細胞周期相關(guān)蛋白CENPF促進卵巢癌細胞的惡性行為研究

劉欣悅，張維娜，郭麗，湯心慧,2，趙天南,2，張裕民，張萍*

研究發(fā)現(xiàn)，包括卵巢癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征是腫瘤細胞的失控性增殖，而細胞周期幾乎涉及癌癥進展的每個階段，細胞周期的調(diào)控紊亂會導(dǎo)致細胞的失控性增殖[1]。著絲粒蛋白F(centromere proteinF,CENPF) 位于染色體1q41上，作為一種瞬時著絲粒蛋白，可調(diào)節(jié)多種細胞過程[2-3]。CENPF已在包括乳腺癌、肝細胞癌、甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等多種癌癥中觀察到上調(diào)[4-10]，CENPF參與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，與預(yù)后不良密切相關(guān)。此外，生物信息學(xué)分析表明，CENPF的表達與非肌層浸潤性膀胱癌的進展和卵巢癌的預(yù)后相關(guān)[11-12]。然而，CENPF在卵巢癌中的具體作用尚不清楚。PI3K/AKT/mTOR信號通路是人類細胞分子調(diào)控機制的重要途徑之一，在卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和周期調(diào)控中均有重要的作用[13]，許多研究表明阻斷PI3K/AKT/mTOR可作為治療卵巢癌的有效靶點[14]。本實驗通過生物信息學(xué)整合GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中卵巢癌與正常卵巢樣本同時合并細胞周期相關(guān)基因進行差異分析，發(fā)現(xiàn)CENPF作為核心基因在上皮性卵巢癌中顯著高表達，并與生存密切相關(guān)。同時，通過體外實驗探討CENPF對卵巢癌細胞惡性行為的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和化學(xué)試劑

人卵巢表面上皮細胞系(ovarian surface epithelial,OSE)由北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實驗室捐贈。人卵巢癌細胞株A2780、SKOV3、HEY、ES-2均保存于青島市市立醫(yī)院肝膽外科實驗室。根據(jù) ATCC 方案在指定培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有細胞系，并補充10%(v/v)胎牛血清和1%青鏈霉素,在37°C的加濕培養(yǎng)箱中加入5% CO2。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

為穩(wěn)定敲低各種卵巢癌細胞系中的CENPF基因，本研究分別使用了Genechem公司提供的慢病毒GV493載體(沉默CENPF的兩個不同片段，用于消除可能產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)，sh-CENPF#1∶5′-GCAACCATCTACTTGAAGA-3′;sh-CENPF#2∶5′-GCAGCGAGATTGTTCTCAA-3′)。實驗方法遵循制造商的手冊。感染后，用嘌呤霉素篩選細胞，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系。

1.3 CCK-8 測定

將轉(zhuǎn)染的 SKOV3 和 HEY 細胞(5×103個細胞)種植到96孔板中。CCK-8試劑盒用DMEM稀釋10倍。0、24、48、72 h分別用100 mL CCK-8溶液更換細胞培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)箱中保持2 h，在450 nm處測量光密度(OD)，計算相對細胞活力。

1.4 細胞周期測定

將轉(zhuǎn)染的SKOV3和HEY細胞(1×105個細胞)收集在1.5 mL管中用于細胞周期分析。加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇后，將細胞在4°C下孵育過夜。第2天，按照制造商的方案使用細胞周期和凋亡分析試劑盒對細胞進行染色。通過流式細胞術(shù)檢測染色的細胞。ModFit LT軟件用于測量結(jié)果。

1.5 Transwell實驗

Matrigel基質(zhì)膠提前取出放置4°C冰箱中，融化狀態(tài)備用。在Transwell小室的上室面底部加入Matrigel基質(zhì)膠。置于培養(yǎng)箱1 h，當出現(xiàn)白色層時取出待用。將SKOV3和HEY細胞重新懸浮在無血清培養(yǎng)基中，并將10% FBS添加到下室并在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，預(yù)冷的PBS沖洗2遍，用棉簽擦拭凈基質(zhì)膠及上室面細胞，隨后，將下室中的細胞固定在4%多聚甲醛中，隨后用0.5%結(jié)晶紫染色15 min。鏡下計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。隨機選擇3個不同視野計數(shù)。

1.6 細胞劃痕實驗

將轉(zhuǎn)染的SKOV3和HEY細胞接種在含有常規(guī)生長培養(yǎng)基的6孔板中，并使其生長至匯合。使用移液管尖端在匯合的單層細胞中產(chǎn)生單個劃痕并用PBS沖洗。劃痕后加藥(激動劑或抑制劑)，使用熒光顯微鏡在0 h、24 h的相同位置(劃痕區(qū)域)獲取圖像。拍照結(jié)束后用Image J軟件測量細胞遷移的距離，以愈合率=(0 h劃痕面積-當前劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取1/4體積5×上樣緩沖液與其混合均勻，100℃變性5 min；取等量蛋白(40 μg)上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂奶粉封閉含目的條帶區(qū)域的PVDF膜2 h,TBST洗膜10 min×3次；加入一抗CENPF、PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR和GAPDH抗體，4℃孵育過夜，PBS洗膜后加入HRP標記的羊抗鼠兔通用IgG室溫孵育1 h，PBS洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光進行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析，計算蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 確定與卵巢癌細胞細胞周期相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子

GSE14001、GSE54388、GSE40595和GSE14407是從GEO DataSets(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載的mRNA微陣列。使用R包“affy”和“sva”對數(shù)據(jù)進行去批次處理和標準化，總共合并了80個卵巢癌樣本和27個正常卵巢樣本。從MSigDB中提取和收集了一組細胞周期相關(guān)基因。“l(fā)imma”R軟件包對組合數(shù)據(jù)進行差異分析，截止標準為FDR<0.05和|log2fold change(FC)|>1，獲得了149個細胞周期相關(guān)的差異基因。使用string(http://www.string-db.org/)和cytoscape的MCODE構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選hub基因，得到17個hub基因(圖1A)。R語言繪制火山圖，如圖1B所示，左側(cè)代表下調(diào)基因，右側(cè)代表上調(diào)基因，可以看到CENPF作為一個細胞周期相關(guān)基因在卵巢癌組織中顯著上調(diào)。使用TCGA數(shù)據(jù)庫將人卵巢癌組織中CENPF的相對mRNA水平與正常組織進行比較。根據(jù)426個腫瘤組織和88個正常組織的比較，在卵巢癌組織中觀察到高水平的CENPFmRNA(圖1C)。此外，對數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)的生存分析顯示，CENPF的mRNA水平與卵巢癌患者的總生存率和無進展生存率相關(guān)(圖1D)，表明CENPF表達與患者預(yù)后密切相關(guān)。隨后，檢測其在卵巢癌細胞系(SKOV3、A2780、HEY和ES-2)中的表達，并以O(shè)SE作為對照。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，卵巢癌細胞系中CENPF的蛋白表達均明顯高于OSE細胞系(圖1E)。其中SKOV3和HEY中CENPF的相對蛋白表達量較高，用于后續(xù)實驗研究。

注：A.卵巢癌細胞周期相關(guān)的核心基因。B，C.CENPF在卵巢癌組織中表達情況。D.CENPF表達與生存預(yù)后的關(guān)系。E.CENPF在正常卵巢上皮細胞與卵巢癌細胞系中的表達情況。與正常卵巢上皮細胞相比，**P<0.01。

2.2 沉默CENPF可以抑制卵巢癌的惡性行為

蛋白質(zhì)印跡分析表明沉默CENPF表達的卵巢癌細胞系(SKOV3和HEY)驗證成功(圖2A，見彩插4)。相比空轉(zhuǎn)對照(sh-NC)組，CCK-8細胞活力測定證明，沉默CENPF組(含sh-CENPF#1組和sh-CENPF#2組)的細胞增殖明顯被抑制(P<0.01)(圖2B,見彩插4)，劃痕實驗驗證沉默CENPF組的遷移能力也較對照組顯著下降(P<0.01)(圖2C，見彩插4)，transwell實驗證實沉默CENPF組的侵襲能力較對照組也明顯減弱(P<0.01)(圖2D，見彩插4)，流式細胞術(shù)顯示細胞沉默CENPF組的周期細胞停滯在 G2/M 期(圖2E,見彩插4)。

2.3 CENPF可能通過PI3K/AKT/mTOR通路促進卵巢癌細胞的惡性行為

在沉默CENPF的卵巢癌細胞系中對PI3K/AKT/mTOR信號通路中的基因進行蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果表明與空轉(zhuǎn)對照(sh-NC)組比較，PI3K的表達有所下降，在AKT本底不變的情況下，AKT的磷酸化明顯被抑制，在mTOR本底不變的情況下，mTOR的磷酸化也明顯被抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3。

注：與sh-NC組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

細胞周期在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，異常的細胞周期調(diào)節(jié)導(dǎo)致細胞增殖失控。腫瘤細胞周期紊亂通常是由癌基因的變化引起的，這使其成為癌癥治療的一個有吸引力的途徑[15-16]。作為細胞周期相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，CENPF已被報道為許多腫瘤中的致癌基因。然而，CENPF 在卵巢癌進展中的確切作用仍然知之甚少。CENPF基因編碼與著絲粒-動粒復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是細胞間期G2期核基質(zhì)的組分，其在細胞周期中逐漸累積，直至在G2和M期細胞中達到峰值水平，并且在有絲分裂完成后迅速降解。CENPF首先于G2晚期在動粒前復(fù)合體中被檢測到，在有絲分裂期間，CENPF 與來自前中期的動粒相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)一直維持到后期，在整個后期的剩余部分中在紡錘體中區(qū)可以被檢測到[17]。

本研究通過 GEO 數(shù)據(jù)庫和細胞周期相關(guān)基因，分析了卵巢癌和正常卵巢組織樣本的差異，發(fā)現(xiàn)CENPF作為細胞周期的核心基因在卵巢癌中高表達，并且CENPF的表達水平與卵巢癌患者的總生存率和無進展生存率縮短顯著相關(guān)。以往的研究表明，CENPF 表達異常并改變了各種類型腫瘤的進展，如CENPF過表達與乳腺癌預(yù)后不良和骨轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]，F(xiàn)OXM1-CENPF軸參與前列腺癌的轉(zhuǎn)移[8]，CENPF蛋白是鼻咽癌進展的有價值標志物，CENPF表達與患者總生存期密切相關(guān)[19]，本研究結(jié)果與其一致。CENPF的缺失表達可以破壞動粒功能，使染色體分離滯后，從而延遲有絲分裂進程，其高表達還與染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability,CIN)標志物密切相關(guān)，包括細胞周期蛋白E過度表達、端粒酶活性增加、核生存素的高表達、c-Myc擴增等[20]，這些CIN標志物的異常表達發(fā)生在大約20%的高級別漿液性卵巢癌中，并且與不良預(yù)后相關(guān)[21]。有研究證明，敲低CENPF抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[22]，沉默CENPF可以使肝癌細胞在細胞周期G2/M期停滯并抑制Cyclin B1和Cyclin E1表達，還可以抑制ERK的磷酸化和NEK2的表達[23]。本研究證實了沉默CENPF可以抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及導(dǎo)致細胞有絲分裂G2/M期的停滯，說明靶向敲除CENPF可能抑制卵巢癌的惡性行為。

研究表明，CENPF的過表達與乳腺癌的預(yù)后不良和腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，且激活PI3K/AKT/mTORC1信號傳導(dǎo)促進乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移[24]。本研究檢測了PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果提示沉默CENPF明顯降低了PI3K、p-AKT/ AKT、p-mTOR/ mTOR的表達量。PI3K/AKT/mTOR信號通路在維持正常細胞功能中起著重要作用，PI3K、Akt和mTOR是該通路的三個主要節(jié)點，對其靶向調(diào)控在包括卵巢癌在內(nèi)的許多人類癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]，尤其是pSer在473位點激活A(yù)KT可以有效調(diào)控腫瘤細胞的惡性行為[25]，激活后的磷酸化AKT可以進一步磷酸化mTORC1直接激活mTOR[26]。大量研究證實，PI3K/AKT/mTOR調(diào)控細胞增殖、分化、細胞代謝和癌細胞存活，PI3K/AKT/mTOR的激活促進了腫瘤的發(fā)展，形成耐藥性[27-28]。本研究結(jié)果表明CENPF可能是PI3K/AKT/mTOR通路的一個上游靶標，控制卵巢癌的增殖、侵襲、遷移及有絲分裂。

本研究通過整合卵巢癌中細胞周期核心基因，篩選出在卵巢癌中高表達且與生存預(yù)后密切相關(guān)的基因，分別從細胞功能及分子機制方面對CENPF促進卵巢癌的惡性行為進行研究，為靶向治療卵巢癌提供了新的方向。但本研究仍不全面，還需加入相關(guān)通路激動劑、抑制劑來觀察細胞功能改變，進一步完善其分子機制，通過體內(nèi)研究更深入了解CENPF在卵巢癌中的作用。