基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究逍遙散治療經(jīng)前期綜合征的作用機(jī)制

曹一鳴 劉雁峰 王悅竹 史亞婷 宮瑋珩

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京，100020)

經(jīng)前期綜合征(Premenstrual Syndrome，PMS)是情志病研究領(lǐng)域的代表性病種，當(dāng)今醫(yī)學(xué)界最為關(guān)注的問(wèn)題。是指經(jīng)前2周開(kāi)始出現(xiàn)涉及身體(水腫、盆腔沉重墜脹感、頭暈、頭痛、乳脹)、情緒(煩躁易怒、悲傷欲哭、焦慮抑郁)和行為障礙(失眠、思想不集中)等多系統(tǒng)癥狀，一般在經(jīng)前3～5 d最明顯，對(duì)生活和工作均會(huì)帶來(lái)一定的影響?；颊叱ｋS月經(jīng)周期性出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，經(jīng)期癥狀逐漸減輕后消失。青壯年發(fā)病率高，其中較嚴(yán)重者或可合并不孕[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前普遍接受的有社會(huì)和心理、卵巢激素、遺傳、中樞神經(jīng)遞質(zhì)和自主神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)說(shuō)[2]。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)PMS缺乏規(guī)范化的治療方法，主要是對(duì)癥治療、調(diào)控精神癥狀、抑制排卵治療等，雖大多能較快緩解癥狀，但也存在著一些局限性，如抑制排卵治療對(duì)身體危害較大、不良反應(yīng)多；抗抑郁焦慮類(lèi)藥物治療遠(yuǎn)期療效不理想[3]。而中醫(yī)藥治療強(qiáng)調(diào)辨證論治，整體調(diào)節(jié)，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。

中醫(yī)認(rèn)為PMS的癥狀較為復(fù)雜多樣，個(gè)體差異較大，與多個(gè)臟腑相關(guān)，其中與肝的關(guān)系最為密切，其證型最常見(jiàn)的則是肝失疏泄及肝氣郁滯。大部分醫(yī)家將PMS的病因責(zé)之于情志因素。本病的發(fā)生于肝、脾、腎三臟關(guān)系密切，其中又以肝最為密切[4]。王曉娟等[5]認(rèn)為經(jīng)前期臟腑功能失調(diào)導(dǎo)致了此類(lèi)證候的發(fā)生，其中肝郁氣滯最為主要。對(duì)PMS中醫(yī)證型分布的臨床流行病學(xué)調(diào)查研究也提示其與肝的密切關(guān)系，鄭宸君[6]通過(guò)對(duì)502例PMS患者的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其中醫(yī)證型主要為肝氣逆證、肝郁氣滯證、陰虛肝旺證、肝氣乘脾證、肝火上炎證。

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，具有疏肝養(yǎng)脾，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之效，是治療PMS最為廣泛應(yīng)用的方劑之一。方中柴胡疏肝解郁，為君藥；當(dāng)歸養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，白芍柔肝養(yǎng)血，共為臣藥；白術(shù)、茯苓健脾祛濕，甘草和中健脾，共為佐藥；薄荷透肝經(jīng)郁熱，生姜溫胃和中，共為使藥。臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究也驗(yàn)證了逍遙散加減治療PMS的療效[7-11]，其臨床總有效率為83.30%～98.00%。

因此，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究逍遙散治療PMS分子水平上的作用機(jī)制，可為應(yīng)用逍遙散治療PMS提供理論支持[12]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討逍遙散治療PMS的分子作用機(jī)制，以求為該法的臨床應(yīng)用帶來(lái)更強(qiáng)的理論依據(jù)和新的思路。

1 資料與方法

1.1 逍遙散有效成分及潛在靶點(diǎn)獲取 應(yīng)用中藥分子作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology and Analysis Platform，TCMSP)檢索并獲得逍遙散中所有活性成分?jǐn)?shù)據(jù)，按口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件篩選出有效活性成分。以此篩選出具有較高活性的化學(xué)成分，構(gòu)建逍遙散的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。合并2個(gè)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)的成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，從而得到逍遙散八味中藥有效化學(xué)成分-潛在靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集。

1.2 PMS靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards和在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)檢索疾病名稱(chēng)“premenstrual syndrome”，從而得到PMS的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)構(gòu)建逍遙散-PMS靶標(biāo)韋恩圖，得到藥物和疾病的共同靶點(diǎn)，并獲取映射信息。再用Cytoscape 3.7.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖，用“節(jié)點(diǎn)”表示逍遙散，藥物活性成分、PMS和作用靶點(diǎn)，“邊”則表示節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.4 藥物-疾病核心蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 登錄STRING平臺(tái)，“物種”選擇“人”，導(dǎo)入得到的靶點(diǎn)交集數(shù)據(jù)集，從而構(gòu)建逍遙散治療PMS的PPI網(wǎng)絡(luò)。打開(kāi)Cytoscape 3.7.2軟件，導(dǎo)入所得STRING數(shù)據(jù)庫(kù)文件，選擇“Network Analyze”，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)：Degree值大于平均值，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾⒑Y選出核心靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)連接程度越高說(shuō)明蛋白質(zhì)之間關(guān)系越密切。將網(wǎng)絡(luò)圖以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape，以“Degree≥5”為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心蛋白基因。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 打開(kāi)DAVID平臺(tái)，導(dǎo)入篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)，分別在網(wǎng)頁(yè)中選擇并獲取生物過(guò)程(Biological Process,BP),細(xì)胞組分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)以及KEGG通路分析。設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為“P≤0.05”，從而篩選出符合條件KEGG通路及GO富集結(jié)果，分別以氣泡圖、表格的形式展示。

2 結(jié)果

2.1 逍遙散有效化學(xué)成分收集及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索TCMSP和BATMAN-TCM平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)得到逍遙散八味中藥的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、柚苷配基、谷固醇等，最終得到162種潛在核心化合物，預(yù)測(cè)出化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)2 618個(gè)。

2.2 逍遙散治療PMS潛在作用靶點(diǎn) 共得到逍遙散治療PMS潛在作用靶點(diǎn)768個(gè)。

2.3 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 獲取逍遙散和PMS共同靶點(diǎn)21個(gè)。見(jiàn)圖1。圖2矩形表示方劑逍遙散，八邊形表示PMS，三角形表示疾病和有效成分的共同潛在作用靶點(diǎn)(以基因表示)，橢圓形代表有效化學(xué)成分；共有節(jié)點(diǎn)36個(gè)，其中逍遙散、PMS各1個(gè)，有效成分105個(gè)，逍遙散治療PMS潛在靶點(diǎn)21個(gè)。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，節(jié)點(diǎn)的自由度前5位的有效成分為槲皮素(23)、豆甾醇(13)、山柰酚(13)、柚苷配基(11)、谷固醇(10)，這些成分與疾病的關(guān)系較大。

圖1 逍遙散-PMS潛在靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 逍遙散成分-PMS-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物-疾病的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖 PPI網(wǎng)絡(luò)圖3共有21個(gè)節(jié)點(diǎn)，48條邊，平均節(jié)點(diǎn)度4.57。篩選后共得到10個(gè)核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，核心靶點(diǎn)包括IKBKB、IL-6、IGFBP3、PGR、IGF2、PLAU、HIF1A、VEGFA、ESR1、CASP8。見(jiàn)圖4。

圖3 逍遙散治療PMS潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 逍遙散治療PMS核心靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集結(jié)果分析 GO生物過(guò)程分析得到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分條目共92個(gè)。最終篩選出分子功能19條、生物過(guò)程43條和細(xì)胞組分6條。將19條分子功能、6條細(xì)胞組分，和所得的43個(gè)生物過(guò)程條目按P值從小到大的順序排序取前20個(gè)條目，以氣泡圖的形式分別展示(圖5～7)。其中分子功能包括Steroid binding(類(lèi)固醇結(jié)合)、Enzyme binding(酶結(jié)合)、Steroid hormone receptor activity(類(lèi)固醇激素受體活性)、Protein binding(蛋白質(zhì)結(jié)合)等；生物過(guò)程包括Signal transduction(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱ promoter(RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始)、Negative regulation of IκB kinase/NF-κB signaling(IκB激酶/核因子κB信號(hào)的負(fù)調(diào)控)、Negative regulation of apoptotic process(凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控)等；細(xì)胞組分包括Extracellular space(細(xì)胞外空間)、Extracellular region(細(xì)胞外區(qū)域)、Cytoplasm(細(xì)胞質(zhì))等。

圖5 逍遙散治療PMS的分子功能分析

圖6 逍遙散治療PMS的生物過(guò)程分析

圖7 逍遙散治療PMS的細(xì)胞組分分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析得到21條KEGG通路，最終篩選出信號(hào)通路17條。見(jiàn)表1。包括NOD樣受體信號(hào)通路、癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、查加斯病(美國(guó)錐蟲(chóng)病)、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等，逍遙散治療PMS可能通過(guò)以上通路產(chǎn)生療效。

表1 KEGG富集分析

3 討論

中醫(yī)古典醫(yī)籍中并不曾記載過(guò)PMS這一病名，但將其不同的癥狀分別論述于“月經(jīng)前后諸證”中。PMS是一種以情感、行為和身體障礙為特征的綜合征，隨月經(jīng)周期反復(fù)出現(xiàn)，其癥狀常于黃體后期出現(xiàn)，月經(jīng)期逐漸減輕至消失[13]。中醫(yī)認(rèn)為“女子以肝為先天”，PMS的發(fā)生與肝的關(guān)系最為密切，喬明琦等[14]的流行病學(xué)調(diào)查顯示PMS中肝氣逆、肝氣郁二證分別占58.9%和27.5%。大部分醫(yī)家均認(rèn)為從肝論治PMS可取得較好療效。

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)分析經(jīng)典方劑逍遙散治療PMS的機(jī)制。首先把檢索獲取到的逍遙散有效成分和PMS潛在靶點(diǎn)信息取交集，從而描繪“藥物-成分-疾病”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)圖。進(jìn)一步通過(guò)GO和KEGG的富集分析，得到藥物潛在重要靶點(diǎn)干預(yù)的疾病通路和基本生物學(xué)通路，以期揭示逍遙散治療PMS的分子層次原理，從而對(duì)中醫(yī)臨床應(yīng)用，辨證用藥提供強(qiáng)有力的依據(jù)。

3.1 活性成分 通過(guò)檢索TCMSP和BATMAN-TCM平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)得到逍遙散八味中藥的活性成分主要有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、柚苷配基、谷固醇等，這些活性成分可能與治療PMS有關(guān)。

Yarjanli等[15]發(fā)現(xiàn)槲皮素藥理作用廣泛，包括抗炎、抗焦慮和認(rèn)知增強(qiáng)等。王佳等[16]發(fā)現(xiàn)山柰酚對(duì)大鼠具有顯著抗抑郁作用,其原理可能通過(guò)提高前額葉皮質(zhì)部位去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)遞質(zhì)水平達(dá)到抗抑郁作用。Tayyab等[17]發(fā)現(xiàn)柚苷配基除了抗抑郁作用外，還可抑制抑郁大鼠行為異常，緩解認(rèn)知障礙，緩解海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)的形態(tài)異常。另外槲皮素和山柰酚均屬于異黃酮類(lèi)，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似己烯雌酚以及雌二醇，是一種弱雌激素樣物質(zhì),在體內(nèi)起雌性激素樣和抗雌性激素樣的雙重調(diào)節(jié)作用[18]，或可通過(guò)對(duì)雌激素的調(diào)節(jié)，降低醛固酮血管緊張素Ⅱ，改善水鈉潴留導(dǎo)致的水腫、體質(zhì)量增加等癥狀[19]。由此可見(jiàn)，逍遙散中諸多活性成分具有明確的抗抑郁、抗焦慮、對(duì)雌激素的雙向調(diào)節(jié)作用，提示逍遙散對(duì)PMS情感、行為、軀體障礙均有潛在的治療作用。

3.2 靶點(diǎn) 通過(guò)“藥物-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖可以發(fā)現(xiàn)雌激素受體(Estrogen Receptor，ESR)1、ESR2、孕酮受體(Progesterone Receptor,PGR)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(Muscarinic Acetylcholine ReceptorM3，CHRM3)、鹽皮質(zhì)激素受體基因(Mineralocorticoid Receptor Gene,NR3C2)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione Transferase P1,GSTP1)、胱天蛋白酶8(CASP8)等是藥物治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn),采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑抑制卵巢功能使PMS癥狀得到控制后,加用外源性雌、孕激素反相添加，PMS癥狀有不同程度的重現(xiàn)，可見(jiàn)黃體后期雌、孕激素的異常對(duì)PMS的發(fā)生有一定程度的作用[20-21]。李學(xué)智[22]研究發(fā)現(xiàn)PMS獼猴和大鼠下丘腦ESR1和ESR2mRNA的表達(dá)水平、ESR2蛋白都有不同程度的下調(diào)；孕酮受體(Progesterone Rceptor,PGR)mRNA有所上調(diào)。于艷紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)PMS獼猴邊緣系統(tǒng)中，ESR1和ESR2 mRNA表達(dá)降低，PGR mRNA表達(dá)升高。提示逍遙散可能通過(guò)激素調(diào)節(jié)的方式治療PMS。核受體亞家族3組C分子2(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 2,Nr3c2，一種鹽皮質(zhì)激素受體)是公認(rèn)的焦慮抑郁相關(guān)基因[24]，張利蕊[25]研究發(fā)現(xiàn)NR3C2中多個(gè)位點(diǎn)可能與暴力攻擊行為有關(guān)聯(lián)。Lombardi等[26]研究發(fā)現(xiàn)PMS患者腎上腺皮質(zhì)對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放反應(yīng)高于非PMS患者。Cornelisse等[27]發(fā)現(xiàn)，NR3C2有決定下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis，HPA)活化閾值的作用。提示逍遙散可能通過(guò)調(diào)節(jié)HPA的方式治療PMS。

3.3 富集結(jié)果分析 GO功能富集結(jié)果顯示分子功能包括類(lèi)固醇結(jié)合、酶結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等，涉及的生物過(guò)程包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、IκB激酶/核因子κB信號(hào)的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始等。KEGG通路分析顯示逍遙散活性成分及靶點(diǎn)通過(guò)以上表格中多通路作用于PMS。

目前，人體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)10種Toll樣受體(Toll-like Receptor，TLR)TLR1～TLR10[28]，其中TLR4與抑郁的發(fā)生關(guān)系最為密切[29],在神經(jīng)元的形成、5-HT生成、HPA的平衡、抗抑郁藥物恢復(fù)神經(jīng)功能等過(guò)程中都扮演重要角色[30]。Pandey等[31]通過(guò)對(duì)死亡抑郁癥患者的尸檢發(fā)現(xiàn)，其中背外側(cè)前額葉皮質(zhì)TLR3和TLR4的mRNA水平增加。激活的TLR4可激活β干擾素Toll/白細(xì)胞介素1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終活化下游核因子κB信號(hào)通路，核因子κB進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起各種神經(jīng)病理改變[32-33]。長(zhǎng)期服用PMS的一線藥物氟西汀能夠明顯地降低TLR4基因的表達(dá)[34]。提示逍遙散可能通過(guò)抗抑郁，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)治療PMS。

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)分析并總結(jié)了逍遙散中主要有效成分、潛在的作用靶點(diǎn)及通路，揭示了逍遙散治療PMS分子機(jī)制。但仍有一定的局限性，如能進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本文中所述靶點(diǎn)通路的有效性，則能為臨床提供更加有力的依據(jù)。