多肽PFHCG對(duì)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及遷移的影響研究

夏卿，李春艷，張艷榕，黃鈺，呂明明，龍偉*

子癇前期是妊娠期特發(fā)性疾病，表現(xiàn)為妊娠20周后新發(fā)高血壓，伴有蛋白尿、水腫、多器官及系統(tǒng)功能障礙等，發(fā)病率2%～8%[1-2]，是導(dǎo)致母兒發(fā)病及死亡的重要原因[3-4]。二階段學(xué)說認(rèn)為，子癇前期是由于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，螺旋小動(dòng)脈重塑障礙，導(dǎo)致胎盤缺血、缺氧，進(jìn)而引發(fā)母體全身炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能障礙，出現(xiàn)子癇前期相關(guān)臨床表現(xiàn)[5]。

多肽是一種獨(dú)特的藥物化合物，介于小分子和蛋白質(zhì)之間，被證明是重要的生物活性分子，而非簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多肽逐漸進(jìn)入醫(yī)療領(lǐng)域，在疾病診療過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。其中，內(nèi)源性多肽(例如激素、生長(zhǎng)因子或神經(jīng)遞質(zhì)等)是人體內(nèi)天然存在的肽類物質(zhì)，在一定程度上參與疾病的病理生理過程，從而影響疾病的發(fā)生與進(jìn)展[8-13]。近年來，越來越多的研究表明，內(nèi)源性多肽在子癇前期診療領(lǐng)域也有著廣闊的發(fā)展前景，例如：腦鈉肽可反映子癇前期患者的心臟功能，作為判斷疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)[14]；Starodubtseva N等[15]的研究指出重度子癇前期組女性尿液中，多肽SERPINA-1排泄量顯著升高等。

本課題組在前期工作中借助質(zhì)譜分析技術(shù)，利用正常孕婦與子癇前期患者的血清樣本，篩選出24條差異表達(dá)的多肽，其中一條來源于蛋白質(zhì)HCG1982563的內(nèi)源性多肽PFHCG引起了我們的注意[16]。隨后，在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系中研究了多肽PFHCG在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的功能作用，同時(shí)通過RNA測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)多肽對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞基因水平的影響，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路分析，探討其可能的作用機(jī)制，并通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了富集通路中相關(guān)基因的基因表達(dá)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海，中國(guó))。HTR-8/SVneo細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10% FBS的1640培養(yǎng)基，置于37℃且含5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中。多肽(序列為：MLIMIKM)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并在多肽序列前添加穿膜序列(GRKKRRQRRRPPQQ)，純度>95%，多肽粉末溶解于高壓滅菌蒸餾水中，以1 mM濃度保存于-40℃ 冰箱中，使用前稀釋至相應(yīng)濃度。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組加入0.5、1、5、10、20、40 μM濃度的多肽進(jìn)行處理，對(duì)照組不加入多肽。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞消化后重懸，按照3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換成含相應(yīng)濃度多肽的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以此為0 h，分別于0 h、24 h、48 h時(shí)更換成含10%CCK-8試劑的1640培養(yǎng)基。在加入CCK-8試劑2 h后，使用多功能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H4)測(cè)定吸光度(波長(zhǎng)450 nm)。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞消化后重懸，按3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%左右，用微量移液器管嘴于孔中央輕輕劃出約1.5 mm寬度的劃痕，同時(shí)加入含相應(yīng)濃度多肽的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，以加入多肽時(shí)間為0 h，分別在0 h、24 h和48 h時(shí)，使用倒置顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))在100×的放大倍數(shù)下拍攝圖像，并使用Image J軟件測(cè)量劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞遷移面積(細(xì)胞遷移面積=0 h劃痕面積-檢測(cè)時(shí)劃痕面積)。

1.2.3 基因測(cè)序

(1)收取樣本 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞消化后重懸，培養(yǎng)于6孔板中。實(shí)驗(yàn)組多肽PFHCG終濃度為0.5 μM，對(duì)照組不加入多肽，兩組樣本各設(shè)置3個(gè)副孔。多肽處理24 h后，用PBS清洗三遍，每孔加入1 mL Trizol(TAKARA，日本)，收集樣本，保存至-80℃冰箱。

(2)基因測(cè)序 基因測(cè)序部分由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。從6個(gè)樣本中提取出RNA，將檢測(cè)合格的Total RNA 樣品進(jìn)行DNaseI消化，利用真核生物具有3’端polyA尾巴的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過oligo(dT)磁珠富集mRNA，進(jìn)行片段化處理，構(gòu)建文庫(kù)，質(zhì)控合格后，進(jìn)行測(cè)序、分析。

1.2.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用Trizol試劑(TAKARA，日本)從細(xì)胞中提取和純化總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，日本)，按說明書要求合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。將1 μL cDNA樣品、5 μL SYBR Green qRT-PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))、0.5 μL前引物和0.5 μL后引物放在冰上，制備反應(yīng)體系。用RNase-free水調(diào)節(jié)體積至10 μL。所有反應(yīng)均在ViiA7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃，10 min；40個(gè)循環(huán)(95℃，15 s；60℃，1 min)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用2-ΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)副孔以驗(yàn)證結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad Prism 8.0及Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表制作。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFHCG高濃度時(shí)可顯著抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖能力，低濃度時(shí)無顯著作用

將不同濃度PFHCG加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)液中，待培養(yǎng)24 h、48 h后，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。其中高濃度組結(jié)果顯示：當(dāng)處理24 h后，與對(duì)照組相比，20 μM與40 μM組的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)處理48 h后，10、20、40 μM組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1A)。而低濃度組(0.5、1 、5 μM)吸光度值均無明顯改變(見圖1B)。提示多肽PFHCG在高于10 μM濃度時(shí)，對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力有顯著抑制作用，而在濃度低于5 μM時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖能力無顯著影響。

注：A.高濃度多肽PFHCG對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；B.低濃度多肽PFHCG對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。與對(duì)照組相比，***P<0.001。

2.2 PFHCG高濃度時(shí)可以顯著抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移，低濃度時(shí)可促進(jìn)其遷移

通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽PFHCG對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力的影響。高濃度組結(jié)果顯示：10、20、40 μM組細(xì)胞遷移能力均明顯低于對(duì)照組(見圖2A)。低濃度組結(jié)果顯示：多肽處理24 h后，0.5、1 μM組細(xì)胞遷移能力顯著高于對(duì)照組，5 μM組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多肽處理48 h后，0.5、1、5 μM組細(xì)胞遷移能力均明顯高于對(duì)照組；其中，0.5 μM組細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組間差異最明顯(見圖2B、圖2C)。

注：A.高濃度多肽PFHCG對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；B.低濃度多肽PFHCG對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；C.低濃度多肽PFHCG處理后的劃痕實(shí)驗(yàn)圖片(×100倍)。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果

2.3.1 差異表達(dá)基因分析 使用DEGseq數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選條件為FoldChange≥1.5，Qvalue≤0.05，共檢測(cè)到322個(gè)差異表達(dá)基因。使用火山圖表示兩組間差異基因情況(圖3A，見彩插1)：紅色圓點(diǎn)表示在實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)的基因，共217個(gè)；綠色圓點(diǎn)表示顯著下調(diào)的基因，共105個(gè)；灰色圓點(diǎn)表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。使用聚類熱圖表示兩組間差異基因情況：紅色代表在實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)的基因，綠色代表在實(shí)驗(yàn)組中顯著下調(diào)的基因(圖3B，見彩插1)。

2.3.2 差異表達(dá)基因GO富集分析 從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成及分子功能這3個(gè)方面對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，并進(jìn)行相應(yīng)的分類(圖4A，見彩插1)，結(jié)果表明：這些差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞內(nèi)，其中在生物學(xué)過程方面，差異基因多與細(xì)胞粘附功能相關(guān)(圖4B，見彩插1)。

2.3.3 差異表達(dá)基因KEGG Pathway分析 通過KEGG富集通路分析，尋找差異表達(dá)基因相關(guān)通路。結(jié)果顯示：差異基因相關(guān)通路多與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)(圖5A，見彩插2)；KEGG富集通路氣泡圖顯示，差異表達(dá)基因多富集于MAPK信號(hào)通路，表明多肽PFHCG的作用機(jī)制可能與MAPK信號(hào)通路相關(guān)(圖5B，見彩插2)。

2.4 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

查閱文獻(xiàn)后篩選出MAPK通路中與細(xì)胞增殖及遷移功能相關(guān)的基因，其中促進(jìn)增殖的基因?yàn)镸APK1[17]及DUSP4[18]，促進(jìn)遷移的基因?yàn)镻RKCB[19]，抑制遷移的基因?yàn)镠SPA6[20]。進(jìn)一步通過RT-qPCR結(jié)果顯示，與未加多肽的對(duì)照組相比，低濃度多肽PFHCG處理后的HTR-8/SVneo細(xì)胞中，MAPK1與DUSP4的mRNA水平無明顯改變，(見圖6A、6B)，PRKCB的mRNA水平明顯上調(diào)(見圖6C)，而HSPA6的mRNA水平則明顯下調(diào)(見圖6D)。這進(jìn)一步證實(shí)了，低于5 μM濃度的多肽PFHCG對(duì)細(xì)胞增殖能力無顯著影響，但可促進(jìn)細(xì)胞遷移，且其作用機(jī)制可能與MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

A：RT-qPCR法檢測(cè)MAPK1的mRNA水平圖；B：RT-qPCR法檢測(cè)DUSP4的mRNA水平圖；C：RT-qPCR法檢測(cè)PRKCB的mRNA水平圖；D：RT-qPCR法檢測(cè)HSPA6的mRNA水平圖。*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

多肽是由氨基酸構(gòu)成的、普遍存在于生物體內(nèi)的化合物，在人體生理及病理過程中都擔(dān)任了重要角色[21]。1922年，胰島素首次被提取并運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[22]，為糖尿病的治療帶來了新的希望，也為研究疾病發(fā)生機(jī)制及診療措施提供了新的方向。例如，ghrelin是一種來自胃泌酸腺的生長(zhǎng)激素肽[23]，在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中，Murphy G等[24]發(fā)現(xiàn)，較低濃度的血清ghrelin與胃非賁門腺癌和食管胃交界腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，這表明胃分泌的肽類激素在癌癥發(fā)生過程中有著潛在作用；連接肽由胰島β細(xì)胞分泌，其產(chǎn)生量與胰島素相等，連接肽的測(cè)量可用于評(píng)估體內(nèi)胰島素分泌水平，幫助診斷糖尿病及評(píng)估藥物療效[25]；腎上腺髓質(zhì)素是一種受缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1 (HIF-1)控制的低氧誘導(dǎo)肽[26]，在乳腺惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。

多肽在子癇前期疾病診療方面同樣有著巨大的潛力。研究表明，半胱氨酸肽可逆轉(zhuǎn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力不足的病理過程，有效改善內(nèi)皮功能障礙，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的高血壓和蛋白尿癥狀[28]；ELABELA是一種由發(fā)育中的胎兒和胎盤分泌的妊娠相關(guān)激素[29]，可顯著提高滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和增殖能力[30-31]；而在子癇前期小鼠模型中，使用利拉魯肽可顯著降低血壓，改善腎功能，減輕子癇前期相關(guān)臨床癥狀[32]。

胎盤對(duì)子癇前期疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。在二階段學(xué)說的亞臨床階段，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲不足，導(dǎo)致螺旋小動(dòng)脈重塑障礙，進(jìn)而引起缺血缺氧、氧化應(yīng)激等一系列病理改變，引發(fā)全身血管功能障礙及母體小血管痙攣[33-34]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在子癇前期患者血清中差異表達(dá)的多肽PFHCG對(duì)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的影響，并從基因水平方面進(jìn)一步研究了其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予滋養(yǎng)層細(xì)胞低濃度多肽PFHCG，可顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移，這一改變或可促進(jìn)螺旋小動(dòng)脈重塑，減輕胎盤缺血缺氧癥狀，為子癇前期的診療帶來新的思路。

然而，子癇前期是一種多通路、多機(jī)制的疾病，病理變化是多種因素共同作用的結(jié)果，本研究?jī)H通過體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及基因測(cè)序技術(shù)等探究了多肽PFHCG對(duì)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能及可能的作用機(jī)制。關(guān)于多肽PFHCG的其他生物學(xué)功能、以及未來在子癇前期診療方面的應(yīng)用，均需要進(jìn)一步研究。