粘質(zhì)沙雷氏菌全能核酸酶的研究進(jìn)展

趙萍，韓冬梅?

（河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056000）

全能核酸酶又稱非特異性核酸酶 （Nonspecific nuclease，NU），可降解幾乎所有形式的DNA 和RNA （包括單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀、天然以及變性的核酸），生成3～5 個(gè)堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。全能核酸酶來源廣泛，在動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌和病毒均有發(fā)現(xiàn)，到目前為止，已鑒定出30 多種不同來源的全能核酸酶，其中來源于粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的全能核酸酶活力最強(qiáng)（下文無特殊說明，全能核酸酶均指來源于粘質(zhì)沙雷氏菌全能核酸酶），能夠在非常廣泛的條件下保持很高的穩(wěn)定性和消化活力。全能核酸酶在獸醫(yī)方面的應(yīng)用主要是去除獸用疫苗、蛋白、多糖類生物制藥生產(chǎn)過程中的核酸殘留，降解動(dòng)物性飼料中的病原體的核酸殘留，維護(hù)養(yǎng)殖場的生物安全。

1 全能核酸酶結(jié)構(gòu)

粘質(zhì)沙雷氏菌的全能核酸酶有兩種基因亞型，第一種亞型由245 個(gè)氨基酸組成，第二種亞型相對與第一個(gè)亞型其N-末端少個(gè)三個(gè)氨基酸Asp-Thr-Leu，其余氨基酸序列相同。這兩種亞型生化性質(zhì)幾乎相同，只是在等電點(diǎn)處有微小的差別。全能核酸酶的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)均已被證實(shí)，率先被解析的是2.1 歐分辨率蛋白晶體結(jié)構(gòu)，隨后1.7 歐分辯率和0.92 歐分辨率蛋白晶體結(jié)構(gòu)依次被解析出來。全能核酸酶不同于其他核酸酶的結(jié)構(gòu)，其精細(xì)的結(jié)構(gòu)是由一個(gè)包含六個(gè)反平行β 鏈的中心層組成，在中心層的兩側(cè)有不同長度的螺旋側(cè)翼，幾個(gè)長的環(huán)段將這些區(qū)域連接起來。另外，沉降速度實(shí)驗(yàn)、交聯(lián)研究、動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)以及X 射線晶體數(shù)據(jù)分析均證實(shí)全能核酸酶是由兩條相同的單肽鏈連接在一起的同源二聚體。Ahrenholtz 研究發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌核酸酶單體的催化中心距離二聚體的接觸位點(diǎn)較遠(yuǎn)，二聚體的分離并不影響活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合。Franke 通過設(shè)計(jì)正常的核酸酶二聚體、核酸酶單體、以及含有一個(gè)突變失活亞基的核酸酶異二聚體三組實(shí)驗(yàn)測定酶活力，結(jié)果顯示核酸酶單體、核酸酶異二聚體的活力為正常核酸酶二聚體的一半，從而進(jìn)一步證明了沙雷菌核酸酶兩個(gè)亞基的活性位點(diǎn)具有獨(dú)立性。雖然全能核酸酶的二聚化結(jié)構(gòu)不具有協(xié)同作用，但增加了酶與底物的碰撞幾率，增強(qiáng)了反應(yīng)效率。

2 全能核酸酶的表達(dá)調(diào)控

全能核酸酶的表達(dá)調(diào)控屬于選擇性表達(dá)調(diào)控而非常見的底物調(diào)控，啟動(dòng)子上游的操縱基因決定了全能核酸酶的分泌發(fā)生在細(xì)菌生長的平臺期，胞外核酸酶的分泌量不隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而顯著增加，但在細(xì)胞裂解后胞外核酸酶的量會(huì)顯著增加。全能核酸酶的激活與位于多肽鏈的N 末端的C9 與C13 和C 末端的C201與C243 之間的兩個(gè)二硫鍵的形成有關(guān)，二硫鍵的形成發(fā)生在細(xì)胞周質(zhì)，因此全能核酸酶分泌到細(xì)胞周質(zhì)或細(xì)胞外才具有生物學(xué)活性，從而避免了全能核酸酶對自身核酸的降解。

3 全能核酸酶作用機(jī)制

3.1 全能核酸酶活性中心功能基團(tuán)

全能核酸酶催化功能相關(guān)的基團(tuán)是位于活性中心的R57、R87、H89、N119 和E127 殘基，對這些殘基進(jìn)行突變會(huì)導(dǎo)致該酶催化活性的喪失，其中H89 直接參與了磷酸二酯鍵的水解反應(yīng)，R57和N119 殘基共同起著穩(wěn)定磷中間體的作用，E127 在整個(gè)過程中充當(dāng)普通堿的作用，R87 作用位點(diǎn)在核糖3' 端的磷酸基上，這對5' 端附近的降解是至關(guān)重要的。

3.2 全能核酸酶底物的作用位點(diǎn)

與其他來源的核酸酶比較，全能核酸酶有較高的催化活性，大約是葡萄球菌核酸酶的4倍，是DNase Ⅰ的34 倍。其催化機(jī)理與其它核酸酶也略有不同，葡萄球菌核酸酶作用于5’-OH 與磷酸之間形成的磷酸二酯鍵，全能核酸酶和DNase I 作用位點(diǎn)相同，為3’-OH 與磷酸之間的磷酸二酯鍵，但全能核酸酶是從5’端切割磷酸二酯鍵，而DNase I 是從3’端切割磷酸二酯鍵。

3.3 全能核酸酶對底物的偏愛性

雖然全能核酸酶底物譜廣泛，能夠?qū)捂?、雙鏈、線狀、環(huán)狀、天然以及變性的DNA 和RNA降解成3-5 個(gè)堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。但對Poly 結(jié)構(gòu)的核酸降解效率差異很大，對PolyU，PolyG , PolyC，Poly［d(A)］和Poly［d(T)］幾乎不降解，對PolyA 和PolyA·PolyU 可微量降解，對Poly( I)·Poly( C) 可高效降解。另外，全能核酸酶對高GC 含量的堿基序列降解效率高于高AT 含量的堿基序列。

4 重組全能核酸酶的表達(dá)

鑒于全能核酸酶在胞內(nèi)表達(dá)會(huì)對自身核酸造成降解，從而引起菌體死亡或抑制菌體生長。目前獲得重組全能核酸酶以分泌性表達(dá)為主。默克公司最早利用大腸桿菌對重組全能核酸酶進(jìn)行了分泌性表達(dá)，其產(chǎn)量僅達(dá)到104單位/升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需求。國內(nèi)學(xué)者也陸續(xù)對全能核酸酶重組表達(dá)進(jìn)行了研究，張開俊將全能核酸酶基因構(gòu)建到分泌型載體pET-20b（+）上，在大腸桿菌BL21 進(jìn)行了分泌表達(dá)，其產(chǎn)量為8毫克/升。陳鵬為了解決全能核酸酶胞內(nèi)本底表達(dá)對宿主細(xì)胞的傷害，將全能核酸酶與麥芽糖結(jié)合蛋白融合基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體PET22b 上，并在大腸桿菌BL21 中進(jìn)行了分泌性表達(dá)，其產(chǎn)量達(dá)到了10 毫克/升。龔雪梅利用短短芽孢桿菌胞外分泌能力，將全能核酸酶基因重組到pNC 載體上，實(shí)現(xiàn)了全能核酸酶重組蛋白在短短芽孢桿菌胞外分泌表達(dá)，其產(chǎn)量達(dá)到30～40 毫克/升。田克恭利用酵母真核表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)外源蛋白的分泌表達(dá)優(yōu)勢，將全能核酸酶基因重組到pPICZɑA 載體上，實(shí)現(xiàn)了全能核酸酶重組蛋白在酵母胞外分泌表達(dá)，其產(chǎn)量達(dá)到200 毫克/升。

5 全能核酸酶的應(yīng)用

由于全能核酸酶可在廣泛的條件下能保持較高的穩(wěn)定性和消化活力，高效地降解所有形式的RNA 和DNA，已廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。全能核酸酶最典型的用途是除去疫苗、多糖、蛋白等工業(yè)生物制品中核酸，美國FDA 對治療用每劑量的生物制品的核酸含量要求低于10 pg，國內(nèi)相應(yīng)的要求為低于100 pg。全能核酸酶可以使這些生物制品中的核酸含量符合要求，提高生物制品功效。其次，在蛋白純化過程中，細(xì)胞裂解產(chǎn)生的大量核酸增加了裂解液黏度，使下游的生產(chǎn)程序復(fù)雜化，全能核酸酶通過降解核酸可有效降低細(xì)胞裂解液的黏度，從而提高蛋白得率，改善分離效果。另外，在細(xì)胞來源的產(chǎn)物純化過程中，核酸易粘附在細(xì)胞產(chǎn)物上，使其顆粒大小或電荷發(fā)生改變，引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)物聚集，如外周血單細(xì)胞（PBMC）存放過程中的結(jié)塊現(xiàn)象，添加全能核酸酶可避免此類情況的發(fā)生，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)物純化效率。在ELISA、色譜分析、雙相電泳和足跡分析等生化分析樣品的制備過程中，用全能核酸酶處理含核酸的蛋白樣品，可提高蛋白的分辨率和回收率。PCR 實(shí)驗(yàn)室核酸污染是造成檢測結(jié)果假陽性的主要因素，全能核酸酶通過降解核酸實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的凈化。在醫(yī)學(xué)方面，由于核酸酶具有干擾細(xì)胞復(fù)制的功能，具有明顯的抗腫瘤特性，并且對纖維性囊腫、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，兒童氣喘病等疾病也有明顯的療效。

圖1 全能核酸酶單聚體結(jié)構(gòu)

6 小結(jié)與展望

圖2 全能核酸酶二聚體結(jié)構(gòu)

圖3 DNase I，葡萄球菌核酸酶以及SMNE 的切割位點(diǎn)

全能核酸酶應(yīng)用范圍廣泛，作用效力強(qiáng)，不僅在工業(yè)、生物醫(yī)藥領(lǐng)域有突出表現(xiàn)，也可以在畜牧生產(chǎn)中派上用場，全能核酸酶可降解豬血漿蛋白粉攜帶的病原微生物核酸，尤其是非洲豬瘟病毒核酸，可提高豬血漿蛋白的飼用安全，降低動(dòng)物疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，維護(hù)豬血漿的畜牧生產(chǎn)價(jià)值。另外全能核酸酶與蛋白酶聯(lián)合應(yīng)用，有望成為新型的環(huán)保生物消毒劑，首先通過蛋白酶降解病原微生物的外膜蛋白使其核酸暴露，全能核酸酶進(jìn)一步發(fā)揮降解核酸作用，從而達(dá)到消毒效果，與傳統(tǒng)化學(xué)消毒藥相比，對機(jī)體無毒副作用，不污染環(huán)境，是一種潛在的理想綠色消毒制劑。