補腎復(fù)方在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型中的研究進展*

尹 航，董 博，康武林，袁普衛(wèi)，劉德玉

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosisi，OP）是一類以單位骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨的脆性增加、易于發(fā)生骨折的全身性代謝骨病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是絕經(jīng)后女性卵巢功能減退，體內(nèi)雌激素水平下降，成骨細胞活性減弱，破骨細胞活性加強，骨吸收大于骨形成，使骨代謝呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型而形成的代謝性骨骼疾病[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要使用抗吸收藥、合成代謝藥及骨礦化藥等藥物抑制破骨過程、維持骨結(jié)構(gòu)、延緩疾病進展，但其存在不良反應(yīng)較大、患者耐受度低、安全性和有效性尚不理想等不足。補腎復(fù)方治療本病療效確切，副作用小，患者接受程度高，應(yīng)用前景廣闊。現(xiàn)總結(jié)補腎復(fù)方在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型中的實驗研究進展，為補腎復(fù)方的臨床應(yīng)用推廣提供參考。

1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)學(xué)認(rèn)識

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PMOP歸屬“骨痿”“骨極”“骨枯”等范疇?！端貑枴ゐ粽撈分杏涊d：“五藏使人痿……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”本病與腎關(guān)系密切，腎精充足，則骨髓化生有源，筋骨勁強，關(guān)節(jié)滑利；腎精不足，則骨髓化生無源，腰脊不舉，骨枯而痿?！鹅`樞·決氣》記載：“谷入氣滿，淖澤注于骨，骨屬屈伸，泄?jié)?，補宜腦髓，皮膚潤澤?！焙筇炱⑽傅墓δ芘c骨骼的正常生長密切相關(guān)，脾氣健旺得以維持骨的正常功能?！鹅`樞·本臟》中記載：“是故血和則經(jīng)脈流行，營復(fù)陰陽，筋骨勁強，關(guān)節(jié)清利矣?！睔庋溆c骨骼強健緊密相關(guān)，氣血充盈則筋骨強。由此可見，本病屬本虛標(biāo)實之證，以腎虛、脾虛為本，血瘀為標(biāo)，對于本病的治療多以補腎為主，兼以強筋壯骨、健脾養(yǎng)血、活血祛痰。臨床上應(yīng)用的補腎復(fù)方制劑如二仙湯[3]、更年骨堅方[4]、六味地黃丸[5]及補腎藥膳[6]等治療效果顯著，對骨生長、骨密度及疼痛癥狀等均有一定的改善。

2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型是動物體內(nèi)雌激素水平下降，導(dǎo)致骨吸收增強、骨丟失過多而引起的骨質(zhì)疏松癥。目前造模常用的實驗動物有大鼠、小鼠、兔、羊及非人類靈長類動物等，在實驗動物選擇中常以雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松動物模型作為首選。由于大鼠具有成本低廉、易于飼養(yǎng)、短時間內(nèi)可達到新的骨改建動態(tài)平衡、骨代謝特點與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松相似、模型穩(wěn)定及實驗結(jié)果可信度高等特點，故大鼠目前被廣泛應(yīng)用于PMOP的研究[7-8]。目前PMOP動物模型常用造模法大體可分為兩類：手術(shù)去勢法和藥物去勢法。而手術(shù)去勢法中的雌性動物雙側(cè)卵巢切除是PMOP最常用的造模方法[9]。

2.1 手術(shù)去勢法 手術(shù)去勢法是指利用外科手術(shù)方法將動物生殖系統(tǒng)切除，使其功能喪失以達到動物模型建立的方法。1969年SAVILLE P D.[10]首次通過外科手術(shù)切除雌性大鼠卵巢成功建立了PMOP模型。邱宇等[11]通過研究去卵巢小鼠術(shù)后不同時期骨微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，證實去卵巢法可成功制備出PMOP模型，且發(fā)現(xiàn)小鼠在去卵巢術(shù)后1周至1個月松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)明顯受損，早于皮質(zhì)骨骨化。

2.2 藥物去勢法 藥物去勢法是在不切除動物生殖系統(tǒng)的情況下，通過給予動物抑制雌激素分泌的藥物從而模擬絕經(jīng)后狀態(tài)，使體內(nèi)雌激素水平降低，達到骨量丟失等骨質(zhì)疏松癥狀的造模方法。目前常用的藥物有促黃體激素釋放激素受體激動劑、雌激素受體拮抗劑、非甾體類雄激素拮抗劑等。此造模法具有無創(chuàng)傷、不產(chǎn)生干擾檢測的電解質(zhì)紊亂及不激發(fā)動物手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)等優(yōu)點，但由于各類藥物的副作用，實驗結(jié)果可信度不高，相較于手術(shù)去勢法其應(yīng)用范圍明顯受限。

雖然絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物造模方法有很多，而手術(shù)去勢法造模具有造模率高、穩(wěn)定性好、造模周期短的特點，因此成為PMOP的經(jīng)典造模方法。

3 補腎復(fù)方在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型中的研究

3.1 免疫調(diào)節(jié)作用 T細胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，同時也是骨吸收的重要調(diào)節(jié)因子。最新發(fā)現(xiàn)的兩種T細胞亞群即輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）與調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）在維持成骨與破骨細胞的平衡中發(fā)揮了重要的作用。PMOP患者體內(nèi)雌激素水平下降，使免疫系統(tǒng)“輔助手”（cluster of differentiation 4+，CD4+）T細胞產(chǎn)生更多的Th17，從而出現(xiàn)Th17偏移。Th17產(chǎn)生的炎癥因子白細胞介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）可誘導(dǎo)破骨細胞形成，從而引起骨量丟失[12]。Treg可產(chǎn)生白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）炎癥抑制因子，可抑制Th17效應(yīng)因子，從而起到抑制骨吸收的作用[13]。劉金勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)龜鹿補骨方可降低去卵巢大鼠血清中白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，而升高IL-10水平，表明龜鹿補骨方可調(diào)節(jié)Th17、Treg及相關(guān)因子的表達，逆轉(zhuǎn)Th17/Treg失衡狀況，防治PMOP。

3.2 對激素或細胞因子的調(diào)節(jié)作用 多種細胞因子在PMOP疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。血清生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）是調(diào)節(jié)骨平衡的重要因素，主要表現(xiàn)為維持骨量。蘇海容等[15]通過給去卵巢大鼠灌胃補腎壯骨顆粒，發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆粒可提高去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠血清GH和IGF-1水平，在防止骨量丟失的同時增加骨密度。IL-17和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是PMOP疾病進展中的重要促炎因子。劉立萍等[16]通過觀察補腎填精方左歸丸對PMOP模型大鼠炎癥因子的影響，發(fā)現(xiàn)補腎填精方可明顯降低大鼠血清IL-17、TNF-α水平，從而有效防治PMOP。

3.3 抑制骨吸收和促進骨形成作用 PMOP主要表現(xiàn)為骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨代謝的平衡取決于骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡。當(dāng)骨吸收大于骨形成時，導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)紊亂的因素均會促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。細胞核因子κΒ受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κΒ ligand，RANKL）是維持破骨細胞功能和促使其分化成熟的重要因子，可促進破骨細胞的分化，增強破骨細胞的活力，而骨保護素（osteoprotegerin，OPG）蛋白能抑制破骨細胞的功能。閔文等[17]研究發(fā)現(xiàn)補腎通絡(luò)方通過降低RANKL/OPG蛋白表達可抑制破骨細胞功能，抑制骨吸收。過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α（asubunit of peroxisome proliferatorsactivated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α）和類固醇受體輔助激活因子3（steroid receptor coactivator-3，SRC-3）均可通過活化相應(yīng)的核受體參與雌激素調(diào)節(jié)的骨代謝過程。研究表明，補腎壯骨顆粒可能通過提高去勢大鼠血清及骨髓組織中SRC-3和PGC-1α分子及基因表達水平，以促進骨形成，提高骨密度[18]。鄭志堅等[19]通過構(gòu)建體內(nèi)去卵巢小鼠OP模型和體外骨疏康顆粒含藥血清誘導(dǎo)破骨細胞分化和凋亡模型，明確了骨疏康顆粒防治PMOP是通過誘導(dǎo)體內(nèi)外破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞的骨吸收，從而減少骨量丟失實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）可通過調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的分化和功能，實現(xiàn)對骨骼生長發(fā)育的調(diào)控。鄧洋洋等[20]研究表明補腎活血方可上調(diào)大鼠腎組織中ATF4蛋白表達，下調(diào)大鼠骨組織中ATF4蛋白表達，以促進成骨細胞增殖分化和抑制破骨細胞增殖分化。股骨骨礦含量（bone mineral content，BMC）是判斷骨質(zhì)疏松中骨量丟失的重要指標(biāo)。安方玉等[21]研究表明溫腎強身散可提高大鼠股骨組織中BMC的水平，進而抑制骨組織的吸收，促進骨組織的形成。成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、成骨細胞特異基因（osteoblast specific gene，Osterix）是成骨細胞分化和成熟的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子，可促進骨形成。王劍等[22]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸中藥復(fù)方可下調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Runx2、Osterix啟動子甲基化水平，促進其轉(zhuǎn)錄和表達，從而促進成骨細胞分化，有效防治PMOP。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）參與了骨基質(zhì)的鈣化和重吸收。骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）與骨代謝關(guān)系密切。受體整合素ɑvβ3（receptor integrin ɑvβ3，Itgɑvβ3）可與OPN和BSP相互作用，調(diào)控骨吸收功能。研究表明青娥方可使卵巢切除大鼠骨組織OPN、BSP和Itgɑvβ3表達下降，抑制破骨細胞功能活性，減少骨質(zhì)丟失[23]。

3.4 對骨代謝的調(diào)節(jié)作用 骨組織是由破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨以完成骨轉(zhuǎn)化的活組織。在骨轉(zhuǎn)化過程中，鈣磷代謝調(diào)節(jié)指標(biāo)、激素與細胞因子、骨吸收標(biāo)志物和骨形成標(biāo)志物等骨代謝生化指標(biāo)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[24]。上述骨代謝指標(biāo)主要包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，BGP）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（aminoterminal propeptide of typeⅠprocollagen，PINP）、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（carboxyterminal crosslinked propeptide of typeⅠprocollagen，PICP）和Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽（crosslinked carboxyterminal peptide of typeⅠcollagen，ICTP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、β膠原降解產(chǎn)物（β-Crosslaps，β-CTX）等。ALP為特異性的骨形成標(biāo)志物，可反映成骨細胞的活動。TRACP是骨質(zhì)疏松癥篩查的敏感指標(biāo)，同時也是高特異性的骨吸收標(biāo)志物。PINP、PICP和ICTP是反映膠原代謝的生化指標(biāo)，其中PINP和PICP反映骨形成，ICTP反映骨吸收。β-CTX是反映骨吸收的特異性敏感指標(biāo)。BGP由成骨細胞分泌產(chǎn)生，是骨重建的標(biāo)志物。尿中脫氧吡啶啉（deoxypryidinoline，D-Pyd）是骨和軟骨膠原的特異性指標(biāo)，是反映骨吸收的重要指標(biāo)之一。左歸丸可明顯降低去卵巢大鼠尿中D-Pyd含量，提高血清中BGP含量，以促進骨形成和抑制骨吸收，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥作用[25]。楊駿杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)骨疏康顆?？山档挺?CTX的表達，同時提高PINP、BGP、ALP的表達，以延緩骨量丟失。也有研究[27]發(fā)現(xiàn)地黃飲子水煎劑可通過提高大鼠血清BGP含量，降低血清TRACP含量，維持骨代謝的動態(tài)平衡，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。劉立萍等[28]研究表明補腎填精方左歸丸可通過降低去卵巢大鼠血清PICP和ICTP含量，干預(yù)Ⅰ型膠原的合成與分解，從而防治PMOP。

3.5 對信號通路的調(diào)節(jié)作用

3.5.1 對Wnt/β-catenin信號通路的影響 經(jīng)典Wnt（Wingless）/β連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路在成骨細胞分化和骨形成過程中扮演著重要角色。Wnt蛋白家族由19個分泌型糖蛋白組成，其中Wnt3a（Wingless 3a）可通過Wnt通路促進成骨細胞的增殖和分化，同時抑制破骨細胞的表達，Wnt7b（Wingless 7b）可顯著增加成骨細胞的數(shù)量及活力，抑制破骨細胞的表達[29]。在Wnt信號通路被激活時，β-catenin與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，以促進成骨細胞的分化增殖[30]。邢威等[31]研究發(fā)現(xiàn)杜仲健骨方可提高大鼠骨組織中Wnt3a和β-catenin的mRNA及蛋白表達水平，表明杜仲健骨方可通過調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin信號通路，發(fā)揮治療OP的作用。王慶諺等[32]研究發(fā)現(xiàn)補腎益氣活血方可上調(diào)Wnt7b、Axis抑制蛋白2（recombinant axis inhibition protein 2，Axin2）、Runx2的mRNA及蛋白表達，即補腎益氣活血方可通過調(diào)節(jié)Wnt7b/β-catenin信號通路的相關(guān)因子，促進成骨分化，從而防治PMOP。

3.5.2 對OPG/RANKL/RANK信號通路的影響 OPG/RANKL/核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factorκΒ，RANK）信號通路是調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成平衡的重要信號軸，與PMOP有密切聯(lián)系。RANK可與RANKL結(jié)合使前體細胞內(nèi)信號開始傳導(dǎo)，以促進破骨細胞（osteoclast，OC）的增殖分化，而OPG可競爭性結(jié)合RANKL，抑制OC的活化和骨吸收[33]。姜宜妮等[34]發(fā)現(xiàn)二至丸可通過調(diào)節(jié)PMOP模型大鼠的OPG/RANKL和RANK/RANKL表達水平，抑制OC活性，促進成骨細胞（osteoblast，OB）形成，從而改善骨質(zhì)疏松。顏春魯?shù)萚35]研究發(fā)現(xiàn)地黃飲子水煎劑可使PMOP模型大鼠OPG含量升高，而RANKL和RANK含量降低，表明地黃飲子水煎劑可通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號通路抑制骨吸收和促進骨形成，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

3.5.3 對BMP2/Smad/RUNX2信號通路的影響 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/細胞信號傳導(dǎo)蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad）/RUNX2信號通路是參與成骨細胞分化及促進骨形成的重要通路。BMP2可誘導(dǎo)OB分化和促進骨形成，Smad可與RUNX2相互作用參與OB基因的分化及表達[36]。而胎球蛋白A（recombinant human fetuin A，F(xiàn)etuin-A）和基質(zhì)gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）是BMP2/Smad/RUNX2信號通路中重要的調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PMOP患者血清Fetuin-A水平的降低和MGP在骨組織局部的聚集是疾病發(fā)生的重要原因之一[37]。張麟等[38]發(fā)現(xiàn)補腎化痰方可通過提高PMOP大鼠血清Fetuin-A含量和降低骨組織局部MGP含量，進而調(diào)節(jié)BMP2/Smad/RUNX2信號通路實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的作用。周亞娜等[39]通過研究發(fā)現(xiàn)補腎化痰方也可通過提高血清及骨組織中BMP2和RUNX2含量，影響B(tài)MP2/Smad/RUNX2信號通路，起到促進骨形成的作用。

3.5.4 對其他信號通路的影響 除以上通路外，補腎復(fù)方還可通過調(diào)節(jié)其他多種信號通路發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。如金匱腎氣丸可促進成骨細胞內(nèi)雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）表達，抑制磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated adenylate activated protein kinase，p-AMPK）蛋白表達，促進OB增殖分化，改善OB功能[40]。補腎活血方可通過調(diào)節(jié)骨內(nèi)谷氨酸的表達，介導(dǎo)骨重建，改善骨質(zhì)疏松癥狀[41]。補腎、活血中藥復(fù)方（左歸丸、身痛逐瘀湯）可提高indian hedgehog（IHH）mRNA及蛋白表達，以激活I(lǐng)HH信號通路發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松作用[42]。補腎化痰方可通過降低血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）及骨組織Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的mRNA和蛋白表達水平，抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路，從而改善骨量丟失[43]。

4 小結(jié)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為絕經(jīng)后女性最常見的代謝性骨病，西醫(yī)治療本病局限性較多，而補腎復(fù)方治療本病療效確切。雖然補腎復(fù)方在動物模型中的相關(guān)研究對于指導(dǎo)臨床工作具有一定價值，但由于補腎復(fù)方中藥物的復(fù)雜性，其具體的作用機制及途徑尚不完全明確，且缺少補腎復(fù)方中單味中藥對于動物模型的研究，今后應(yīng)加強復(fù)方的具體作用機制及單味中藥的研究，以更好地指導(dǎo)臨床工作。