優(yōu)化乳桿菌高產(chǎn)共軛亞油酸的研究進(jìn)展

成曉艷，張丁潔，田艾迪，劉 瑛，陳佳璐，陳瑩瑩，洛 雪

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽 110866）

共軛亞油酸 （Conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸（Linoleic acid，LA）的一組位置和空間異構(gòu)體的總稱，近年來，大量研究報(bào)道CLA 具有抗癌、抗動脈硬化癥、減肥、提高機(jī)體免疫等功效[1-2]。人們最早了解亞油酸異構(gòu)酶（LAI）是通過反芻動物瘤胃溶纖丁酸弧菌 （Butyfivibfio flbfisolvens）中的LAI 將LA 催化為CLA[3-4]。在CLA 異構(gòu)體中，真正具有生理活性的只有順-9，反-11 和反-10，順-12-CLA 兩種[5-6]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。由于瘤胃溶纖丁酸弧菌在多不飽和脂肪酸生物氫化的過程中產(chǎn)生的cis-9，trans-11 CLA 較少，因此探究如何提高CLA 的產(chǎn)量成為研究重點(diǎn)。

圖1 c9，t11-CLA 和t10，c12-CLA 結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of c9，t11-CLA and t10，c12-CLA

工業(yè)上合成CLA 的方法大多采用化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成法操作簡捷，產(chǎn)量較高，然而生產(chǎn)得到的產(chǎn)物多為混合物，存在多種CLA 的異構(gòu)體，分離純化相對困難，且含有有毒物質(zhì)，對食品工業(yè)造成負(fù)面影響[7]。許多科學(xué)家致力于研究生物合成法生產(chǎn)CLA。LAI 具有專一性，在LAI 催化下，LA 的轉(zhuǎn)化程度遠(yuǎn)高于其它脂肪酸。動物瘤胃溶纖丁酸弧菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌及痤瘡丙酸桿菌等細(xì)菌能夠使游離的LA 轉(zhuǎn)化為CLA，在培養(yǎng)基中加入底物L(fēng)A，可顯著提高CLA 的轉(zhuǎn)化率。如表1所示，不同類型菌種的底物及其添加量各不相同，合成CLA 的能力也不同。

表1 不同類型菌種合成CLA 的能力Table 1 The ability of different types of strains to synthesize CLA

雖然生物法能夠合成單一的CLA，作用條件溫和，但是其產(chǎn)量還是比較低，而且不同的菌株對應(yīng)不同的反應(yīng)機(jī)制，因此優(yōu)化產(chǎn)LAI 的條件是高產(chǎn)CLA 的重要途徑[8]。本文概述了近年來利用誘變技術(shù)及基因工程技術(shù)生產(chǎn)和改造LAI，進(jìn)而提高CLA 含量的相關(guān)研究。

1 利用物理方法提高CLA 的產(chǎn)量

在多數(shù)研究中，通過自然方法篩選獲得的菌株，產(chǎn)LAI 能力有限，因此利用如誘變技術(shù)來提高菌株產(chǎn)酶能力是常用的方法[9]。紫外誘變（Ultraviolet mutagenesis，UV mutagenesis）、低溫等離子體誘變（Low temperature plasma mutagenesis）、常溫常壓等離子體誘變 （Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）等技術(shù)，可誘變LAI 產(chǎn)生菌，促使菌株高產(chǎn)LAI，從而提高CLA 的轉(zhuǎn)化率，并對該誘變菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，提高CLA 產(chǎn)量。

1.1 紫外或微波誘變

紫外線在260 nm 波長下的輻射致死量最優(yōu)，紫外誘變在微生物菌種的誘變研究中較常見，也是應(yīng)用較為廣泛的方法[10]。紫外輻射可以引起堿基轉(zhuǎn)換、顛倒互換、移碼突變或缺失。紫外線能量低，對遺傳物質(zhì)造成的傷害小，同時(shí)，操作方法簡單安全，誘變效率較高，而且誘變后產(chǎn)生的突變性狀在無光照條件下不容易恢復(fù)，因此紫外誘變技術(shù)較廣泛地應(yīng)用于菌種誘變研究[11]。微波誘變是一種低能電磁輻射，它能夠?qū)ι矬w產(chǎn)生熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，引起生物體局部溫度上升，產(chǎn)生生化反應(yīng)的便是熱效應(yīng)；而非熱效應(yīng)產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)與溫度無關(guān)[12]。

近些年，關(guān)于紫外線誘變，崔瑋等[13]以嗜酸乳桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)15 W 紫外線2 次誘變，得到1 株CLA 高產(chǎn)菌株，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，誘變菌株酶活比原始菌株提高了1.51 倍；對培養(yǎng)基的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化后，酶活提高了1.1 倍。曹健等[14]采用紫外誘變，在35 ℃，pH 4.0 條件下，保溫48 h，CLA 的產(chǎn)率達(dá)38.1%，之后用超聲波處理細(xì)胞后，CLA 的產(chǎn)率也有顯著提高。此外，柯薇等[15]采用微波間歇誘變的物理誘變方法以乳酸桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變后，篩選得到5 株正突變菌株，其中CLA 產(chǎn)量最高為L4，較誘變前提高了41.4%。

綜上，經(jīng)過適當(dāng)條件的紫外線誘變，可有效提高出發(fā)菌株產(chǎn)CLA，LAI 酶活也相對提高，并且利用超聲波、微波進(jìn)行微生物誘變，對LAI 活性也有較明顯的提高效果。

1.2 等離子體誘變

等離子體誘變是近年來新興的誘變技術(shù)，在誘變育種過程中采用等離子體誘變的方法，既解決了化學(xué)誘變高污染和突變單一等缺點(diǎn)，又彌補(bǔ)了物理誘變遺傳不穩(wěn)定，突變率不高等缺陷。而且與離子注入誘變法相比，等離子體誘變技術(shù)不會因真空產(chǎn)生的低溫或由離子束產(chǎn)生的高溫而使細(xì)胞失活，該誘變技術(shù)可以在較大程度上提高細(xì)胞存活率及誘變效率[16]。在微生物的誘變應(yīng)用中，主要有低溫等離子誘變和常溫常壓等離子誘變[17-18]。

1.2.1 低溫等離子體誘變 低溫等離子體誘變技術(shù)是通過中性活性粒子來改變微生物遺傳特性的，可直接改變核苷酸水平的分子結(jié)構(gòu)，也可作用于細(xì)胞而間接影響胞內(nèi)遺傳物質(zhì)[19-20]。如孫麗慧等[21]從東北酸菜汁中獲得菌株SC-05，經(jīng)低溫等離子體處理后，篩選得到突變株A-08，其CLA 產(chǎn)量達(dá)到119.24 μg/mL，比出發(fā)菌株增加了83.0%，經(jīng)傳代培養(yǎng)后突變株A-08 的遺傳性狀具有較好的穩(wěn)定性。隨后王慶山[22]將突變株A-08 的培養(yǎng)基利用單因素及響應(yīng)面法進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)量增加了64.60%，發(fā)酵罐采用批式發(fā)酵和批式流加發(fā)酵的方式進(jìn)行培養(yǎng)，CLA 的產(chǎn)量達(dá)到了213.26 μg/mL。由此可見，采用LTP 誘變出發(fā)菌株，改變其遺傳特性，并將其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到的CLA 產(chǎn)量顯著提高。

1.2.2 常溫常壓等離子體誘變 ARTP 誘變作為新的誘變技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于真菌、細(xì)菌、微藻等微生物的基因改良[23-25]，ARTP 工作溫度低、操作簡單、成本低、安全無毒，而且誘變效率高于常見的誘變方法，比如紫外線輻射或化學(xué)誘變劑誘變。與其它誘變方法相比，ARTP 突變具有更大的DNA 損傷和更高的突變率，且突變菌株遺傳穩(wěn)定性好、無污染[26-27]，ARTP 誘變的基本流程如圖2所示。

圖2 ARTP 誘變基本流程圖Fig.2 Basic flow chart of ARTP mutation

ARTP 技術(shù)在其它菌種誘變應(yīng)用比較廣泛，如Liu 等[28]為獲得高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株，對枯草芽孢桿菌進(jìn)行了ARTP 處理，結(jié)果表明，該菌株在誘變時(shí)間為50 s 時(shí)，有較高的正突變率，最終經(jīng)ARTP反復(fù)誘變獲得高產(chǎn)突變株A59，酶活力由6 835 U/mL 提高到8 433 U/mL，提高了23.38%，最終A59菌株的酶活達(dá)14 026 U/mL，是原菌株的2.05 倍；Qiu 等[29]利用ARTP 技術(shù)誘變蠟樣芽胞桿菌以提高QCG 菌株的1-萘酚產(chǎn)量，經(jīng)誘變后該菌株比原菌株增產(chǎn)47.32%。Cheng 等[30]利用ARTP 誘變得到了高產(chǎn)L-蘇氨酸的抗噬菌體大腸桿菌突變株，其L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌株提高10.9%。而在ARTP 誘變提高LAI 產(chǎn)量的研究中，張珂等[31]對嗜酸乳桿菌進(jìn)行ARTP 多輪誘變處理，篩選出1株LAI 高產(chǎn)突變菌株B5，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)對其突變株生長條件進(jìn)行優(yōu)化后，LAI 產(chǎn)量達(dá)到1 214.1 U／mL，是原始菌株的2.84 倍。

除了單一利用ARTP 誘變技術(shù)來誘變微生物之外，近年來科研人員還將ARTP 與其它技術(shù)相結(jié)合[32]，以復(fù)合誘變的方法應(yīng)用于微生物生產(chǎn)中，如EMS-ARTP 技術(shù)結(jié)合誘變選育高產(chǎn)DHA 裂殖壺菌[33]、ARTP-NTG 聯(lián)合選育得到高產(chǎn)中性蛋白酶菌株[34]、ARTP 與微生物微滴培養(yǎng)（MMC）技術(shù)培養(yǎng)篩選幾丁質(zhì)脫乙?；父弋a(chǎn)菌株[35]、ARTP-DES結(jié)合連續(xù)誘變選育高產(chǎn)ε-聚賴氨酸突變株[36]、ARTP-EMS 聯(lián)合多重誘變有效地提高了草酸青霉粗淀粉降解酶的產(chǎn)量[37]、ARTP-UV 復(fù)合誘變選育高性能綠僵菌菌株[38]、ARTP 與5-溴尿嘧啶復(fù)合誘變選育腺苷高產(chǎn)菌株[39]等。復(fù)合誘變相應(yīng)的出發(fā)菌株，最終得到的正突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于負(fù)突變率，且高于運(yùn)用單一誘變方法的突變率，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，其突變菌株的遺傳性狀也是穩(wěn)定的。由此可知，復(fù)合誘變能夠形成更豐富的突變位點(diǎn)，為以后產(chǎn)生研究所需要的基因性狀提供有效、快捷的方法。

2 利用化學(xué)方法提高CLA 的產(chǎn)量

2.1 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是對菌株使用某些化學(xué)試劑處理，使其直接與菌株DNA 分子鏈上的堿基發(fā)生作用，從而使菌株產(chǎn)生可遺傳的變異，提高菌株突變率。常用的誘變劑主要有烷化劑、堿基類似物和無機(jī)化合物。而烷化劑在微生物變異中應(yīng)用最為廣泛[40]，常見為甲基磺酸乙酯（EMS）[41]、亞硝基胍（NTG）[42]、乙烯亞胺（EI）[43]、硫酸二乙酯（DES）[44]等，其中NTG 作為一種超強(qiáng)誘變劑，是公認(rèn)效果顯著的化學(xué)超誘變劑[34]。

科研人員利用化學(xué)誘變劑，以及物理與化學(xué)方法結(jié)合的方式對菌種進(jìn)行誘變，然而多數(shù)研究表明，物理化學(xué)復(fù)合誘變獲得CLA 突變菌株的效果更好。如甄妮[45]以德氏乳桿菌為出發(fā)菌株，采用紫外和DES 復(fù)合誘變的方法，獲得D-2-2 CLA高產(chǎn)菌株的突變菌株，產(chǎn)量達(dá)0.210 mg/mL，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化后達(dá)0.267 mg/mL，再將CLA 菌株生長條件優(yōu)化后，其產(chǎn)量提高到0.292 mg/mL，且突變菌株高產(chǎn)特性能夠穩(wěn)定遺傳。而在之前相關(guān)研究中，王璟等[46]以植物乳桿菌為出發(fā)菌株，利用紫外和DES 復(fù)合誘變的方法，加入0.1%的高濃度LA 初篩后，再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，最終得到L.pian H3-1 突變株，其CLA 產(chǎn)量高達(dá)0.3067 mg/mL，較出發(fā)菌株提高264.5%。吳榮榮等[47]利用2 株嗜酸乳桿菌HS111 和HS112 經(jīng)紫外和NTG 復(fù)合誘變處理后，HS111 的CLA 產(chǎn)量共提高了19 μg/mL，而HS112 提高了27.7 μg/mL。結(jié)果表明，2 株嗜酸乳桿菌經(jīng)復(fù)合誘變CLA 產(chǎn)量都明顯提高，然而不同種類的嗜酸乳桿菌，產(chǎn)CLA 的能力也有差異。

采用單一的物理誘變或者單一的化學(xué)誘變可能得到比較單一的突變體，最終產(chǎn)CLA 的效果也不夠好，而采用物理與化學(xué)復(fù)合誘變的方法[48]，能夠有效彌補(bǔ)單一誘變的缺陷，從而有效提高菌株的突變率，進(jìn)而提高CLA 產(chǎn)量。

2.2 離子注入

離子注入誘變法是離子在真空環(huán)境中被加速和篩選，帶有相同能量的離子被導(dǎo)入反應(yīng)室，離子和目標(biāo)物開始一系列的物理和化學(xué)的相互作用[49]，其中N-離子束誘變是其最常見的方法。N-離子束誘變技術(shù)具有突變譜寬、突變率高、重復(fù)性好、易于獲得理想變異菌株等特點(diǎn)[50-52]。

在多數(shù)研究中，研究人員以植物乳桿菌作為出發(fā)菌株，利用N-離子束將其誘變，以達(dá)到菌株高產(chǎn)CLA 的目的。如蔡玉華[53]以植物乳桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)N-離子束注入并反復(fù)誘變，得到突變菌株ANLP 的CLA 量由出發(fā)菌株的33.04 μg/mL提高到103.26 μg/mL，而且突變株遺傳性狀穩(wěn)定。慈志敏等[54]對植物乳桿菌P8 采用N-離子束注入法進(jìn)行誘變處理，結(jié)果表明，P8 經(jīng)N-離子束誘變，得到產(chǎn)CLA 正突變菌株共36 株，最高CLA 質(zhì)量濃度為0.2751 mg/mL，轉(zhuǎn)化率為27.51%；負(fù)突變菌株共66 株，最低CLA 質(zhì)量濃度為0.0330 mg/mL，轉(zhuǎn)化率為3.30%。之后陳麗娟等[55]對植物乳桿菌ANCLA01 進(jìn)行N-離子注入，結(jié)果顯示，N-離子注入使其CLA 產(chǎn)量從33.44 μg/mL 提高到66.67 μg/mL，且經(jīng)5 次傳代培養(yǎng)后突變菌株產(chǎn)CLA 也很穩(wěn)定。王婧波[56]以植物乳桿菌LL-ZSDS001 菌株為原始菌株，進(jìn)行銫137γ-射線輻照和N-離子束誘變共同處理，最終誘變得到CLA產(chǎn)量為118.921 μg/mL，比原始菌株54.234 μg/mL提高了119.27%。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，離子注入誘變技術(shù)能夠有效提高乳桿菌CLA 的產(chǎn)量，而單一利用離子注入法提高的程度有限，將輻照或其它方法與離子注入相結(jié)合，進(jìn)行出發(fā)菌株的誘變，其產(chǎn)CLA 的能力也會有所改變。

3 利用基因工程技術(shù)提高CLA 的產(chǎn)量

為提高出發(fā)菌株CLA 的產(chǎn)量，隨著生物合成及誘變技術(shù)的不斷發(fā)展，近幾年通過基因工程技術(shù)對生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造[57]，例如菌株能夠通過基因重組獲得新的遺傳型及具有優(yōu)良性狀的高產(chǎn)工程菌株，或者通過微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種。基因工程育種是按照人們意愿，對目的菌株的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)以得到所希望的性狀，是真正意義上的理性選育[58]。

3.1 基因定點(diǎn)突變

基因定點(diǎn)突變是指通過PCR 等方法向目的DNA 片段中引入所需變化[59]，包括堿基的增加、刪除、易位、點(diǎn)突變等，其原理圖如圖3所示。定點(diǎn)突變能快速篩選目的蛋白所表達(dá)的性狀，將定點(diǎn)突變技術(shù)應(yīng)用于LAI 基因構(gòu)建中是有效的手段[60-61]。

圖3 定點(diǎn)突變原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of mutation principle

研究表明LAI 可以催化LA 轉(zhuǎn)化為CLA，然而在研究過程中發(fā)現(xiàn)有些菌種屬于厭氧菌或兼性厭氧菌，不利于大規(guī)模產(chǎn)酶培養(yǎng)且生長緩慢，于是構(gòu)建基因工程菌來表達(dá)LAI 就成為生產(chǎn)CLA 的又一重要途徑[62]。黃亮等[63]對嗜酸乳桿菌的LAI 基因進(jìn)行體外定向進(jìn)化，成功構(gòu)建基因突變文庫后，通過IPTG 誘導(dǎo)基因表達(dá)后，最終篩選出1 株重組菌LI-mut2，測定其LAI 活力為8.2 U，嗜酸乳桿菌LAI 活力為17.3 U，可見測得的酶活性并不高，還需進(jìn)一步探索LAI 活力快速測定的方法。劉海霞[64]以植物乳桿菌P8 基因組為模板，構(gòu)建重組菌pQE30-LAI，經(jīng)過LAI 基因序列比對分析，將193 位苯丙氨酸定為突變位點(diǎn)，改變578 位堿基T為C，成功構(gòu)建了突變體pQE30-F193LAI，結(jié)果表明突變體表現(xiàn)出了酶活被破壞的特性，然而將表達(dá)的野生型和突變型的酶提取后檢測發(fā)現(xiàn)兩者有相同的條帶，說明LAI 均得到表達(dá)。賈麗[65]對5 個(gè)LAI 活性位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變研究，且都能夠成功構(gòu)建突變體，最終結(jié)果表明，與野生型LAI 相比，突變體G68A-LAI 幾乎喪失酶活力，突變體R107L-LAI 的酶活力上升，而突變體H172P-LAI的酶活力下降，從而初步確定第68 位、第107 位和172 位均為LAI 的必需氨基酸。時(shí)旭[66]將植物乳桿菌HAC01 和痤瘡丙酸桿菌的LAI 基因成功克隆，結(jié)果顯示pCold-gfp-yclai-p 重組菌產(chǎn)量最高的為39 號菌，CLA 產(chǎn)量為（11.6186±0.0036）μg/mL，較未突變株提高了3.99 倍。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，改變引物中的某些堿基而改變基因序列，進(jìn)行定點(diǎn)突變，而以PCR 為介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變?yōu)榛蛐揎?、改造提供了另一條途徑[67]，進(jìn)而得到LAI 重組菌株，同時(shí)較有效地提高了LAI 的酶活力。

3.2 基因重組

基因重組法也稱體外重組DNA 方法，經(jīng)過體外剪切、拼接，再將菌株的遺傳物質(zhì)重新組合在一起，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使目的基因在受體中表達(dá)，生產(chǎn)人類所需要的物質(zhì)或生物種類，以達(dá)到定向改變生物性狀的目的[68]，其原理圖如圖4所示。體外重組DNA 方法廣泛應(yīng)用于生物界的遺傳工程中，在生物制藥、植物抗病蟲害以及各理論研究方面都有廣泛的應(yīng)用，是一項(xiàng)新潮技術(shù)[69]。

圖4 基因重組原理圖Fig.4 Schematic diagram of gene recombination

基因重組技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌基因的改造，以期獲得具有優(yōu)良遺傳特性的新菌株，其獲得的重組菌株經(jīng)過相應(yīng)分離、純化，進(jìn)而提高LAI 的酶活。李晨曦[70]通過PCR 擴(kuò)增得到植物乳桿菌P-8來源的LAI 基因，連接至表達(dá)載體pKLAC1 上，轉(zhuǎn)化至乳酸克魯維酵母菌CICC 中，測序鑒定，成功構(gòu)建了表達(dá)LAI 的酵母基因工程菌，經(jīng)SDSPAGE 為單一條帶，測得酶活為（9.10±0.01）×103U/mL，并對影響酶活的各因素進(jìn)行優(yōu)化，其中影響最大的為pH、時(shí)間、溫度。劉曉華等[71]提取了從黃牛瘤胃中分離得到的1 株干酪乳桿菌Fx 的基因組DNA，經(jīng)擴(kuò)增及克隆后將得到的重組質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-LAI，經(jīng)PCR 鑒定和酶切后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 中，得到具有LAI 活性的重組菌株，且能夠特異性合成c9，t1l-CLA，表明從出發(fā)菌株Fx 成功克隆LAI，且合成不同CLA 異構(gòu)體的LAI存在特異性，經(jīng)定量測定，酶活力最大可達(dá)206 U/mL。洛雪等[72]將痤瘡丙酸桿菌的LAI 基因擴(kuò)增到大腸桿菌中表達(dá)，分離純化上清液中的LAI 后檢測到該蛋白分子質(zhì)量為55 ku，電泳得到的條帶大小與LAI 大小相符，氣相色譜檢測該蛋白催化生成t10，c12-CLA，且酶活為（34.775±0.07）U/mL。

經(jīng)過基因重組技術(shù)能夠成功構(gòu)建具有LAI 活性的重組菌株，且能特異性合成CLA 異構(gòu)體c9，t1l-CLA、t10，c12-CLA，進(jìn)而有效提高LAI 酶活，并對影響酶活的各因素進(jìn)行優(yōu)化，最終能夠較好達(dá)到提高CLA 產(chǎn)量的效果，是一直以來研究的重要方向。

3.3 基因敲除

基因敲除技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)，是用含有一定已知序列的DNA 片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得到表達(dá)的一種外源DNA 導(dǎo)入技術(shù)[73]。CRISPR-Cas9 是基因編輯的主要表現(xiàn)形式，它能夠通過DNA 剪接技術(shù)選擇性敲除特定蛋白的基因，是對靶向基因進(jìn)行特定DNA 修飾的技術(shù)，其原理圖如圖5所示?；蚯贸槍δ硞€(gè)序列已知而功能未知的序列，通過改變生物的遺傳基因，進(jìn)而對生物體造成影響，最終推測出該基因的生物學(xué)功能，是微生物功能基因組學(xué)研究的有力工具之一[75]。

圖5 CRISPR-Cas9 基因敲除原理圖Fig.5 Schematic diagram of CRISPR-Cas9 gene knockout

基因敲除技術(shù)采用逆向思維，利用同源重組的方法敲除目的基因，使被研究的基因功能完全失活，從而推測該基因在整個(gè)過程中所起的作用[76]，李婭妮等[77]在植物乳桿菌P8 的基礎(chǔ)上，分別在LAI 基因的上游和下游序列設(shè)計(jì)了2 對引物，擴(kuò)增出LAI 基因上下游序列的同源臂，成功構(gòu)建敲除載體pUC18△LAI 以敲除LAI 基因，同時(shí)添加抗性篩選標(biāo)記來快速篩選缺失菌株。倪麗娟[78]成功構(gòu)建了LAI 單基因敲除菌株和雙基因敲除菌株，對比其t10，c12-CLA 降解率，PEX10 降解率最低，穩(wěn)定CLA 產(chǎn)量效果最佳。隨即以PEX10 為出發(fā)菌株，構(gòu)建LAI 多拷貝整合菌株，并篩選得到1株高產(chǎn)t10，c12-CLA 的菌株P(guān)EX10/1292，產(chǎn)量為22.3 mg/L。之后添加紅花籽油優(yōu)化培養(yǎng)，結(jié)果顯示t10，c12-CLA 總產(chǎn)量提高到7.6 g/L，是單拷貝菌株的2 倍，且降解率為23.0 mg/L/h，敲除菌株對穩(wěn)定CLA 產(chǎn)量非常有效。

由此看出，基因敲除在一定程度上避免了質(zhì)粒整合產(chǎn)生的影響，也能夠?qū)Φ孜風(fēng)A 的降解起到緩解作用，同時(shí)也將為有效地提高CLA 產(chǎn)量提供幫助，為工業(yè)化生產(chǎn)CLA 提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高CLA 產(chǎn)量

在CLA 的生產(chǎn)與應(yīng)用中，其菌株產(chǎn)酶條件及培養(yǎng)基的優(yōu)化必不可少。通過優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件及培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基條件來提高CLA 的產(chǎn)量是最基本的，也是最便捷的方法。除此之外，一些金屬離子也對CLA 的合成有顯著影響。

羅玉芬[79]在泡菜中篩選得到1 株CLA 產(chǎn)量較高的明串珠菌QL2，對其發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)酵液中CLA 產(chǎn)量由原來的23.263 μg/mL提高到37.831 μg/mL，LA 轉(zhuǎn)化率提高到6.31%，是未優(yōu)化前的1.63 倍。接著對菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，CLA 產(chǎn)量達(dá)到40.953 μg/mL，LA 轉(zhuǎn)化率提高到6.83%，是先前的1.08 倍。Zeng 等[80]采用尿素一步絡(luò)合法對黃油中c9，t11-CLA 的富集條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終測定生產(chǎn)中c9，t11-CLA 的純度為22.55%，c9，t11-CLA 和t10，c12-CLA 的濃度由原來的17.8 mg/g 和1.02 mg/g FA 分別提升到225.5 mg/g 和13.11 mg/g FA。許媛等[81]采用尿素包合法和響應(yīng)面優(yōu)化法對CLA 的2 種異構(gòu)體進(jìn)行分離，結(jié)果顯示所得樣品中t10，c12-CLA 與c9，t11-CLA 的比值高達(dá)2.47，且共軛亞油酸總量為97.3%，有效提高了CLA 的產(chǎn)量。劉華鼐等[82]利用響應(yīng)面優(yōu)化茶籽油制備CLA 的生產(chǎn)工藝條件，分離純化后茶油的CLA 純度從53.45%提高到了90.4%。Saber 等[83]采用Box-Behnken 和組合設(shè)計(jì)，建立了乳酸雙歧桿菌BB12、嗜酸乳桿菌LA5及其共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化CLA 的預(yù)測模型。結(jié)果表明，在最佳條件下，乳酸雙歧桿菌BB12 和嗜酸乳桿菌LA5 生物合成CLA 的量分別為（110.03±4.58）μg/mL 和（82.42±3.66）μg/mL，可見純?nèi)樗犭p歧桿菌BB12 和嗜酸乳桿菌LA5 具有良好的產(chǎn)生物活性CLA 的能力，而乳酸雙歧桿菌BB12 產(chǎn)生的CLA 能力要高于嗜酸乳桿菌LA5。?zer 等[84]在植物乳桿菌AB20-961 和植物乳桿菌DSM 2601 生產(chǎn)的半干發(fā)酵香腸中優(yōu)化其發(fā)酵條件，以此獲得最高含量的CLA，發(fā)酵后植物乳桿菌AB20-961和DSM2601 生產(chǎn)的香腸中CLA 含量分別為4.15 mg/g 脂肪和7.54 mg/g 脂肪，且用植物乳桿菌DSM2601 生產(chǎn)的香腸，發(fā)酵后的CLA 含量比之前測定的CLA 含量增加了121%。曹健等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Na+、Fe2+、Mg2+有助于提高CLA 的產(chǎn)量，相反Hg2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+不利于共軛亞油酸的合成。苗世達(dá)等[85]由植物乳桿菌L-29 分離純化得到LAI，分子質(zhì)量達(dá)43 ku；對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，溫度在37 ℃，pH 6.0 時(shí)，酶活性較高；Co2+、Fe2+可提高酶的活性，而Cu2+、Zn2+則對酶活力有抑制作用。

由此可見，將培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基成分，如碳源、氮源等比例進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化，其CLA 產(chǎn)量會明顯提高，在此基礎(chǔ)上，若將菌株的產(chǎn)酶條件，如發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時(shí)間以及底物添加量等加以優(yōu)化，及添加Na+、Fe2+、Mg2+等化學(xué)元素也能夠有效提高LAI 的活性，顯著提高了CLA 產(chǎn)量。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，對不同乳桿菌產(chǎn)CLA 的優(yōu)化條件進(jìn)行了對比總結(jié)，如表2所示。

表2 不同菌種產(chǎn)CLA 的基本優(yōu)化條件對比Table 2 Comparison of basic optimization conditions for CLA production by different strains

5 總結(jié)與展望

隨著人們生活水平的日益提高及健康意識的逐漸提高，由于CLA 具有抗癌、抗動脈硬化癥、減肥、提高機(jī)體免疫等重要的生理功能，其市場需求量將會持續(xù)增加，天然來源的CLA 遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了人們的需求[86]，而傳統(tǒng)獲取CLA 的方法缺陷較多，如化學(xué)合成法生產(chǎn)得到的產(chǎn)物存在CLA 的異構(gòu)體種類較多，分離純化相對困難，而且可能存在有毒物質(zhì)；生物合成法較化學(xué)合成法能夠單一合成CLA，然而其產(chǎn)量不高，故傳統(tǒng)方法不是長期穩(wěn)定生產(chǎn)CLA 的最優(yōu)途徑。于是研究人員近年來利用新興技術(shù)，例如：物理誘變、化學(xué)誘變、離子注入和等離子體誘變等誘變技術(shù)，以及利用基因工程的方法對原菌株的LAI 基因組進(jìn)行改造，重新構(gòu)建LAI 基因整合菌株來提高CLA 的產(chǎn)量。通過研究發(fā)現(xiàn)，誘變技術(shù)可以有效提高CLA 的產(chǎn)量，然而采用單一的誘變方法可能得到的突變體比較單一，最終產(chǎn)CLA 的效果也不夠理想，而采用復(fù)合誘變的方法，能夠有效彌補(bǔ)這一的缺陷，從而有效提高菌株的突變率，進(jìn)而提高CLA 產(chǎn)量。基因工程技術(shù)通過重新構(gòu)建LAI 基因突變文庫，改造菌株的性能，使菌株能夠高產(chǎn)CLA。在此基礎(chǔ)上，將得到誘變或重新構(gòu)建的菌株的培養(yǎng)基條件或者產(chǎn)酶條件加以優(yōu)化，其CLA 產(chǎn)量會得到更大的提高。在今后CLA 的研究中應(yīng)順應(yīng)時(shí)代發(fā)展，提高生產(chǎn)CLA 過程的安全性，著重研究通過提高LAI的活性來提高CLA 的產(chǎn)量，同時(shí)也要注重生產(chǎn)CLA 的新技術(shù)的開發(fā)與研究。