基于16S rRNA高通量測序分析9種中藥飲片污染微生物群落特征*

陳 柯，陳 敏，林 黎，鄒惠亮

（湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

中藥飲片是一種特殊的藥品類型，是指中藥材經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐谥坪笾瞥傻目芍苯佑糜谥嗅t(yī)臨床或制劑生產(chǎn)使用的一類藥品。中藥飲片來源多樣，特別是植物和動物來源的飲片在加工炮制、運輸和儲存過程中容易受到微生物污染，從而影響中藥飲片的藥效和質(zhì)量安全[1]。近年來，在國家藥品監(jiān)督管理局展開的質(zhì)量抽檢活動中多次發(fā)現(xiàn)中藥飲片質(zhì)量不合格，其中微生物污染是導(dǎo)致其合格率低的重要原因之一[2-3]。目前，《中華人民共和國藥典》（2020年版）中對中藥飲片微生物限度的檢查方法沿用的仍然是傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，但這種方法的檢出率較低，有研究[4]表明，平板培養(yǎng)只能獲得不到1%的可培養(yǎng)微生物，這無法全面反映受污染的中藥飲片的微生物的實際情況，而病原微生物的污染卻有可能對人體帶來極其嚴(yán)重的危害。因此，對中藥飲片中的微生物群落特征進行鑒定具有重要意義。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測序可以同時對海量的基因序列進行測定，具有高輸出量和高解析度的優(yōu)點[5]，可以在大大縮短時間的同時提供豐富的遺傳學(xué)信息。本研究擬采用高通量測序?qū)φ憬『菔心咸貐^(qū)9種中藥飲片（每個品種10個批次，共計90批）進行16S核糖體RNA（16S rRNA）測序，獲得其污染微生物的菌落特征，了解中藥飲片微生物污染的實際情況，以期為中藥飲片微生物限度的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Miseq核酸測序儀（美國Illumina公司）、QuantStudioTM 6 Flex實時定量PCR擴增儀（賽默飛世爾科技公司）、SH-2020A全自動瓊脂凝膠糖電泳儀（北京金桑特醫(yī)用儀器有限公司）、MiSeq DNA Flex制備試劑盒（美國Illumina公司）、SYBR Premix Ex Taq ⅡDNA聚合酶試劑盒（日本TAKARA公司）。

1.2 方法

1.2.1 中藥飲片采集 柴胡、白術(shù)、山藥、玄參、麥冬、焦梔子、砂仁、鐵皮楓斗、金銀花共計9種來源于南太湖地區(qū)的中藥飲片品種，每個品種10個批次，共收集中藥飲片樣品90批。每批取100 g樣品在無菌條件下進行粉碎，取粉末待測。

1.2.2 控制菌檢查 根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版四部[6]中關(guān)于中藥飲片微生物限度檢查法的相關(guān)要求進行耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌的檢查。

（1）耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查：取10 g待測樣品，與TSB培養(yǎng)基以1∶10的比例進行混合，在20～25 ℃條件下培養(yǎng)2 h，取相當(dāng)于供試品0.1 g的預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，于35 ℃條件下培養(yǎng)48 h，然后于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上進行劃線接種，接種后繼續(xù)于35 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

（2）沙門氏菌檢查：取10 g待測樣品，與TSB培養(yǎng)基以1:10的比例進行混合，在33 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取0.1 mL培養(yǎng)物接種至10 mL RV沙門增菌液體培養(yǎng)基，繼續(xù)33 ℃培養(yǎng)24 h，然后于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上進行劃線接種，接種后繼續(xù)于33 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

（3）菌落鑒定：挑取上述平板培養(yǎng)基中不同形態(tài)的微生物菌落，再次劃線接種于TSA平板培養(yǎng)基中，分離純化后采用VITEK生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

1.2.3 高通量測序 先采用DNA試劑盒抽提DNA，然后進行PCR擴增，引物設(shè)計如下：

上游引物：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

下游引物：926R5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’。

擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃保持7 min，共35個循環(huán)。分別對細菌16S rRNA的V4-V5區(qū)進行PCR擴增，擴增結(jié)束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別測定260 nm和280 nm下的吸光度值（OD值），并采用兩者的比值評價DNA的純度。然后采用凝膠回收試劑盒回收PCR陽性擴增產(chǎn)物，并以其為模板，進行二次PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物，采用Quanti FluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量分析，然后按照測序要求進行混勻，采用MiSeq Reagent Kit v3（2×300 cycle）芯片進行測序。

1.2.4 多樣性分析 測得的序列采用FLASH和Trimmomatic軟件進行序列優(yōu)化，獲得有效序列，將最終優(yōu)化后的序列與數(shù)據(jù)庫中16S rRNA序列進行比對，并對上述序列進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分類，以97%的相似度聚類成同一個OUT，給予OUT序列進行α多樣性（alpha diversity）分析，獲得豐富度指數(shù)（Chaol指數(shù)）和多樣性指數(shù)，多樣性指數(shù)包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）和辛普森指數(shù)（Simpson index），在各分類水平上進行微生物群落特征分析。

2 結(jié)果

2.1 控制菌檢查結(jié)果 90批中藥飲片中有1批山藥檢測出沙門菌和大腸埃希菌，有41批檢出耐膽鹽革蘭氏陰性菌，各中藥飲片的的耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率見表1。其中檢出率最低的3種為焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗，檢出率最高的3種為山藥、金銀花和白術(shù)，這3種飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率明顯高于其它中藥飲片，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），總檢出率為45.56%。

表1 9 種中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率

2.2 菌落鑒定結(jié)果 9種中藥飲片中共鑒定出腸桿菌科、假單胞菌科、巴斯德氏菌科、莫拉菌科4個科的污染微生物，其中腸桿菌科檢出比例最高。鑒定出的微生物包括腸桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、克羅諾桿菌屬、沙門氏菌屬、埃希菌屬、巴斯德氏菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、變形桿菌屬共10個屬。鑒定出的微生物包括產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、成團泛菌、赫氏埃希菌、銅綠假單胞菌、中間腸桿菌、阪崎克羅諾桿菌、沙門氏菌、大腸埃希菌、多殺巴斯德氏菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、產(chǎn)粘變形桿菌、奇異變形桿菌共15個種。（見表2）

表2 9 種中藥飲片微生物鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA高通量測序結(jié)果 通過高通量測序獲得上述9種中藥飲片的有效序列，并對所有有效序列進行Tags聚類分析，并在97%的相似度下進一步進行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類分析。其中柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列，分別為33 691、33 284、33 169，鐵皮楓斗獲得最少的有效序列。所有樣品經(jīng)OTUs分析共計產(chǎn)生1 322個OTUs，其中前三位為柴胡、金銀花、山藥，其OTUs數(shù)量分別為184、173、162。（見表3）對上述樣品在97%的相似度閾值下進行α多樣性分析，共獲得186種污染微生物，并獲得各樣品的豐富度指數(shù)（Chaol指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）。（見表4）Chaol指數(shù)越大說明豐富度越高，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)越大說明多樣性越高。

表3 9 種中藥飲片高通量測序序列統(tǒng)計

2.4 屬水平微生物分布情況 在屬水平對9種中藥飲片中的污染微生物進行統(tǒng)計，相對豐富≥0.01的污染微生物共有32個屬，優(yōu)勢均屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。其中柴胡、玄參、鐵皮楓斗的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌屬，白術(shù)、山藥、焦梔子、砂仁、金銀花的優(yōu)勢菌屬為泛菌屬，麥冬的優(yōu)勢菌屬為鏈球菌。（見圖1）

圖1 9 種中藥飲片屬水平微生物相對豐富分布情況

3 討論

本研究選取的研究對象為9種常見的中藥飲片[7]，控制菌檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率為45.56%，沙門菌和大腸埃希菌也被檢出。沙門氏菌是誘發(fā)傷寒和急性腸胃炎的主要元兇，嚴(yán)重時可誘發(fā)敗血癥，危急生命安全[8]。大腸埃希菌正常情況下對人體無害，但某些類型的大腸埃希菌能通過產(chǎn)生內(nèi)毒素來誘發(fā)腹瀉[9]。本次結(jié)果還發(fā)現(xiàn)焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗這3種經(jīng)過炒制或者加熱烘干的飲片的檢出率最低。范一靈等[10]對100批中藥飲片進行需氧菌、霉菌、酵母菌及耐熱菌檢測，發(fā)現(xiàn)耐熱菌檢出率為61%，微生物風(fēng)險殘留較高。甘永琦等[11]對廣西等地區(qū)9種中藥飲片的微生物污染現(xiàn)狀進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)莖類飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌和耐熱菌污染率較高，而果實類飲片霉菌污染率較高。經(jīng)鑒定9種中藥飲片中共鑒定出4個科、10個屬共15種污染微生物。其中除沙門氏菌外，還檢測出了陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等重要的條件致病菌。微生物污染不僅有可能影響中藥飲片的質(zhì)量和療效，還可能影響其安全性[12]。該結(jié)果提示中藥飲片中的病原菌微生物污染不容忽視。

為了對中藥飲片中的微生物污染情況進行全面分析，本研究進一步采用高通量測序，結(jié)果在柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列，通常認為一個有效序列來自于一種菌，提示這3種中藥飲片中的基因信息最多。再進一步進行OTUs聚類分析以獲得各種中藥飲片中微生物的種屬信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡、白術(shù)和山藥具有最高的Chaol指數(shù)，柴胡、山藥和砂仁具有最高的Shannon指數(shù)，柴胡、山藥和砂仁具有最高的Simpson指數(shù)。而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗這3種飲片觀察到的微生物種類，以及Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都相對最低，這可能是由于其炮制過程有經(jīng)過炒制和加熱有關(guān)，該結(jié)果與前文控制菌檢查結(jié)果有相似之處。其中，Chaol指數(shù)越代表物種數(shù)量，Chaol指數(shù)越高，群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)是描述的是種的個體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，Shannon指數(shù)越高，群落的多樣性也就越高；Simpson指數(shù)指數(shù)代表的是群落中種數(shù)個體分配的均勻程度，Simpson指數(shù)越高，群落多樣性越好。這3種指數(shù)是通過不同的算法來反應(yīng)微生物群落的豐富度和均勻度，指數(shù)越高，通常代表微生物群落的多樣性越豐富[13-14]，以上結(jié)果提示柴胡、白術(shù)、山藥和砂仁這4種中藥飲片中的微生物多樣性最為豐富，而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗中的微生物多樣性最少。

高通量測序共獲得186種污染微生物，其數(shù)量遠遠高于控制菌檢出的15種污染微生物，且各種飲片在屬水平上具有很大差異，檢出最多的屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。甘永琦等[15]通過飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）和高通量測序?qū)Χ喾N中藥飲片中的耐膽鹽微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)最主要的微生物為腸桿菌科和假單胞菌科，屬水平上檢出率最高為腸桿菌屬和泛菌屬，與本研究有相似之處。腸桿菌屬包含陰溝腸桿菌等能誘發(fā)下呼吸道感染、軟組織感染的病原菌，這類病原菌對消毒劑和抗生素具有強烈的抵抗力，具有較強的耐藥性[16]。假單胞菌屬的銅綠假單胞菌是繼發(fā)性感染的主要條件致病菌，變形桿菌可導(dǎo)致腹膜炎、腦膜炎和敗血癥等，鮑曼不動桿菌可導(dǎo)致呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎等多種感染性疾病，肺炎克雷伯氏菌可以導(dǎo)致肺炎和敗血癥[17]。以上微生物都是引起醫(yī)院感染的重要病原菌。除了控制菌檢出的污染微生物外，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等菌屬僅在高通量測序中檢出，且經(jīng)相對豐度指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)麥冬的優(yōu)勢菌屬為鏈球菌。而這些菌屬是主要的致病菌和條件致病菌所在屬，金黃色葡萄球菌能引發(fā)食物中毒和多種化膿性炎癥；鏈球菌屬包含肺炎鏈球菌等多種致病菌，能引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、敗血癥、腦膜等多種臨床疾??；腸球菌屬對多種抗菌藥具有固有耐藥性，是僅次于葡萄球菌屬的最重要的醫(yī)院感染病原菌。

綜上所述，中藥飲片中存在微生物污染情況，并包含致病菌，具有一定的致病風(fēng)險。高通量測序可以無需通過微生物培養(yǎng)即可獲得中藥飲片中的微生物群落特征信息，與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)相比較，更加快速和全面。