Caco-2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)食品功能因子的吸收、代謝及其功能研究進(jìn)展

楊夢(mèng)雨，鐘 浩，楊 開，孫玉敬，劉曉鳳，關(guān)榮發(fā)

（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 杭州 310014）

如果一種食物被證明能夠有利于身體的1 個(gè)或多個(gè)目標(biāo)功能，且不僅具有足夠的營(yíng)養(yǎng)效果，而且與改善健康和福祉或降低患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，那么它就可以被視為“功能性”[1]。食品功能性成分是正常飲食的一部分，它們不是藥物或其它膳食補(bǔ)充劑，功能性食品之所以能發(fā)揮功效，均來源于其豐富的活性成分[2]。近年來，食品工業(yè)中功能性食品的開發(fā)和商業(yè)化趨勢(shì)日益高漲，功能性食品提取物（如蘋果皮、黑胡蘿卜、米糠）正被用于藥代動(dòng)力學(xué)研究和臨床實(shí)踐[3]。這些物質(zhì)能否在人體內(nèi)產(chǎn)生功效，首先在于它們能否被充分吸收利用。然而，由于功能性食品提取物分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、理化性質(zhì)特殊，受到人體發(fā)育屏障的限制，阻礙了這些功能性食品提取物的吸收，因此，研究這些功能性食品提取物的吸收代謝機(jī)制，及其在人體內(nèi)的作用方式勢(shì)在必行。

Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)模型，人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，被廣泛用于評(píng)估Caco-2 細(xì)胞對(duì)藥物和化學(xué)物質(zhì)的攝取和生物利用的有效性。在體外培養(yǎng)過程中，形成單細(xì)胞層后，自發(fā)地進(jìn)行上皮樣分化，具有微絨毛結(jié)構(gòu)、刷狀邊緣以及細(xì)胞間緊密連接等類似于人類小腸黏膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，可以模擬體外培養(yǎng)的人腸上皮的結(jié)構(gòu)和功能[4-6]。Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)模型在研究營(yíng)養(yǎng)素或藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝方面都極為重要，在功能性食品中也得到廣泛的應(yīng)用。然而，Caco-2 細(xì)胞模型與人類上皮細(xì)胞存在差異。例如，Caco-2 細(xì)胞模型的細(xì)胞旁途徑滲透率低于人類上皮，由于缺乏足夠的黏液層，很容易允許高度擴(kuò)散的小分子通過微絨毛滲透[7]。近年來，多方機(jī)構(gòu)和人員在原始的模型基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)，建立了新的Caco-2 模型，例如：加速Caco-2 滲透性模型[8]、TC-7 細(xì)胞模型[9]以及包含75%Caco-2 細(xì)胞和25%HT29-5 M21 細(xì)胞的共培養(yǎng)體系[10]。這些模型雖然對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗會(huì)有所增加，但是對(duì)生物有效性的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度得到提升。

一般來說，Caco-2 細(xì)胞在培養(yǎng)后7 d 開始分化，分化完成約21 d。短期培養(yǎng)獲得的未分化Caco-2 細(xì)胞通常用于研究活性成分的抗癌或抗氧化活性，而分化后的Caco-2 單層細(xì)胞由于形態(tài)、標(biāo)志酶的表達(dá)，以及與人小腸相似的通透性特征而被用于體外模擬腸道[11]。此外，由于分子生物學(xué)的發(fā)展，分化的Caco-2 細(xì)胞模型得到極大的發(fā)展。例如，用微流控細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立2D 或3D細(xì)胞模型、共培養(yǎng)模型等[12-14]。這不僅克服了傳統(tǒng)模型的局限性，而且進(jìn)一步拓寬了食品因素與腸道相互作用的應(yīng)用范圍。本文綜述功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞模型上的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和功能評(píng)價(jià)等方面，以及Caco-2 模型的培養(yǎng)方法和共培養(yǎng)研究進(jìn)展，概括功能性提取物在Caco-2 模型中的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功能性機(jī)制，以及應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。

1 Caco-2 細(xì)胞分化模型建立

1.1 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.1.1 在普通平板培養(yǎng)皿上培養(yǎng)Caco-2 細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞在用于研究吸收代謝機(jī)制和功能評(píng)價(jià)之前，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。一般在37 ℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中，于含有不同濃度和比例的胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素等培養(yǎng)液的MEM（低限量Eagle 培養(yǎng)基）或DMEM（Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基） 上生長(zhǎng)，在培養(yǎng)瓶中傳代20～60 代，細(xì)胞融合80%～90%。據(jù)各項(xiàng)研究表明[15-16]，Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)分為以下步驟：

1） 培養(yǎng)液與緩沖溶液的配制 培養(yǎng)液用MEM 或DMEM，緩沖液用標(biāo)準(zhǔn)Hanks 平衡鹽溶液（HBSS）和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化液。

2） 細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮罐中取出細(xì)胞冷凍管，解凍后離心，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

3） Caco-2 細(xì)胞的傳代 細(xì)胞生長(zhǎng)到高密度時(shí)，需要分至新的培養(yǎng)瓶中，加入消化液漂洗細(xì)胞后，置于37 ℃消化，終止消化后，用吸管吹打脫壁，將細(xì)胞分瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4） Caco-2 細(xì)胞的凍存 加入適量?jī)龃媾囵B(yǎng)液，計(jì)數(shù)后調(diào)整最終密度裝入凍存管，按照標(biāo)準(zhǔn)凍存程序存入液氮罐中。

1.1.2 在Transwell 上培養(yǎng)Caco-2 細(xì)胞 用于建立Caco-2 細(xì)胞模型的Caco-2 細(xì)胞一般在第20～60 代之間[17]，在大多數(shù)試驗(yàn)中，Caco-2 細(xì)胞的培養(yǎng)密度小于2.5×105個(gè)/cm2，因?yàn)槊芏忍笕菀讓?dǎo)致大量細(xì)胞死亡。Transwell 這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是Transwell 小室，其外形類似于一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，Transwell 的命名也由于廠家不同而不同，并且可以用不同材料、不同尺寸的小室來進(jìn)行不同的試驗(yàn)。杯子其余部分的材料與普通的孔板類似，最大的不同是杯子底層有一張有通透性的膜。這層膜上的微孔大小大約在0.1～12.0 μm之間，根據(jù)不同試驗(yàn)要求可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)模型見圖1。當(dāng)把Transwell 小室放在培養(yǎng)板上后，小室內(nèi)叫做上室，培養(yǎng)板內(nèi)叫做下室，分別裝上、下層培養(yǎng)液，以聚碳酸酯膜相隔。運(yùn)用不同薄膜和不同孔徑可以研究共培養(yǎng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等[18]。此外，由于Caco-2 細(xì)胞模型要求細(xì)胞不能穿過多孔膜，因此通常選擇孔徑為0.44 μm 的膜。將Caco-2 細(xì)胞以約1×10 個(gè)/mL，每孔0.5 mL 的密度接種在Transwell 內(nèi)培養(yǎng)21 d 左右。Transwell 小室一般用于研究生物活性物質(zhì)在Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制，測(cè)定細(xì)胞活性，評(píng)價(jià)抗炎、抗氧化等功能性。例如，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，因?yàn)椴谎芯考?xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，因此可以選擇小于3.0 μm 的孔徑，細(xì)胞不會(huì)通過薄膜。將2 個(gè)細(xì)胞分別種于上室和下室，可以研究下室細(xì)胞分泌的物質(zhì)對(duì)上室物質(zhì)的影響[19]。

圖1 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)模型Fig.1 Conventional Transwell plate and schematic diagram of Caco-2 cell model

1.2 Caco-2 細(xì)胞Transwell 模型的評(píng)估

細(xì)胞極性可以通過檢測(cè)細(xì)胞絨毛膜表面標(biāo)記酶的活性，或者通過光學(xué)或電子顯微鏡觀察分化標(biāo)記結(jié)構(gòu)的形成來確認(rèn)[20]。轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、異麥芽糖酶和堿性磷酸酶是小腸刷狀緣細(xì)胞的標(biāo)志酶，它們的活性在一定程度上反映了Caco-2 細(xì)胞分化的程度[21]。電子顯微鏡（TEM）可以直接觀察到單層頂端微絨毛和細(xì)胞間緊密連接的形成過程。光學(xué)顯微鏡下可觀察到單分子膜的形成過程[22]。

Caco-2 單層的完整性和滲透性可以通過Millicell 伏特歐姆計(jì)和STX 100C 電極測(cè)量的跨上皮電阻（TEER）值進(jìn)行評(píng)估[23]。因?yàn)樵撝禍?zhǔn)確度比較高，所以廣泛用于評(píng)估Caco-2 單層的完整性。當(dāng)單層膜的TEER 值大于300 Ω 時(shí)，Caco-2單層可用于進(jìn)一步試驗(yàn)[24]。

此外測(cè)定暴露標(biāo)志物的跨膜通量也能反映單層的通透性，常用的標(biāo)志物有甘露醇、菊粉、聚乙二醇、熒光黃等，甘露醇滲透性的變化是一個(gè)比較敏感的細(xì)胞單層完整性標(biāo)志[25]。在實(shí)驗(yàn)室中，一個(gè)完整的Caco-2 細(xì)胞單層的[14C]甘露醇通透性通常為（1.2±0.5）×10-7cm/s，認(rèn)為滲透系數(shù)大于5×10-7cm/s 表示細(xì)胞單層受損，大于1×10-6cm/s 表示細(xì)胞單層對(duì)類藥物化合物的破壞完整性。以甘露醇的低通透性（＜0.5%/h）作為評(píng)價(jià)Caco-2 單層完整性的標(biāo)準(zhǔn)[26]。

轉(zhuǎn)運(yùn)效率（Papp）可以用來評(píng)估細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，該參數(shù)描述了分子穿過細(xì)胞屏障每單位面積所經(jīng)過的通量，Papp 與細(xì)胞緊密性和表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，Caco-2 細(xì)胞中Papp 的值較低，可能是因?yàn)榫o密連接較窄，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)較低[27]。

總之，隨著Caco-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，單層細(xì)胞的TEER 值以及細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶的表達(dá)和活性逐漸增加，而單層細(xì)胞對(duì)標(biāo)志物的通透性逐漸降低。所有這些信號(hào)表明Caco-2 細(xì)胞已經(jīng)分化，Caco-2 細(xì)胞模型已經(jīng)可以用于實(shí)驗(yàn)。

2 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞中的應(yīng)用

2.1 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞模型中的抗炎作用研究

分化的Caco-2 細(xì)胞模型是研究功能性食品提取物抗氧化、抗癌和抗炎活性非常合適的模型。炎癥反應(yīng)的初始階段包括巨噬細(xì)胞的激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子的分泌，如IL-1β、TNF-α 和IL-6，或IL-10，它們是促炎因子，具有抗炎活性[28]。根據(jù)反應(yīng)機(jī)制可知，提高抗炎作用的機(jī)理是減少促炎因子的釋放，抑制促進(jìn)促炎因子釋放的酶的活性，抑制信號(hào)通路等。有研究利用雙孢蘑菇提取物處理受脂多糖（LPS）和TNF-α 刺激的Caco-2 細(xì)胞，可顯著降低環(huán)加氧酶COX-2 和前列腺素PGF-2α受體的表達(dá)。而蘑菇提取物能增加Caco-2 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf-2 的表達(dá)，降低IL-6 水平。Caco-2細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量發(fā)生了顯著變化。這些結(jié)果表明，雙孢蘑菇生物量提取物具有抗炎特性[29]。許多飲食成分，如植物化學(xué)物質(zhì)，在抗炎方面發(fā)揮著重要作用，如肉桂中的肉桂酸和肉桂醛具有抗炎活性。在腸上皮Caco-2 細(xì)胞和RAW264.7 巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)，肉桂醛抑制LPS 刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α和PGE2，阻斷LPS 刺激的巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子水平和iNOS、COX-2、NF-κB 和IκB 的蛋白表達(dá)，肉桂酸對(duì)Jnk、NF-κB、IKKα/β 和p38MAPK 的磷酸化均有抑制作用。肉桂醛還能降低NFκB、IKKα/β 和p38MAPK 的磷酸化水平，而不影響JNK 的磷酸化水平[30]。

2.2 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞模型中的抗氧化活性研究

自由基的產(chǎn)生與人類疾病的發(fā)生有關(guān)，維持健康生活依賴于飲食中抗氧化物質(zhì)的供應(yīng)，抗氧化物質(zhì)可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的自由基過程[31]。大豆被認(rèn)為是一種很有前景的生物活性肽來源。在人Caco-2 細(xì)胞模型中，用H2O2刺激細(xì)胞單層，確定了4 個(gè)大豆蛋白水解物SPH 組分（SPH-I、SPH-II 和SPH-III）對(duì)細(xì)胞的抗氧化和保護(hù)潛力。SPH-I 和SPH-III 均能減少自由基的產(chǎn)生，而SPH-I 的抗氧化活性最強(qiáng)。氨基酸分析結(jié)果表明，SPH-I 富含疏水性和抗氧化性氨基酸，這與其較強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)。此外，SPH-I 通過抑制脂質(zhì)過氧化和刺激抗氧化酶活性來保護(hù)Caco-2 細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[32]。食用牡丹花（FDB）不同器官的酚類物質(zhì)組成和抗氧化活性均不同，卵巢表現(xiàn)出最高的DPPH 和ABTS·+自由基清除活性，牡丹雄蕊中的總酚提取物 （TPE） 具有很強(qiáng)的清除活性氧（ROS）的能力，TPE 可以升高TEER 值，增強(qiáng)Caco-2 細(xì)胞的屏障功能，增加Caco-2 細(xì)胞中ZO-1、CLDN3 和occludin 的mRNA 含量，然而不影響CLDN1 的mRNA 水平[33]。綜上可知，功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞中的抗氧化機(jī)理大致為清除活性氧和自由基，提高抗氧化酶的活性等。

2.3 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞模型中的抗癌和抗增殖研究

癌癥是一種以不受控制的細(xì)胞分裂和異常細(xì)胞數(shù)量增加為特征的疾病。功能性食品提取物中存在的活性化合物的不同作用機(jī)制是促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制與癌癥發(fā)病有關(guān)的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[34]。水果和蔬菜中存在的各種營(yíng)養(yǎng)素和植物化學(xué)物質(zhì)已被視為潛在的抗癌因子。有研究表明，綠原酸（CGA）是許多人群的主要膳食多酚，咖啡中含有大量綠原酸，有研究表明咖啡攝入量與結(jié)腸癌發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)[35]。Caspase-3 的激活是細(xì)胞凋亡的確認(rèn)性標(biāo)記。在CGA 的細(xì)胞中，Caspase-3 裂解的存在證明了這些化合物裂解Caspase-3 的能力。此外，CGA 與其微生物代謝物的結(jié)合，在亞毒性濃度下，可以抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中S 期的進(jìn)展。在消化過程中，形成的多種多酚代謝產(chǎn)物的組合可以共同發(fā)揮作用，增加抗結(jié)腸癌的效果[36]。另外一項(xiàng)研究稱，楊樹是一種預(yù)防與飲食有關(guān)的慢性疾病的藥物，例如：肥胖癥和糖尿病。楊樹果實(shí)中含有多種酚類化合物，主要為綠原酸、原花青素、花青素苷和槲皮素。楊樹酚類提取物作為細(xì)胞保護(hù)劑，可通過GLUT2 和CD36/FAT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降低Caco-2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖和游離脂肪酸的攝取，減少誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少脂質(zhì)蓄積。此外，以最高濃度的化合物進(jìn)行的溫育會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不是壞死，這反過來又會(huì)減弱炎癥反應(yīng)，這是由于壞死受損細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分滲漏減少所致，可謂是一項(xiàng)開創(chuàng)性的研究[37]。

圖2 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞模型中通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗增殖機(jī)制[36]Fig.2 Anti-proliferation mechanism of functional food extracts inducing apoptosis through mitochondrial pathway in Caco-2 cell model[36]

2.4 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞中的降血脂和降糖研究

谷類、水果等功能性食品富含酚類、類黃酮、酚酸、花青素和植物甾醇等植物成分。流行病學(xué)研究證明，長(zhǎng)期食用谷物可以有效增加脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)，從而顯著減少脂肪堆積，緩解心血管疾病[38]。據(jù)報(bào)道，從咖啡漿果中提取的咖啡阿拉伯果肉提取物（CPE）以劑量依賴的方式誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞膽固醇膠束轉(zhuǎn)運(yùn)顯著減少，CPE 通過下調(diào)NPC1L1 介導(dǎo)的LXR 活化，干擾膠束復(fù)合物的形成，來抑制腸道膽固醇吸收，從而在體內(nèi)外發(fā)揮降膽固醇作用[39]。Ⅱ型糖尿?。═2D）是一種缺乏胰島素引起的高血糖為特征的代謝紊亂，DPP4、α-葡萄糖苷酶和谷氨酰胺是T2D 治療最受關(guān)注的靶點(diǎn)。燕麥球蛋白的胰蛋白酶水解物在體外具有很強(qiáng)的DPP4 抑制活性，而且在Caco-2 細(xì)胞中大量培養(yǎng)（48 h）后，DPP4 蛋白的表達(dá)也被下調(diào)，揭示燕麥多肽可能具有促進(jìn)GLP-1 在人體內(nèi)釋放的巨大潛力，因此燕麥多肽能下調(diào)餐后血糖的水平[40]。總之，功能性食品提取物是通過下調(diào)葡萄糖和膽固醇吸收靶點(diǎn)的表達(dá)和上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，來起到降糖、降脂的作用。

3 功能性食品提取物在Caco-2 細(xì)胞中的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝機(jī)制

3.1 吸收機(jī)制

表1 在Caco-2 細(xì)胞模型中的功能性食品提取物的抗炎、抗氧化、抗增殖、降糖、降脂特性Table 1 Antioxidant，anti-inflammatory，anti-proliferation and anti-cancer properties of functional food extracts （FFEs）using Caco-2 cell line

（續(xù)表1）

食物中的營(yíng)養(yǎng)素或外源性物質(zhì)在消化系統(tǒng)消化后被吸收到血液中，然后在體內(nèi)重新分布的程度通常以生物利用度為特征。由于一些微量營(yíng)養(yǎng)素的含量較低，生物利用度與食物的膳食成分、營(yíng)養(yǎng)素的存在形式以及宿主的生理狀況直接相關(guān)[61-62]。小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)的吸收主要是由腸道上皮細(xì)胞完成的。在分化的Caco-2 細(xì)胞模型中，生長(zhǎng)在微孔膜上的單層細(xì)胞在對(duì)應(yīng)于腸腔的AP 室和對(duì)應(yīng)于腸血管和淋巴循環(huán)的BL 室之間形成屏障[63]。因此，評(píng)估目標(biāo)化合物在分化的Caco-2單層上的吸收是預(yù)測(cè)其在人體內(nèi)生物利用度的策略之一。

近年來，利用分化的Caco-2 細(xì)胞模型進(jìn)行了大量的生物利用度試驗(yàn)研究，主要集中在以下幾個(gè)方面：

1） 控制被動(dòng)擴(kuò)散營(yíng)養(yǎng)素的生物利用度 微量元素在不同條件下的生物利用度差異很大，例如：為了控制茶葉中氟的生物利用度，在Caco-2細(xì)胞模型上評(píng)價(jià)了茶葉中各成分對(duì)氟生物利用度的影響。發(fā)現(xiàn)消化液中的酶和酸可能會(huì)影響鋁和氟的結(jié)合形式，從而影響氟的吸收。茶葉中的多酚類物質(zhì)EGCG 在高濃度的情況下，也能抑制氟的積累，這對(duì)未來研究減少茶葉引起的氟中毒是很有意義的[64]。

2） 營(yíng)養(yǎng)分子前體吸收評(píng)價(jià) 一項(xiàng)研究把姜黃素包埋在固體脂質(zhì)納米粒（SLN）中，包埋在SLN中的姜黃素在消化后，大部分被溶解在混合膠束中，混合膠束的大小和表面電荷影響它們?cè)隗w外通過黏液覆蓋的小腸上皮的通透性，由于膠束的中性表面電荷，固體脂質(zhì)納米粒中的姜黃素迅速滲透到上皮細(xì)胞，使在大鼠模型中的生物利用度比姜黃素溶液中的提高了12 倍以上[65]。

3） 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相互作用對(duì)生物利用度的影響

基于分化的Caco-2 細(xì)胞模型的研究表明，營(yíng)養(yǎng)素的生物利用率在很大程度上取決于食品-食品的協(xié)同作用。制備了天然酪蛋白酸鈉-維生素A復(fù)合物（NaCAS-VA）和改性酪蛋白酸鈉-維生素A 復(fù)合物（SNaCaS-VA）等多種復(fù)合物，在整個(gè)消化過程中，監(jiān)測(cè)含酪蛋白和各種酪蛋白酸鈉-維生素A 復(fù)合物的消化液中維生素A 的含量。研究結(jié)果表明，不同乳蛋白維生素復(fù)合體的維生素A 攝取維生素的能力高于游離態(tài)的維生素A[66]。

4） 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物利用度的關(guān)系 一項(xiàng)研究對(duì)紫肉甘薯（PFSP）花色苷的胃腸道生物利用度進(jìn)行了測(cè)定，并與紅酒花色苷的生物利用度進(jìn)行了比較。紅葡萄酒中的花色苷主要是C3 單葡萄糖苷，而PFSP 中的花色苷中同時(shí)含有糖苷和二葡糖苷部分，與不太復(fù)雜的紅葡萄酒花色苷相比，酰化花色苷對(duì)整體模擬消化表現(xiàn)出更高的抵抗力，在腸道水平的降解率分別約為30%和45%[67]。

5）胃腸消化對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生物利用度的影響 Caco-2 細(xì)胞分化模型常被用來預(yù)測(cè)消化產(chǎn)物的生物利用度，特別是各種食物蛋白中的多肽。大豆蛋白水解物中含有具有較高生物利用度的抗氧化肽，可作為功能性食品原料的潛在來源。類似的試驗(yàn)表明，Stracchino （典型的意大利軟奶酪）和mbc （一種獨(dú)特的受保護(hù)原產(chǎn)地標(biāo)識(shí)水牛奶產(chǎn)品）具有良好的穩(wěn)定性和生物利用度，是潛在的功能性食品[42，68-69]。

3.2 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

基于分化的Caco-2 細(xì)胞模型，不僅可以評(píng)估食物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和外源物質(zhì)的生物利用度，而且可以研究特定條件下的膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。小腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素的膜轉(zhuǎn)運(yùn)可通過以下4 種方式中的1 種或多種實(shí)現(xiàn)：被動(dòng)擴(kuò)散、細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)吞作用[70]。

利用Caco-2 細(xì)胞模型對(duì)沒食子酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)行了研究，它的轉(zhuǎn)運(yùn)方式以被動(dòng)方式為主，同時(shí)沒食子酸在Caco-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)受濃度、溫度、pH 值及P-gp 抑制劑的影響，P-gp 參與了沒食子酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[71]。用兩種不同吸收機(jī)制（內(nèi)吞作用和細(xì)胞旁途徑） 的特異性抑制劑或增強(qiáng)劑（Wortmannin 和細(xì)胞松弛素D） 評(píng)價(jià)燕麥醯胺（AVNs）的潛在轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。結(jié)果顯示，在細(xì)胞松弛素D 存在下，3 種AVNs 的Papp 值均顯著增加，加入Wortmannin 后無(wú)明顯變化。表明這3 種AVNs 是通過細(xì)胞旁途徑吸收的[72]。鉤藤堿在Caco-2 細(xì)胞模型的吸收規(guī)律研究中，對(duì)影響鉤藤堿在Caco-2 細(xì)胞模型上轉(zhuǎn)運(yùn)特征的因素（包括濃度、時(shí)間及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白）進(jìn)行考察，當(dāng)加入P-糖蛋白抑制劑后，藥物由BL 側(cè)向AP 側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著減少，而由AP 側(cè)到BL 側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加。鉤藤堿在Caco-2 細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)存在一定的濃度及時(shí)間依賴性，且P-糖蛋白介導(dǎo)鉤藤堿在Caco-2 細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)[73]。通過測(cè)定豌豆鐵蛋白在胃pH 條件下的穩(wěn)定性并闡明Caco-2 細(xì)胞攝取鐵的機(jī)制，評(píng)價(jià)了豌豆鐵蛋白作為食物補(bǔ)充劑的作用。網(wǎng)狀蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑（氯丙嗪）使鐵蛋白通過Caco-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)降低了30%。網(wǎng)狀蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被認(rèn)為是豌豆鐵蛋白進(jìn)入Caco-2 細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[74]。

3.3 代謝機(jī)制

圖3 羥基肉桂酸在Caco-2 細(xì)胞模型中的代謝機(jī)制[76-77]Fig.3 Metabolic mechanism of hydroxycinnamic acid in Caco-2 cell model[76-77]

利用分化的Caco-2 細(xì)胞模型證明溶血磷脂，如溶血磷脂酰膽堿，在被腸上皮細(xì)胞吸收之前由腸道以2 種方式代謝，包括代謝酶的分泌和代謝酶的頂端選擇性表達(dá)[75]。羥基肉桂酸是一種重要的抗氧化劑，其在分化的Caco-2 細(xì)胞中的代謝表明其代謝途徑分為I 期脫酯和II 期向頂端排泄2個(gè)階段。研究結(jié)果還表明，腸上皮中的硫酸化可能是羥基肉桂酸的最初代謝途徑。它主要被水解，然后甲基化。硫酸化被認(rèn)為是Caco-2 細(xì)胞單層的重要代謝途徑。原則上，Caco-2 細(xì)胞單層可以形成羥基肉桂酸的葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物[76-77]。腸上皮代謝是由I 相和II 相代謝酶引起的。存在于小腸上皮細(xì)胞的各種酶系統(tǒng)是口服藥物的第1 道代謝屏障，其中包括I 相代謝酶（細(xì)胞色素P450等）及Ⅱ相代謝酶。這些酶可以減少藥物的口服生物利用度，并且與藥物相互作用及藥物生物利用度的個(gè)體差異有關(guān)[78]。

4 分化Caco-2 細(xì)胞模型在食品-腸道相互作用研究中的應(yīng)用前景

4.1 改變滲透系統(tǒng)的組成以校正生物利用度

當(dāng)通過分化的Caco-2 細(xì)胞模型預(yù)測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度時(shí)，結(jié)果容易受到許多因素的影響，如受試者的理化性質(zhì)、單層面積、pH 梯度以及與塑料裝置的非特異性結(jié)合，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[79]。例如，脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只有在與腸上皮細(xì)胞中的乳糜微粒結(jié)合時(shí)才能被吸收，而在正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下，Caco-2細(xì)胞不能分泌乳糜微粒[80]。為了解決這個(gè)問題，有科學(xué)家研究Caco-2 細(xì)胞對(duì)多種類胡蘿卜素的腸道吸收時(shí)，在分化的Caco-2 單層的AP 側(cè)添加了油酸、牛黃膽酸和3H-甘油，并成功地建立了Caco-2 細(xì)胞分泌富含甘油三酯的脂蛋白模型[81]。另一項(xiàng)研究用仿生工程細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代替標(biāo)準(zhǔn)Caco-2 細(xì)胞模型中的膠原基質(zhì)。ECM 含有來源于小腸ECM 蛋白的模塊化蛋白結(jié)構(gòu)域。在這個(gè)改進(jìn)的Caco-2 模型中，體內(nèi)通過細(xì)胞旁運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率顯著提高[82]。這些方法都提高了分化的Caco-2 細(xì)胞模型對(duì)生物利用度預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度。

4.2 利用分子生物學(xué)研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或代謝酶

研究表明，Caco-2 細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶和核受體的表達(dá)與小腸的表達(dá)不完全一致。與人類小腸和大腸相比，一些外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在Caco-2 單層中表達(dá)不足，其中乳腺癌耐藥蛋白BCRP（ABCG2）在Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平比在大腸中低100 倍[83]。除了尋找其它合適的腸道細(xì)胞模型作為替代方案外，已經(jīng)有多種方法來修改Caco-2 細(xì)胞模型，以滿足不同試驗(yàn)的需要。具體地說，Caco-2 細(xì)胞模型常用的修飾方法包括基因修飾、基因敲除、轉(zhuǎn)染、亞克隆等技術(shù)[84-85]。一項(xiàng)研究用人工染色體（HAC）載體構(gòu)建細(xì)胞色素P450（CYP）3A4 和NADPH-細(xì)胞色素P450 還原酶（CPR）共同表達(dá)的Caco-2 細(xì)胞。利用微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)將CYP3A4-CPR-HAC 載體轉(zhuǎn)入Caco-2 細(xì)胞，親本細(xì)胞與CYP3A4-CPR-HAC/Caco-2 細(xì)胞單層之間具有較高的跨皮電阻（TEER） 值和一定的通透性，CYP3A4-CPR-HAC/Caco-2 細(xì)胞中的代謝活性高于已有的表達(dá)CYP3A4 的Caco-2 細(xì)胞模型的代謝活性，這使得能夠在傳統(tǒng)模型基礎(chǔ)上，更靈敏地檢測(cè)代謝物來評(píng)估腸道代謝[85]。充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳信息對(duì)Caco-2 細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行暫時(shí)或穩(wěn)定的調(diào)控，是今后對(duì)該模型進(jìn)行修正的一種可行而有效的方法。

4.3 細(xì)胞共培養(yǎng)更好地模擬腸道細(xì)胞的微環(huán)境

4.3.1 Caco-2 細(xì)胞與其它細(xì)胞共培養(yǎng) 小腸上皮黏液層的形成依賴于杯狀細(xì)胞分泌黏液的能力，因此沒有杯狀細(xì)胞的單個(gè)Caco-2 細(xì)胞單層不能形成類似于小腸上皮的黏液層。由于沒有黏膜層，分化的Caco-2 細(xì)胞模型的旁路通透性總是低于體內(nèi)[86]。為了使分化的Caco-2 細(xì)胞模型能夠形成黏液層，Caco-2 細(xì)胞與產(chǎn)生黏蛋白的細(xì)胞系HT29-MTX 共培養(yǎng)[87]。用分泌黏液的Caco-2/HT29-MTX-E12 共培養(yǎng)和Caco-2 單層作為體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型，研究胰島素的通透性，共培養(yǎng)的通透性顯著大于Caco-2 細(xì)胞單層[88]。應(yīng)用腸黏膜炎癥模型研究了牛初乳的抗炎和抗菌作用，結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤壞死因子（TNF-α）刺激Caco-2/HT29細(xì)胞單層時(shí)，初乳可降低IL-8 的水平[89]。在研究肉桂酸和肉桂醛抗炎作用時(shí)，用到的是Caco-2 和RAW264.7 共培養(yǎng)模型。RAW264.7 對(duì)脂多糖非常敏感，LPS 可激活巨噬細(xì)胞系RAW264.7，誘導(dǎo)NF-κB 途徑，增加NO 的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的分泌，如IL-1β、IL-6、IL-8 等。由于Caco-2 和RAW264.7 共用介質(zhì)，LPS 激活的RAW264.7 中的NO 和炎性細(xì)胞因子影響Caco-2 單層，通過LPS 和炎性細(xì)胞因子的影響抑制屏障功能。將免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子暴露于上皮細(xì)胞可以導(dǎo)致生物反應(yīng)，而不是只暴露一種細(xì)胞因子[30]。

4.3.2 建立3D Caco-2 細(xì)胞模型 腸道是一個(gè)非常復(fù)雜的環(huán)境，多種細(xì)胞相互作用以維持正常的腸道功能。一維Caco-2 細(xì)胞模型不能準(zhǔn)確模擬腸道環(huán)境，不能對(duì)腸道細(xì)胞間的串?dāng)_進(jìn)行詳細(xì)研究。因此，涉及Caco-2 細(xì)胞的二維 （2D） 甚至三維（3D）細(xì)胞模型開始出現(xiàn)，用于研究腸上皮細(xì)胞與其它細(xì)胞之間的相互作用。例如，一項(xiàng)研究開發(fā)了一種3D 人體腸道基質(zhì)等效物（3D-ISE），它由人小腸上皮下肌纖維母細(xì)胞（ISEMF）嵌入自身細(xì)胞外基質(zhì)組成。然后將Caco-2 種植到扁平或圖案化的細(xì)胞合成的基質(zhì)等效結(jié)構(gòu)上，并對(duì)它們進(jìn)行培養(yǎng)，直到分化形成良好的上皮組織。結(jié)果證明，花紋基質(zhì)增加了吸收表面積、上皮增殖率和微絨毛密度。此外，它還引起上皮細(xì)胞生物學(xué)功能的改變，如酶和黏液的產(chǎn)生、極化和緊密性。因此它是一個(gè)結(jié)合三維形貌和充足的間質(zhì)微環(huán)境，具有生理相關(guān)特征的三維腸道模型[90]。

4.3.3 建立人體腸道-血管微流控系統(tǒng) 最近世衛(wèi)組織建立了一種新型的人體腸道-血管微流控系統(tǒng)來研究宿主-微生物之間的相互作用。腸上皮細(xì)胞（Caco-2）與血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）在蠕動(dòng)微流控芯片上共培養(yǎng)5 d，在該芯片上建立了大腸桿菌引起的腸道損傷和炎癥反應(yīng)模型，并評(píng)價(jià)了干酪乳桿菌和抗生素的治療效果。作為一種傳統(tǒng)的體外腸道吸收模型，Caco-2 細(xì)胞通常在Transwell 中培養(yǎng)至少3 周，以分化成具有腸道吸收功能的模型。與之形成鮮明對(duì)比的是，這項(xiàng)研究結(jié)果顯示周期性蠕動(dòng)加上微流控裝置中的液體流動(dòng)，顯著促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖以及糖萼和微絨毛的分泌。此外，芯片上周期性蠕動(dòng)加液體流動(dòng)也會(huì)影響腸上皮細(xì)胞屏障的分化、吸收和代謝功能[91]。與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，微流控細(xì)胞培養(yǎng)有很多優(yōu)點(diǎn)，可以提供一個(gè)更接近活體的細(xì)胞環(huán)境，以確保得出更可靠的分析結(jié)果，在體外研究宿主-微生物相互作用以及微生物群在腸道疾病中的作用和機(jī)制方面顯示出良好的潛力。

5 結(jié)論

為了分析功能性食品及其提取物用于疾病治療的途徑，需要通過細(xì)胞的分析來研究食品與細(xì)胞之間的分子機(jī)制和相互作用。用Caco-2 細(xì)胞單層作為評(píng)價(jià)細(xì)胞模型，可以更方便地研究功能性食品提取物的不同作用機(jī)制。在Caco-2 細(xì)胞和共培養(yǎng)體系中可以觀察到功能性食品提取物的抗炎、抗氧化和降膽固醇等生物活性。功能性食品提取物在細(xì)胞模型中經(jīng)過了吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等轉(zhuǎn)化，不同的功能性食品提取物具有不同的轉(zhuǎn)化機(jī)制。近期對(duì)Caco-2 細(xì)胞模型進(jìn)行了不同方式的改進(jìn)，可以改變滲透系統(tǒng)的成分組成，來提高生物利用度的準(zhǔn)確度，建立的共培養(yǎng)體系更貼切模擬腸道環(huán)境。

Caco-2 細(xì)胞可以為功能性食品提取物的研究提供更深入的了解。分化后的Caco-2 細(xì)胞表現(xiàn)出小腸上皮細(xì)胞的特征，并含有轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶，如酯酶、氨基肽酶和硫酸鹽。然而，與小腸上皮相比，Caco-2 細(xì)胞存在一些缺陷或局限性，如低的細(xì)胞旁通透性和高度可擴(kuò)散的小分子滲入微絨毛等。腸上皮細(xì)胞與Caco-2 細(xì)胞的主要不同之處在于Caco-2 細(xì)胞沒有黏液層。另一個(gè)區(qū)別是Caco-2 細(xì)胞單層細(xì)胞中最重要的代謝酶CYP3A4低表達(dá)，CYP3A4 是人體上皮中主要的藥物代謝酶?；虮磉_(dá)分析表明，與體內(nèi)環(huán)境相比，Caco-2細(xì)胞攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生。盡管有這些限制，藥物通過Caco-2單層的滲透特性與其對(duì)人體腸道上皮的滲透非常接近。因此，Caco-2 單層是一種強(qiáng)大的體外模型。

鑒于分化后的Caco-2 細(xì)胞模型不能完全模擬真實(shí)腸道，研究人員從自動(dòng)化、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞共培養(yǎng)等方面對(duì)分化后的Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行了大量的改進(jìn)。開發(fā)了一種兼具人體腸道上皮特性和對(duì)大分子低通透性的共培養(yǎng)體系。雖然共培養(yǎng)體系顯示出很好的重復(fù)性，但仍存在載體的高定量表達(dá)問題，這可能會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物。在未來的研究中，分化的Caco-2 細(xì)胞模型應(yīng)該在具有簡(jiǎn)單性和可靠性的情況下更接近內(nèi)部環(huán)境，研究出成本效益高的細(xì)胞模型用于大規(guī)模食品-腸道相互作用分析。