CRISPR/Cas生物傳感器檢測(cè)食源性病原體的研究進(jìn)展

黃璐琦，孫旭飛，苑 寧，范少華，張 偉，4，5*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院 河北滄州 061100 3 河北軟件職業(yè)技術(shù)學(xué)院 河北保定 071000 4 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定 071000 5 河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北保定 071000）

食源性疾病作為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，關(guān)系著人們的身體健康和生命安全。目前，引起食源性疾病的病原體包括食源性致病菌、病毒、生物毒素、藥物殘留、重金屬、非法添加物等[1]。據(jù)WHO 報(bào)道，全球每年約有6 億人（幾乎每10 人中就有1 人） 因食用受污染的食品而患病，導(dǎo)致約42 萬(wàn)人的死亡，造成3 300 萬(wàn)健康生命年損失。各國(guó)每年用來(lái)治療食源性疾病的費(fèi)用約高達(dá)150 億美元[2]。其中，食源性致病菌和病毒是造成食源性疾病的重要原因[3-4]。常見(jiàn)的食源性致病菌有沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等。常見(jiàn)的食源性病毒有諾如病毒、輪狀病毒、冠狀病毒、豬瘟病毒等[5-6]。生物傳感器因具有響應(yīng)時(shí)間快、成本低、不需要任何預(yù)富集步驟、可移植性和易于使用的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食源性病原體的檢測(cè)[7]。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas） 系統(tǒng)是于1987年由Ishino 等在大腸埃希菌中首次發(fā)現(xiàn)的[8]。它是由細(xì)菌進(jìn)化出的一種具有免疫記憶的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用于抵制外源核酸及噬菌體的入侵[9]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有較強(qiáng)的核酸識(shí)別特性，近年來(lái)逐漸被用作生物傳感系統(tǒng)研究的識(shí)別元件。本文介紹并總結(jié)CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其在食源性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 CRISPR/cas 系統(tǒng)

近年來(lái)，由于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR 及其相關(guān)蛋白Cas 系統(tǒng)可以作為一種高效的基因組編輯工具，因此引起研究人員的關(guān)注。2019年12月，CRISPR 基因編輯技術(shù)入選了Nature 近10年中最具影響力的五項(xiàng)重大科學(xué)事件之一，并作為“變革生物技術(shù)”斬獲了2020年諾貝爾獎(jiǎng)[10]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)通過(guò)Cas 效應(yīng)蛋白-向?qū)NA（guide RNA，gRNA）雙鏈體進(jìn)行高特異性識(shí)別活性，使Cas 效應(yīng)蛋白對(duì)靶DNA 產(chǎn)生切割活性[11]，引起雙鏈斷裂（Double-stranded DNA break，DSB），進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)源通路修復(fù)DSB 缺口，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn)的編輯[12]。有研究表明，CRISPR/Cas 系統(tǒng)分布于47%已測(cè)序細(xì)菌和90%已測(cè)序古細(xì)菌的基因組中，目前已知有2 大類6 個(gè)亞型[13-14]。

1.1 作用機(jī)制

完整的CRISPR 基因座包含一系列CRISPR陣列、CRISPR 相關(guān)Cas 蛋白和由不同間隔區(qū)（26～72 bp）分隔的短的、高度保守的重復(fù)序列（21～48 bp）[15-16]組成。當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA 入侵宿主后，細(xì)菌通過(guò)CRISPR 序列與Cas 蛋白的共同作用來(lái)防御噬菌體的入侵，其作用機(jī)制包括“捕獲-表達(dá)-干擾”3 個(gè)階段的免疫反應(yīng)。

在捕獲階段，首次入侵的噬菌體會(huì)被保守的適應(yīng)性蛋白Cas1 和Cas2 識(shí)別加工成短片段，通過(guò)獲取入侵噬菌體的核酸序列，在一些相關(guān)效應(yīng)因子或一些效應(yīng)蛋白的參與下將其整合到細(xì)菌的CRISPR 序列中，形成間隔子序列。在表達(dá)階段，CRISPR 陣列被轉(zhuǎn)錄為前體crRNA（pre-crRNA），然后被加工為成熟的crRNA（crispr RNA）。1 類系統(tǒng)中，Cas6 作為一種核糖核酸內(nèi)切酶可以切割pre-crRNA 中重復(fù)序列的單個(gè)磷酸二酯鍵使其成為成熟的crRNA[17]。2 類系統(tǒng)的機(jī)制較為復(fù)雜多樣，有些需要RNase III 對(duì)pre-crRNA 進(jìn)行加工[18]，且這一加工過(guò)程需要反式激活tracrRNA （transactivating crRNA）的參與[19]；有些可以獨(dú)立轉(zhuǎn)錄出成熟的crRNA。在某些V 型以及所有VI 型系統(tǒng)中并未發(fā)現(xiàn)tracrRNA 的存在，Cas12a 和Cas13a可分別通過(guò)不同的機(jī)制直接加工pre-crRNA 形成成熟的crRNA[20]。在干擾階段，效應(yīng)蛋白復(fù)合物或單個(gè)的效應(yīng)蛋白與gRNA 結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體，通過(guò)特異性識(shí)別前間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif，PAM），使gRNA 與入侵靶標(biāo)堿基互補(bǔ)，Cas 核酸酶特異性切割外源核酸序列，從而達(dá)到防御的目的。作用原理圖見(jiàn)圖1。

圖1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)部件機(jī)理示意圖Fig.1 Diagrammatic illustration of mechanism of structural components of CRISPR-Cas system

1.2 分類

隨著研究人員對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的深入研究，CRISPR 系統(tǒng)中的各種Cas 核酸酶相繼被發(fā)現(xiàn)。2015年，Makarova 等[21]根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)中Cas 復(fù)合體的組成與Cas 蛋白結(jié)構(gòu)特征，將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為2 類-5 型-18 亞類，這是首次對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行較為明確的劃分，已得到普遍認(rèn)可。在此基礎(chǔ)上，研究人員于2016年又發(fā)現(xiàn)一種新型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，進(jìn)一步對(duì)CRISPR/Cas 家族進(jìn)行補(bǔ)充與完善。目前，根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)參與干擾階段的Cas 蛋白數(shù)量分為兩大類，6 個(gè)亞型，每種亞型都有標(biāo)志性的Cas 核酸酶[22]。第1 類包括I、III 和IV 型，這種類型需多種Cas 蛋白共同參與干擾機(jī)制。第2 類包括II 和V 和VI 型，這種類型只需一個(gè)具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，分子質(zhì)量較大的蛋白參與干擾階段[23]。由于2 類系統(tǒng)簡(jiǎn)單、高效，因此常用于生物工程和CRISPR 診斷。目前研究最廣泛的是Cas9 系統(tǒng)、Cas12 系統(tǒng)和Cas13 系統(tǒng)。不同類型Cas 系統(tǒng)分類見(jiàn)表1。

表1 CRISPR-2 類效應(yīng)核酸酶[24，34，61]Table 1 Class 2 CRISPR-associated effector nucleases[24，34，61]

1.2.1 Cas9 系統(tǒng) Cas9 是一種由雙RNA 引導(dǎo)的具有DNA 核酸內(nèi)切酶活性的效應(yīng)蛋白，可以通過(guò)組氨酸-天冬氨酸-組氨酸樣結(jié)構(gòu)域 （His-Asn-His，HNH）和原核同源重組蛋白R(shí)uv C 樣結(jié)構(gòu)域（Cross-over junction endodeoxyribonuclease Ruv C）誘導(dǎo)特定雙鏈DNA（dsDNA）斷裂[22，25]。2012年，Wiedenheft 等[26]發(fā)現(xiàn)從嗜熱鏈球菌中純化出的Cas9 可通過(guò)crRNA 靶向切割基因，這一發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了研究人員對(duì)于Cas9 系統(tǒng)的研究。Cas9 系統(tǒng)是II 型CRISPR/Cas 系統(tǒng)中最具有標(biāo)志性的家族，由crRNA、tracrRNA 和Cas9 蛋白3 個(gè)重要部分構(gòu)成。Charpentier 和Doudna 團(tuán)隊(duì)[25]將tracrRNA和crRNA 的組合命名為單一的向?qū)NA（gRNA）。在基因編輯中，crRNA 和tracrRNA 還可以人工融合產(chǎn)生嵌合的單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）。gRNA 與Cas9 的結(jié)合會(huì)產(chǎn)生活性核糖核蛋白復(fù)合物，對(duì)靶序列的識(shí)別、切割起著至關(guān)重要的作用[27]。

Cas9 系統(tǒng)的激活首先需對(duì)特異性目標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，由tracrRNA 和crRNA 形成的gRNA 識(shí)別靶標(biāo)PAM。PAM 最早由Mojica 等[28]于2009年提出，他們發(fā)現(xiàn)在原間隔子靶序列的一側(cè)存在2～5 nt 的保守序列，這段序列可使CRISPR/Cas 系統(tǒng)區(qū)分出自己的基因組DNA 和入侵的核酸序列[29]，在病毒入侵時(shí)加速識(shí)別[30]，促使dsDNA 鏈分離，RNA-靶DNA 雜交形成R 環(huán)[31]。PAM 一般存在于間隔子靶序列下游3 nt 處，Cas9 蛋白的PI 結(jié)構(gòu)域可識(shí)別5'-NGG-3' 的PAM[30]。在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中，對(duì)PAM 的識(shí)別會(huì)啟動(dòng)dsDNA 解鏈，使crRNA 鏈侵入并與靶堿基配對(duì)。靶標(biāo)DNA 的識(shí)別嚴(yán)格依賴于DNA 靶位點(diǎn)下游同源PAM 的存在，同時(shí)也需PAM 旁邊的種子序列與gRNA 的特異性互補(bǔ)結(jié)合[32]。種子序列即crRNA 與靶DNA 互補(bǔ)的前8～10 個(gè)堿基[25]。有研究表明，種子序列的存在能夠進(jìn)一步促進(jìn)crRNA-靶DNA 的雜交，種子序列的錯(cuò)配還會(huì)導(dǎo)致酶切割活性的喪失[33]。在識(shí)別PAM 區(qū)和種子序列后，crRNA5' 末端的20 個(gè)核苷酸通過(guò)堿基互補(bǔ)對(duì)目標(biāo)靶序列進(jìn)行捕獲，形成一個(gè)R 環(huán)結(jié)構(gòu)[34]。一旦crRNA-DNA 雜交R-環(huán)開(kāi)始形成，Cas9 就會(huì)啟動(dòng)效應(yīng)蛋白的酶切特性，在位于HNH和RuvC 結(jié)構(gòu)域的PAM 序列上游3 個(gè)堿基處以二價(jià)陽(yáng)離子依賴的方式分別催化靶DNA 鏈和非靶DNA 鏈的切割，產(chǎn)生平的斷裂DSB 位點(diǎn)[35-37]。

隨著對(duì)Cas9 研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)了Cas9n（Cas9 nickase）[38]，它是Cas9 變種中的一種。這種類型的Cas9 是由在RuvC 或HNH 域中引入D10A 或H840A 沉默突變產(chǎn)生的[39]。該酶可在靶標(biāo)的相應(yīng)鏈上產(chǎn)生切口。而當(dāng)兩個(gè)域都發(fā)生突變并同時(shí)失活，會(huì)形成缺乏核酸酶的另一變種dCas9（dead Cas9），失活的dCas9 核酸酶只保留了與DNA 的結(jié)合能力，可特異性地結(jié)合到靶DNA 序列上，但不發(fā)生切割[40]。dCas9 還與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活或者抑制域結(jié)合，利用CRISPR/dCas9 系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的激活或者抑制，實(shí)現(xiàn)基因位點(diǎn)的可視化成像等[41]。

1.2.2 Cas12 系統(tǒng) 與CRISPR/Cas9 類似，V 型Cas12 蛋白也是CRISPR 家族2 類成員之一，這種蛋白可在gRNA 的作用下特異性結(jié)合互補(bǔ)的靶單鏈DNA（ssDNA）和dsDNA[42]，激發(fā)非特異切割活性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)Cas12 的多種亞型，有VA，Ve-B，Ve-C，Ve-U，其中對(duì)Cas12a （Cpf1）和Cas12b（C2c1）[43]的研究較多。

Cas12a 系統(tǒng)由crRNA 與Cas12 蛋白兩部分組成。與CRISPR/Cas9 相比，CRISPR/Cas12a 構(gòu)成分子質(zhì)量較小，約有1 200 至1 500 個(gè)氨基酸[44]。Cas12a 效應(yīng)蛋白具有一個(gè)特征的RuvC 核酸酶結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有DNase 和RNase 活性[45]。與Cas9不同，Cas12a 系統(tǒng)中crRNA 的形成不需要tracr-RNA 或RNase III 的參與。pre-crRNA 由Cas12a自身的RNase 結(jié)構(gòu)域加工，使Cas12 在CRISPR重復(fù)序列形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游4 nt 處剪切precrRNA，產(chǎn)生中間crRNA 分子，在體內(nèi)進(jìn)一步加工成約43 nt 的成熟crRNA[46]。Cas12a 與成熟cr RNA 形成Cas12a-crRNA 核糖核蛋白二元復(fù)合體，發(fā)生構(gòu)象變化，表現(xiàn)出對(duì)dsDNA 的切割活性。在crRNA 的引導(dǎo)下，Cas12a 識(shí)別位于靶標(biāo)上富含T 的PAM 序列與5～8 nt 的種子序列[47]。當(dāng)crRNA特異性識(shí)別靶標(biāo)鏈形成RNA-DNA 結(jié)合體后，Cas12a 通過(guò)RuvC 結(jié)構(gòu)域中的核酸酶位點(diǎn)，在PAM 序列的遠(yuǎn)端（3＇方向）18 nt 與非靶標(biāo)鏈PAM位點(diǎn)的遠(yuǎn)端（5＇方向）23 nt 處對(duì)靶標(biāo)鏈進(jìn)行切割，從而形成5 nt 突出的黏性末端。除了高特異性的dsDNA 切割活性，Cas12a 還顯示出與crRNA/目標(biāo)DNA 形成三元復(fù)合物后持續(xù)的Cas12 裂解活性，可以無(wú)選擇地發(fā)揮DNase 活性[46，48]，通過(guò)RuvC 結(jié)構(gòu)域裂解非特異的ssDNA，即反式切割活性[49]。

2015年，Shmakov 等[50]鑒定出一個(gè)新的CRISPR 系統(tǒng)蛋白Cas12b （又稱為 C2c1）。與Cas12a 不同，CRISPR/Cas12b 系統(tǒng)是由tracrRNA和crRNA 組成的gRNA 為導(dǎo)向的Cas12b 蛋白核酸酶，可以識(shí)別5'-（A）TTN 的PAM 序列，切割雙鏈DNA 后產(chǎn)生7 nt 突出的黏性末端[51-52]。由于Cas12a 僅帶有用于DNA 切割的RuvC 結(jié)構(gòu)域，因此還可以被修飾成核酸酶失活的Cas12a（dead Cas，dCas12a），用于基因編輯等領(lǐng)域。

1.2.3 Cas13 系統(tǒng) 2016年，研究人員在沙氏纖毛菌 （Leptotrichia shahii） 中發(fā)現(xiàn)一種新型2 類VI-A 型蛋白Cas13a（又稱C2c2）[53]。同年，該研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行沙氏纖毛菌C2c2（Lsh Cas13a）的體外切割試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在靶RNA 存在的情況下，Cas13a-crRNA 復(fù)合物不僅可以切割靶RNA，還可以非特異性地切割側(cè)枝ssRNA。迄今為止，CRISPR/Cas13 是目前CRISPR/Cas 家族中除第1類III 型外唯一靶向RNA，且具有非特異性切割活性的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。已發(fā)現(xiàn)的Cas13 蛋白有4 種亞型[54]，即VI-A（Cas13a/C2c2）、VI-B（Cas13b）、VI-C（Cas13c）和VI-D（Cas13d）。Cas13a（C2c2）亞型是第1 個(gè)廣為人知且具有典型特征的Cas13蛋白。

Cas13a 系統(tǒng)是由crRNA 與Cas13 蛋白兩部分構(gòu)成。crRNA 是由pre-crRNA 在Cas13 的單獨(dú)作用下形成的，不需要traRNA 的參與。Cas13a 蛋白是由1 個(gè)識(shí)別瓣葉（Recognition lobe，REC）和1個(gè)核酸酶瓣葉（Nuclease lobe，NUC）組成。其中，組成REC 葉片的Helical-1 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割precrRNA 形成成熟的crRNA，組成NUC 葉片的2 個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合域（Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN）負(fù)責(zé)誘導(dǎo)Cas13a 發(fā)生協(xié)同構(gòu)象變化，使無(wú)酶切活性狀態(tài)的Cas13a-crRNA 復(fù)合物表現(xiàn)出RNase 活性，特異性地對(duì)靶向RNA 進(jìn)行順式切割[55-56]。Cas13a 蛋白一旦被靶RNA 活化，也會(huì)展現(xiàn)出針對(duì)ssRNA 的“附帶切割”能力，裂解附近的其它ssRNA[57-58]。一直以來(lái)，由于不涉及dsDNA 解鏈的關(guān)系，靶標(biāo)不包含PAM 序列。然而，當(dāng)成熟的crRNA 與Cas13 蛋白結(jié)合形成Cas13-crRNA 復(fù)合物后，該復(fù)合物會(huì)在靶RNA 鏈3＇端識(shí)別與PAM 類似的前間隔序列側(cè)翼位點(diǎn) （Protospacerflanking site，PFS），激活Cas13 蛋白在crRNA 互補(bǔ)位置外的側(cè)翼序列附近切割靶RNA。據(jù)Abudayyeh 等[53]發(fā)現(xiàn)，Cas13a 復(fù)合物更偏向于在富U區(qū)進(jìn)行非特異性切割。

為了擴(kuò)展CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)在RNA 研究上的應(yīng)用，研究人員對(duì)Cas13a 蛋白的HEPN 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變失活，可以產(chǎn)生無(wú)RNA 核酸酶活性的Cas13a（dead Cas13a，dCas13a）。dCas13a 能夠特異性識(shí)別和結(jié)合靶向RNA 而不進(jìn)行切割，通過(guò)與各種不同功能性蛋白進(jìn)行融合，可實(shí)現(xiàn)RNA 從編輯到修改再到可視化的各種操作[39]。2017年，Smargon 等[59]還發(fā)現(xiàn)另一種同樣具有靶向和編輯RNA能力的蛋白Cas13b。與Cas13a 不同的是，Cas13b發(fā)揮作用需要靶RNA 的兩端均存在PFS 結(jié)構(gòu)，這增加了該系統(tǒng)對(duì)ssRNA 切割的限制條件[60]。

2 CRISPR-傳感器在食源性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，基于CRISPR/Cas 的技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組編輯、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳工程和許多其它領(lǐng)域。CRISPR/Cas 系統(tǒng)之間的多樣性和Cas 蛋白的特異性，使CRISPR/Cas 系統(tǒng)被用作生物傳感器和生物傳感系統(tǒng)開(kāi)發(fā)中的識(shí)別元件。生物傳感器雖具有靈敏、靈活、低成本和快速等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺點(diǎn)，如特異性差。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有可編程、高特異性的誘導(dǎo)切割活性，這為識(shí)別目標(biāo)提供了機(jī)會(huì)，可滿足生物傳感器理想條件下對(duì)目標(biāo)的檢測(cè)。將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與生物傳感器結(jié)合，可利用其獨(dú)一無(wú)二的識(shí)別與切割活性，滿足對(duì)目標(biāo)高特異、高靈敏的檢測(cè)。目前有研究人員對(duì)基于CRISPR/Cas 的生物傳感系統(tǒng)進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)[61]。特別是CRISPR/Cas 技術(shù)對(duì)核酸識(shí)別的特異性與gRNA 設(shè)計(jì)的便捷性，使得該系統(tǒng)在核酸檢測(cè)方面展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿62]。

2.1 基于Cas9 系統(tǒng)檢測(cè)食源性病原體

基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的檢測(cè)大多是利用其對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別與切割作用。Sun 等[63]開(kāi)發(fā)一種由Cas9 觸發(fā)的兩步等溫?cái)U(kuò)增方法，用于大腸桿菌O157：H7 的高靈敏檢測(cè)，如圖2a 所示。利用Cas9（H840A） 對(duì)特異鏈的切割來(lái)取代一些切刻內(nèi)切酶。將兩個(gè)Cas9（H840A）：sgRNA 復(fù)合物識(shí)別并切割靶DNA 的一條鏈缺口，觸發(fā)新鏈在缺口處延伸并置換原始DNA 鏈，進(jìn)行SDA 反應(yīng)。SDA 的產(chǎn)物進(jìn)一步RCA 反應(yīng)以產(chǎn)生長(zhǎng)ssDNA 與熒光探針雜交。使熒光探針離開(kāi)攜帶有猝滅基團(tuán)的UiO66，導(dǎo)致熒光產(chǎn)生。通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)定量檢測(cè)目標(biāo)DNA。該方法能夠檢測(cè)濃度為40 CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7。Wang 等[64]開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單巧妙的Cas9n 的擴(kuò)增反應(yīng)（Cas9nAR）。利用Cas9n 的特異性識(shí)別能力獲得ssDNA，然后進(jìn)行多次引發(fā)、延伸、切刻和置換反應(yīng)，并用SYBR Green I 染料實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Cas9nAR 的進(jìn)程，用強(qiáng)大的熒光信號(hào)反映dsDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的量。該方法將鼠傷寒沙門(mén)氏菌作為靶標(biāo)，通過(guò)高效的指數(shù)擴(kuò)增機(jī)制，在60 min顯示2 copy/反應(yīng)的檢測(cè)限。除了以熒光作為檢測(cè)信號(hào)外，其它可視化手段在CRISPR/Cas9 的基礎(chǔ)上也顯示出良好的應(yīng)用效果。Wang 等[65]以Cas9n觸發(fā)的等溫DNA 擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，以側(cè)向流動(dòng)試紙為檢測(cè)平臺(tái)，利用特異性sgRNAs 和引物，建立一種同時(shí)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的檢測(cè)方法，如圖2b 所示。分別用地高辛/生物素和FITC/生物素標(biāo)記對(duì)基因組DNA 擴(kuò)增子進(jìn)行雙標(biāo)記，使其直接顯示在一個(gè)簡(jiǎn)單的橫向流動(dòng)條上。該方法利用試紙平臺(tái)的擴(kuò)展性，實(shí)現(xiàn)多重目標(biāo)的檢測(cè)，具有較高的特異性和敏感性。對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)限為100 CFU/mL，整個(gè)分析從樣品制備到讀出結(jié)果可在3 h 內(nèi)完成。Moon 等[66]針對(duì)新型冠狀病毒報(bào)道了一種基于CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的比色法，如圖2c 所示。該方法設(shè)計(jì)了能夠與新型冠狀病毒靶RNA 雜交的PAM-mer 序列，并在其3' 端設(shè)置生物素，以允許其與鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，在微孔板上通過(guò)氧化四甲基聯(lián)苯（TMB）胺來(lái)誘導(dǎo)顏色變化，成功實(shí)現(xiàn)了病毒的可視化檢測(cè)。

圖2 基于CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的生物傳感分析[63， 65-66]Fig.2 Biosensing assays based on CRISPR-Cas9 system[63，65-66]

盡管CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已被應(yīng)用于基因編輯與檢測(cè)，還需要2 個(gè)連續(xù)堿基為G 的PAM 序列對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別。這類位點(diǎn)約占基因組的9.9%[67]，在很大程度上限制了CRISPR/Cas9 的應(yīng)用范圍。此外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在使用時(shí)可能產(chǎn)生嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。哈佛大學(xué)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)Cas9 的脫靶效率最高可達(dá)84%[68]，這也是限制其應(yīng)用的一大難題[69]。

2.2 基于Cas12 系統(tǒng)檢測(cè)食源性病原體

基于CRISPR/Cas12 的生物傳感器，利用Cas-crRNA 對(duì)靶序列的識(shí)別以及對(duì)非特異性ss-DNA（用作報(bào)告子）的切割作用，使讀出信號(hào)發(fā)生變化。目前，CRISPR/Cas12 系統(tǒng)與熒光技術(shù)相結(jié)合被用于核酸檢測(cè)，顯示出高靈敏度、強(qiáng)特異性、快速的優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。

Li 等[70]利用Cas12a 的反式切割活性，與擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，建立了CRISPR/Cas12a 的熒光檢測(cè)平臺(tái)，稱為“Cas12aFDet”。該檢測(cè)平臺(tái)可降低被氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，將Cas 體系預(yù)先加在試管蓋中，在擴(kuò)增反應(yīng)后，密封的反應(yīng)管通過(guò)離心將PCR/RAA反應(yīng)與Cas12a 介導(dǎo)的切割反應(yīng)相結(jié)合，利用Cas12a 的裂解活性對(duì)報(bào)告探針進(jìn)行切割，根據(jù)熒光強(qiáng)度在15 min 內(nèi)即可完成對(duì)單增李斯特氏菌的檢測(cè)。Zhang 等[71]發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)還可以識(shí)別新的PAM 序列（UUUN），在此基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)gRNA 即可實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)。該方法同樣為避免氣溶膠污染將Cas 體系與擴(kuò)增體系預(yù)先加在同一試管中，在自制的紫外裝置中可達(dá)到1.02×102拷貝/μL 的檢測(cè)限。如圖3a 所示，Wang 等[72]同樣將PCR 與Cas12 體系集成在特殊的單個(gè)毛細(xì)管中，建立“CRISPCR”方法來(lái)檢測(cè)大腸桿菌。這種單個(gè)毛細(xì)管不僅可以解決CRISPR/Cas 核酸酶的不耐熱問(wèn)題，還使反應(yīng)在不到10 min內(nèi)獲得穩(wěn)定的熒光信號(hào)。除與PCR 方法結(jié)合外，近年來(lái)快速發(fā)展的等溫?cái)U(kuò)增方式也被應(yīng)用于與CRISPR 系統(tǒng)相結(jié)合。Liu 等[73]將RPA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與CRISPR/Cas12a 相結(jié)合，建立“RPA-Cas12a-FS”檢測(cè)平臺(tái)用于檢測(cè)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌。該系統(tǒng)可在37 ℃下45 min 內(nèi)特異性檢測(cè)低至10 拷貝的目標(biāo)基因水平。Mukama 等[74]也將CRISPR/Cas12 和LAMP 技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)一種超靈敏的特異性側(cè)向流動(dòng)生物傳感器（LFB），用于銅綠假單胞菌的檢測(cè)，如圖3b 所示。該方法在純樣品和復(fù)雜樣品中均顯示單拷貝的靈敏性和高特異性。LFB 檢測(cè)試紙使用簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，便攜廉價(jià)。Li 等[75]在建立“Cas12aFDet”后，同年，進(jìn)一步利用Cas12a 的側(cè)裂解誘導(dǎo)信號(hào)變化的特性，將其引入電化學(xué)傳感平臺(tái)，如圖3c 所示。通過(guò)RAA 擴(kuò)增，用修飾在電極上的MB-ssDNA 代替熒光信號(hào)標(biāo)記的信號(hào)探針，對(duì)目標(biāo)引入前、后的MB 信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，檢測(cè)限低至0.68 amol/L。

針對(duì)病毒的檢測(cè)，He 等[76]通過(guò)編程crRNA，使CRISPR/Cas12a 能夠在識(shí)別靶標(biāo)DNA 鏈后，切割熒光探針，達(dá)到對(duì)非洲豬瘟病毒的檢測(cè)。在沒(méi)有核酸擴(kuò)增的情況下，2 h 內(nèi)可獲得1 pmol/L 的檢測(cè)極限，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間還可使檢測(cè)限達(dá)fmol/L 水平。彭小喚[77]應(yīng)用改良的Cas12a 檢測(cè)非洲豬瘟病毒，可在1 h 內(nèi)將檢測(cè)限提高至amol/L 水平。針對(duì)2019年爆發(fā)的新型冠狀病毒，Guo 等[78]構(gòu)建了基于RT-RAA 的CRISPR 系統(tǒng)SARS-CoV-2 的檢測(cè)平臺(tái)，檢出限為1×104拷貝，顯示出良好的特異性。如圖3d 所示，Chen 等[79]報(bào)道了一種基于LAMP 和CRISPR/Cas12a 技術(shù)的無(wú)污染目視檢測(cè)SARS-CoV-2 的方法，通過(guò)智能手機(jī)和便攜式3D打印儀器，產(chǎn)生的熒光不需要任何專用儀器就可用肉眼看到，整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程在40 min 內(nèi)完成，達(dá)到20 拷貝的高靈敏檢測(cè)。Ali 等[80]還將RTLAMP、CRISPR-Cas12 組成的“iSCAN”平臺(tái)與側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合，顯示出與熒光檢測(cè)相同的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了對(duì)新型冠狀病毒快速靈敏檢測(cè)。

圖3 基于CRISPR-Cas12 系統(tǒng)的生物傳感分析[72，74-75，79]Fig.3 Biosensing assays based on CRISPR-Cas12 system[72，74-75，79]

基于CRISPR/Cas12a 的生物傳感器與其它檢測(cè)方法相比，雖具有靈敏度更高，特異性更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但仍有一定的局限性，如不同的擴(kuò)增技術(shù)決定檢測(cè)時(shí)間的長(zhǎng)短；DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移過(guò)程中有氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。盡管有些研究將擴(kuò)增過(guò)程與CRISPR 體系集成于單試管內(nèi)進(jìn)行，研究人員仍需考慮擴(kuò)增體系和Cas12a 切割體系的相容性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.3 基于Cas13 系統(tǒng)檢測(cè)食源性病原體

相比于Cas12 對(duì)靶標(biāo)DNA 的非特異性切割活性，Cas13 同樣具有出色的表現(xiàn)。由于DNA 在微生物細(xì)胞中長(zhǎng)期存在，且無(wú)論其生理?xiàng)l件如何，靶向DNA 的方法很難指示細(xì)菌活性，因此以DNA 為檢測(cè)目標(biāo)的核酸分析方法無(wú)法區(qū)分死菌和活菌，會(huì)使假陽(yáng)性率較高。相比之下，RNA 很容易在死細(xì)菌中快速消化，可被用來(lái)快速指示細(xì)菌的生存狀態(tài)[81]。在食品中致病菌對(duì)人體的危害關(guān)鍵在于其保持一定的生長(zhǎng)活性，從而產(chǎn)生的致病性。對(duì)食品中活的致病菌的檢測(cè)至關(guān)重要。以RNA 為目的靶標(biāo)的Cas13 在食源性致病菌上的檢測(cè)方面具有不可估量的發(fā)展前景。

Zhou 等[82]建立了“CCB-D”的細(xì)菌傳感策略，用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。如圖4a 所示，將nuc基因作為分子標(biāo)記，由PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA （ssRNA），并借助crRNA 的可編程性和Cas13a 附帶的RNase 活性，使FAM 熒光基團(tuán)與BHQ1 熒光基團(tuán)分離，產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光。用該方法成功檢測(cè)到低至1 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌。通過(guò)可靠性、敏感性、特異性和簡(jiǎn)單性的驗(yàn)證，證實(shí)Cas13 在檢測(cè)平臺(tái)具有高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢(shì)。而葛以躍等[83]將CRISPR-Cas13a 系統(tǒng)與RAA 技術(shù)相結(jié)合，建立一種副溶血性弧菌快速檢測(cè)方法（RAA-Cas13a）。將靶核酸進(jìn)行RAA 擴(kuò)增和T7-RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄后，在crRNA 的引導(dǎo)下激活Cas13a 酶的附帶切割活性，切割熒光探針從而釋放熒光信號(hào)。該方法避免了傳統(tǒng)RAA 熒光檢測(cè)使用的合成相對(duì)復(fù)雜的RAA 熒光探針，降低了檢測(cè)難度與成本。整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)需1 h 左右，與實(shí)時(shí)PCR 具有相同的檢測(cè)靈敏度，為10 拷貝/μL。蘇璇等[84]同樣用該方法建立了CRISPR/Cas13a 輔助RAA 方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌，達(dá)到10 CFU/mL的靈敏檢測(cè)。Shen 等[85]基于核酸的變構(gòu)探針和CRISPR/Cas13a 組合，提出一種“APC-Cas”的檢測(cè)系統(tǒng)。用變構(gòu)探針的適體區(qū)域結(jié)合靶標(biāo)，通過(guò)擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得能與Cas13 蛋白結(jié)合的ssDNA，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)大的熒光信號(hào)，可選擇性、敏感地定量檢測(cè)牛奶等各類樣品中的腸炎沙門(mén)氏菌。不同于大多需要轉(zhuǎn)錄步驟的CRISPR 檢測(cè)手段，Zhang等[81]建立了一種可直接靶向檢測(cè)致病菌RNA、無(wú)需逆轉(zhuǎn)錄、PCR 擴(kuò)增和核酸標(biāo)記的檢測(cè)平臺(tái)。如圖4b 所示，利用發(fā)光RNA 適體（Broccoli）-CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)來(lái)分析活蠟樣芽胞桿菌。這種適體不同于其它基于CRISPR/Cas 的分析中使用的化學(xué)合成和修飾的RNA 探針，它可與DFHBI-1T 染料結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)。Broccoli-DFHBI-1T 復(fù)合物在CRISPR/Cas13a 識(shí)別到細(xì)菌RNA 后被Cas13激發(fā)的切割活性剪切，其結(jié)構(gòu)被破壞，無(wú)法維持原有的結(jié)合狀態(tài)，使DFHBI-1T 染料暴露，導(dǎo)致熒光淬滅，以此監(jiān)測(cè)病原菌RNA 的存在。該方法成功地定量分析活菌，檢測(cè)低至10 CFU 的蠟樣芽孢桿菌，并精確定量105個(gè)CFU 總細(xì)菌中的活菌，從而更準(zhǔn)確地估計(jì)蠟樣芽胞桿菌破壞食物的能力。曾紅棱等[86]同樣利用該方法成功實(shí)現(xiàn)食品中單增李斯特菌的檢測(cè)。

對(duì)于病毒的檢測(cè)，F(xiàn)ozouni 等[87]報(bào)告了一種無(wú)擴(kuò)增的CRISPR-Cas13a 分析方法，如圖4c 所示，通過(guò)組合多個(gè)crRNA 來(lái)增加Cas13a 活性，該方法可從鼻拭子中直接檢測(cè)SARS-CoV-2 的RNA，通過(guò)手機(jī)顯微鏡讀取。在30 min 內(nèi)可達(dá)到100 拷貝/μL 的靈敏度，可在5 min 內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出1 組陽(yáng)性臨床樣本中預(yù)先提取的RNA。

圖4 基于CRISPR-Cas13 系統(tǒng)的生物傳感分析[81-82，87]Fig.4 Biosensing assays based on CRISPR-Cas13 system[81-82，87]

目前，利用Cas13 的側(cè)裂解活性在食源性病原體檢測(cè)方面已有較大的進(jìn)展，這一切割活性比基于Cas9 的檢測(cè)更具應(yīng)用價(jià)值。就Cas12 與Cas13 而言，有研究人員對(duì)基于Cas13 與Cas12 檢測(cè)病原體的方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Cas13 活性比Cas12 強(qiáng)，可產(chǎn)生更多的信號(hào)。在靈敏度方面，Cas13a 遠(yuǎn)優(yōu)于Cas12a，使用Cas13a，反式切割信號(hào)可被Cs6 效應(yīng)核酸酶進(jìn)一步放大，從而達(dá)到極高的靈敏度[80]。在應(yīng)用Cas13 的檢測(cè)平臺(tái)時(shí)，需使用RNA 熒光報(bào)告基團(tuán)，其易受環(huán)境中RNA 酶降解，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。同樣也涉及氣溶膠污染而導(dǎo)致的問(wèn)題，需在轉(zhuǎn)移操作步驟中加入石蠟油或礦物油等來(lái)嚴(yán)格控制污染的發(fā)生。此外，檢測(cè)致病菌時(shí)，大多需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使預(yù)處理時(shí)間變長(zhǎng)，可能在一定程度上無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。

3 結(jié)語(yǔ)

自CRISPR 問(wèn)世以來(lái)，作為基因編輯工具的Cas 系統(tǒng)被廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，特別是在基因編輯、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因分型等方面顯現(xiàn)出獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì)。基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的生物傳感器，在檢測(cè)腫瘤、癌癥標(biāo)記物、病毒等方向有了更加深入的研究與應(yīng)用。在病原體的檢測(cè)中，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)快速，使用試劑少，在溫和條件下進(jìn)行，可滿足目前對(duì)即時(shí)檢測(cè)的需求。在過(guò)去的幾年里，基于CRISPR 的生物傳感技術(shù)在核酸檢測(cè)方面顯示出很大的潛力，然而，仍處于起步階段，存在一定的局限性，有待改善與提高，如在實(shí)際操作中容易發(fā)生氣溶膠污染，以及Cas 蛋白對(duì)靶序列的識(shí)別高度依賴PAM 區(qū)等。未來(lái)，研究人員可以進(jìn)一步挖掘其它的新型Cas 蛋白，配合適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法以更好解決目前存在的不足，應(yīng)用新技術(shù)、新平臺(tái)，建立更為簡(jiǎn)單、高效的病原體檢測(cè)方法?？傊?，將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與生物傳感器技術(shù)結(jié)合作為檢測(cè)手段，為食源性病原體的檢測(cè)提供了新思路、新方法。該技術(shù)還可用于控制食品從生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、貯存、口岸通關(guān)到銷售和消費(fèi)各個(gè)環(huán)節(jié)的生物性風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，更大程度地保證食品質(zhì)量安全。