用蛋白酶處理15～ 30 min；芯片用APM1-8試劑覆蓋溫育，進行信號放大，再用50%蘇木精染液染色2 min；蒸餾水清洗后用現(xiàn)配的0.02%氨水復(fù)染玻片；再次用蒸餾水清洗并烘干，根據(jù)組織芯片大小用適量VectaMont封片液進行封片，最后掃描全片。在實驗過程中，因部分組織脫落，實際可檢測乳腺癌組織131例和乳腺正常組織82例，乳腺癌組織根據(jù)芯片已有的免疫組織化學結(jié)果分型，其中三陰性組織32例，luminal A型組織47例，luminal B型組織26例，HER2陽性型組織26例。運用QuPath軟件分析各組織信號強度，用GraphPad Prism 8對信號強度進行統(tǒng)計學分析。在生存分析中，以信號值≥2作為circ-0003910高表達組（25例），信號值＜2作為circ-0003910低表達組（106例）。

1.6 Transwell實驗

消化細胞并離心后，棄上清液；細胞用1 mL無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)。在transwell小室的下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸20萬細胞并加入transwell小室的上室，保證細胞分布均勻；將transwell小室置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中溫育24 h。次日，甩干凈小室內(nèi)培養(yǎng)基后用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，待干燥后用中性樹膠和蓋玻片封片。顯微鏡下進行觀察及拍攝，采用Image J軟件分析遷移細胞數(shù)量。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

用TRIzol試劑盒（購自加拿大Invitrogen公司）提取細胞總RNA，分光光度儀測總RNA 濃度。用Prime ScriptRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，在BIORAD熒光定量PCR儀上利用SYBR Green染料試劑盒檢測待測基因的表達水平。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；GOTO：39（40 個循環(huán)），95 ℃，5 s；熔解曲線。circ-0003910上游引物5'-GCTATAAGCTTCTTGAAGGCAG AG-3'，下游引物5'-TTGCTTGGTTTTGCAGTAGATAC TT-3'。GAPDH上游引物5'-GAACGGGAAGC TCACTGG-3'，下游引物5'-GCCTGCTTCACC ACCTTCT。

1.8 TMT蛋白質(zhì)組學鑒定

棄掉細胞培養(yǎng)基，加入4 ℃預(yù)冷PBS，平放輕輕搖動洗滌細胞1 min，棄PBS，重復(fù)洗滌2次。在冰上加入預(yù)冷的PBS，用細胞刮將細胞刮于培養(yǎng)皿一側(cè)，吸取液體至預(yù)冷的離心管內(nèi)，離心去上清液后液氮速凍。由上海中科新生命公司完成質(zhì)譜分析。

1.9 GO分析和KEGG分析

用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線網(wǎng)站對這些蛋白進行功能分類注釋，并進行功能富集分析。

1.10 統(tǒng)計學處理

運用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析和作圖。對于兩組定量資料分析比較，若滿足正態(tài)分布，且滿足方差齊性，采用獨立樣本t檢驗，以表示；只滿足正態(tài)分布，不滿足方差齊性，采用Welch’s校正非配對t檢驗，以表示；不滿足正態(tài)分布，則采用Mann-WhitneyU檢驗，用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細胞系中表達上調(diào)

為了篩選在HER2陽性乳腺癌細胞中高表達的circRNA，本研究整合了SK-BR-3細胞（HER2陽性型）、MDA-MB-231細胞（三陰性型）、MCF-7細胞（luminal型）和MCF-10A細胞（正常乳腺上皮細胞）的標準化circRNA芯片表達數(shù)據(jù)（圖1），根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫注釋所得circRNA的名稱，計算差異倍數(shù)，納入差異倍數(shù)絕對值大于2的circRNA（fold change＞2，P＜0.05）。在HER2陽性型乳腺癌細胞組（SK-BR-3）與正常乳腺上皮細胞組（MCF-10A）比較中獲得上調(diào)的circRNA 845個，下調(diào)的circRNA 998個；在三陰性乳腺癌細胞組（MDA-MB-231）vs正常乳腺上皮細胞組（MCF-10A）中獲得上調(diào)的circRNA共938個，下調(diào)的circRNA共1154個；在luminal型乳腺癌細胞組（MCF-7）vs正常乳腺上皮細胞組（MCF-10A）中獲得上調(diào)的circRNA 973個，下調(diào)的circRNA共793個（圖2）。排除在三陰性乳腺癌細胞組和luminal型乳腺癌細胞組中同樣上調(diào)或下調(diào)的差異表達circRNA，獲得僅在HER2陽性型乳腺癌細胞組中差異表達倍數(shù)大于2（fold change＞2，P＜0.05）的circRNA，共889個，其中上調(diào)515個，下調(diào)374個。其中circ-0003910的差異表達倍數(shù)為24.39，引起我們的關(guān)注。我們通過RTFQ-PCR檢測了circ-0003910在正常乳腺上皮細胞MCF-10A和5種乳腺癌細胞MDA-MB-231（三陰性型）、MCF-7（luminal A型）、BT-474（luminal B型）、SK-BR-3（HER2陽性型）、UACC-812（HER2陽性型）中的表達量，結(jié)果表明circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細胞（UACC-812、SK-BR-3）中表達顯著上調(diào)（圖2H）。為了明確circ-0003910的亞細胞定位，我們在SKBR-3細胞中進行了FISH實驗，結(jié)果表明，circ-0003910定位于HER2陽性型乳腺癌細胞質(zhì)和細胞核，但主要定位于細胞質(zhì)（圖2I）。

圖1 circRNA芯片熒光掃描圖Fig.1 Fluorescence scan of circRNA microarraies

圖2 Circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細胞中表達上調(diào)Fig.2 Circ-0003910 was up-regulated in HER2 positive breast cancer cells

2.2 Circ-0003910在乳腺癌組織中的表達與患者預(yù) 后

為了明確circ-0003910在乳腺癌組織中的表達水平和定位，本研究通過BaseScope實驗檢測circ-0003910在131例乳腺癌組織和82例正常乳腺組織中的表達水平。實驗結(jié)果表明，circ-0003910分布于細胞質(zhì)和細胞核，但主要定位于細胞質(zhì)，與FISH實驗結(jié)果一致（圖3A）。與正常組織相比，高表達circ-0003910的樣本更多分布于乳腺癌組織，但兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（圖3B）。在不同分子分型的乳腺癌組織樣本中，高表達circ-0003910主要分布于HER2陽性乳腺癌組織，其表達量與luminal A型乳腺癌組織相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但與其他分子分型差異無統(tǒng)計學意義（圖3C）。Kaplan-Meier生存分析表明，高表達circ-0003910提示乳腺癌患者的預(yù)后可能更差，生存曲線無交叉（P=0.0559，圖3D）。

圖3 Circ-0003910在乳腺癌組織中的表達與預(yù)后Fig.3 Expression and prognosis of circ-0003910 in breast cancer tissues

2.3 Circ-0003910在體外促進乳腺癌細胞遷移和侵襲

為了探討circ-0003910在乳腺癌細胞中的生物學功能，本研究在circ-0003910相對表達量較低的MDA-MB-231細胞中瞬時轉(zhuǎn)染circ-0003910過表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒，另在circ-0003910相對表達量較高的SK-BR-3細胞中用siRNA敲低circ-0003910，用RTFQ-PCR驗證circ-0003910的過表達和敲低細胞模型構(gòu)建成功。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因之一［14］，推測過表達（敲低）circ-0003910可能影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。Transwell遷移和侵襲實驗表明，過表達circ-0003910能夠促進MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲，沉默circ-0003910則抑制SK-BR-3細胞遷移和侵襲（圖4）。

圖4 Circ-0003910在體外促進乳腺癌細胞遷移和侵襲Fig.4 Circ-0003910 promotes breast cancer cell migration and invasion in vitro

2.4 高表達circ-0003910影響的蛋白質(zhì)組學調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及差異蛋白的功能富集分析

為了確定circ-0003910可能通過哪些蛋白影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲，本研究采用circ-0003910內(nèi)源性相對表達量較低的MCF-7細胞構(gòu)建了穩(wěn)定過表達circ-0003910的細胞及其對照組細胞，并進行蛋白質(zhì)組學定量分析，篩選顯著性差異表達蛋白質(zhì)。以差異表達倍數(shù)FC＞1.2倍（上調(diào)大于1.2倍或下調(diào)小于0.83倍）且P＜0.05為標準，篩選出104個蛋白質(zhì)在過表達circ-0003910細胞中上調(diào)，93個蛋白質(zhì)下調(diào)。對197個差異表達蛋白質(zhì)進行了GO分析和KEGG分析。GO分析中的生物學過程（biological process，BP）顯示，差異表達蛋白參與了細胞增殖、染色質(zhì)的組裝和調(diào)控、核小體的組裝、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體的裝配及炎癥刺激相關(guān)反應(yīng)等；細胞學組分（cellular component，CC）顯示，差異表達蛋白主要位于染色體中的蛋白、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體、宿主細胞組分等；分子生物學功能（molecular function，MF）分析顯示，差異表達蛋白質(zhì)主要參與染色質(zhì)及核小體DNA的結(jié)合、雙鏈DNA形成及彎曲、蛋白質(zhì)二聚化等進程（圖5）。

圖5 Circ-0003910影響下游差異表達蛋白GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of downstream differentially expressed proteins affected by circ-0003910 overexpression

KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析表明，差異表達蛋白主要富集于與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的細胞黏附分子合成（包括整聯(lián)蛋白家族的ITGB1、ICAM1和L1CAM）和參與癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)的組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子（包括H3C15、H3C1和DDIT3）等（圖6）。

圖6 Circ-0003910影響下游差異表達蛋白KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of downstream differentially expressed proteins affected by circ-0003910

3 討 論

乳腺癌是一種威脅全球女性健康的腫瘤，發(fā)病率逐年上升，中國是全球乳腺癌發(fā)病例數(shù)最多的國家，并且乳腺癌患者呈現(xiàn)低齡化趨勢［15］。HER2陽性型乳腺癌占所有乳腺癌病例數(shù)的15%～ 20%，其復(fù)發(fā)率高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移概率高、內(nèi)分泌治療反應(yīng)性低并且預(yù)后較差。尋找新的生物標志物用于早期診斷和及時治療，是提高乳腺癌患者生存率與生存質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前，circRNA相關(guān)研究主要報道了其可以作為miRNA海綿，與RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用，參與蛋白質(zhì)翻譯或直接調(diào)控靶基因等作用［16］。CircRNA具有共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、能夠避免RNase R的降解、比線性RNA更加穩(wěn)定、有明顯的物種間保守性和組織特異性等特征［17-18］，具有成為理想的腫瘤早期診斷、個體化治療及預(yù)后評估的分子標志物的潛力。本研究通過circRNA芯片技術(shù)篩選出在HER2陽性乳腺癌細胞系中差異表達circRNA，其中circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細胞中顯著高表達，且主要定位于細胞質(zhì)，提示其可能參與下游蛋白的表達調(diào)控。Basescope實驗驗證了其在HER2陽性乳腺癌組織中明顯高表達。更重要的是，circ-0003910表達量與預(yù)后雖無顯著相關(guān)性，但P值為0.0559，已接近臨界值0.05，提示高表達circ-0003910的乳腺癌患者預(yù)后可能更差。此外，本研究通過構(gòu)建circ-0003910過表達和敲低的乳腺癌細胞株進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)circ-0003910能夠促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明，circ-0003910是乳腺癌轉(zhuǎn)移的驅(qū)動基因，可能是乳腺癌患者的預(yù)后預(yù)測因子。

BaseScope的實驗流程分為切片準備、RNA雜交、信號放大和成像4個環(huán)節(jié)。BaseScope基于信號放大和背景抑制技術(shù)［19］，將組織樣本中的單個RNA可視化呈現(xiàn)，該實驗技術(shù)擁有高靈敏度、高特異性和高信噪比的優(yōu)點，并且與PCR、免疫組織化學檢測結(jié)果都有很好的一致性。在本研究中，陽性信號探針和陰性對照組的染色結(jié)果均符合預(yù)期，表明實驗過程無問題。實驗組染色結(jié)果顯示，circ-0003910僅在部分乳腺癌組織中高表達，而在正常乳腺組織中circ-0003910幾乎不表達，推測circ-0003910的表達水平可能在特定乳腺癌樣本類型中受到特定順式作用元件的調(diào)控。

circRNA可通過作為分子海綿、蛋白質(zhì)支架和誘餌等方式影響下游靶蛋白的表達［20］。本研究繪制了高表達circ-0003910后的乳腺癌細胞蛋白質(zhì)組學圖譜。GO分析結(jié)果表明，受circ-0003910調(diào)控的蛋白質(zhì)主要參與染色質(zhì)、DNA的構(gòu)象、組裝、結(jié)合、基因表達與沉默的負調(diào)控等進程。在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)與細胞黏附相關(guān)的整聯(lián)蛋白家族成員，包括ITGB1、ICAM1和L1CAM均顯著高表達。β1整聯(lián)蛋白（integrin beta 1，ITGB1）為整聯(lián)蛋白家族成員，可以和α亞基結(jié)合形成12種整聯(lián)蛋白受體，與膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等多種細胞外基質(zhì)成分結(jié)合［21］，在細胞黏附和遷移中起重要作用［22］。細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）是乳腺癌轉(zhuǎn)移的新靶點，可通過激活與細胞周期和細胞干性相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。阻斷同源性ICAM1相互作用可以顯著抑制循環(huán)腫瘤細胞簇的形成、內(nèi)皮遷移和肺轉(zhuǎn)移［23-24］。L1-細胞黏附分子（L1-cell adhesion molecule，L1CAM）在多種惡性腫瘤中高表達，能夠促進腫瘤細胞運動性和遷移能力，并且常與不良預(yù)后相關(guān)［25］。在乳腺癌中，L1CAM及其可溶性形式可促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏附和遷移能力［26］。鑒于上述差異表達蛋白質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，circ-0003910可能通過調(diào)控這些蛋白質(zhì)的表達進而影響HER2陽性乳腺癌細胞的遷移和侵襲。在后續(xù)研究中，我們將圍繞circ-0003910如何影響整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的表達，影響細胞黏附和細胞遷移的分子機制進行深入探索。

綜上，circ-0003910在HER2陽性乳腺癌細胞和乳腺癌組織中呈高表達，影響與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平，促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲，發(fā)揮致癌基因效應(yīng)。circ-0003910可能是HER2陽性乳腺癌新的生物標志物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。