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    基于牡丹皮微觀性狀與抗炎活性相關(guān)的“辨狀論質(zhì)”研究

    2022-11-01 12:15:46陳依婷王冰孫艷濤王詩(shī)雨吳俊英
    中醫(yī)藥信息 2022年10期
    關(guān)鍵詞:牡丹皮類群抑制率

    陳依婷,王冰,孫艷濤,王詩(shī)雨,吳俊英

    (遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 大連 116600)

    “辨狀論質(zhì)”是指根據(jù)藥材性狀的特點(diǎn)判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣[1]。中藥的“狀”既包括宏觀特征,如中藥材的形、色、表面和質(zhì)地等,也包括微觀特征,即中藥顯微特征[2]。目前國(guó)內(nèi)外“辨狀論質(zhì)”機(jī)制的研究較少,囊括的藥材僅30余種,大多基于藥材的宏觀特征,運(yùn)用感官技術(shù)來(lái)進(jìn)行“辨狀論質(zhì)”研究[3-5]。質(zhì)量評(píng)價(jià)方面,大多是研究藥材性狀與所含化學(xué)成分含量之間相關(guān)性[6],而一種或幾種化學(xué)成分的活性并不能完全代表藥材的整體藥效,因此根據(jù)活性成分的含量判斷中藥質(zhì)量有一定的片面性。本實(shí)驗(yàn)選擇牡丹皮為研究對(duì)象,通過(guò)研究其顯微特征和抗炎藥理活性,考察二者之間存在的相關(guān)性,為牡丹皮“辨狀論質(zhì)”研究提供參考依據(jù)。

    牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹(Paeonia suffruticaosaAndr.)的干燥根皮[7]。牡丹皮有清熱涼血、活血化瘀的功效,可令血流暢而不留瘀,血熱清而不妄行,用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、吐血和衄血等[8]。臨床也可用于降血糖、抗菌消炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[9]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)有關(guān)牡丹皮“辨狀論質(zhì)”機(jī)制的研究甚少,國(guó)外對(duì)牡丹皮的研究多是基于內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析、對(duì)牡丹皮代謝產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)等[10-11],未見(jiàn)涉及牡丹皮“辨狀論質(zhì)”的研究。牡丹皮粉性足,氣芳香,其所含淀粉粒及草酸鈣簇晶眾多,且簇晶直徑9~45 μm,排列成行,是牡丹皮最具特色的顯微特征[12]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牡丹皮粉末中草酸鈣簇晶顯微特征明顯且易于計(jì)數(shù)[13],極具代表性。牡丹皮的抗炎活性現(xiàn)代應(yīng)用較為廣泛[14],因此本實(shí)驗(yàn)選擇抗炎活性作為牡丹皮藥效的研究。通過(guò)對(duì)二者的相關(guān)性分析,揭示牡丹皮基于微觀性狀與抗炎活性的“辨狀論質(zhì)”內(nèi)涵。

    1 儀器與試材

    1.1 儀器

    生物顯微鏡(Nikon E100);TD 型電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);微量移液器(Thermo 賽默飛F2系列單道移液器);足腫脹測(cè)定儀(KW-7C);軟尺。

    1.2 主要試劑

    水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào):302-17-0,分析純);甘油(商丘圣邦生物科技有限公司,批號(hào):190202);角叉菜膠(Simga,批號(hào):127H1227);乙酰水楊酸(純度>91%,HPLC)由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.3 實(shí)驗(yàn)材料

    牡丹皮藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院康廷國(guó)教授鑒定均為正品藥材,見(jiàn)表1。健康小鼠250 只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(遼)2020-0001。

    表1 22批牡丹皮藥材產(chǎn)地

    2 方法與結(jié)果

    2.1 牡丹皮的顯微特征

    2.1.1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

    采用三因素六水平均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳實(shí)驗(yàn)條件,見(jiàn)表2。取1號(hào)牡丹皮藥材粉碎,按均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表分別過(guò)80目、100目篩,精密稱定50、80、120、150、180、200 mg共6份樣品于10 mL容量瓶中,加入相應(yīng)的甘油量后,用水合氯醛定容,搖勻,用微量移液器吸取50 μL于載玻片上,蓋好蓋玻片。6份溶液各平行裝片50張,在生物顯微鏡下觀察簇晶并計(jì)數(shù)。將所得結(jié)果平均分為5組并取平均值,計(jì)算每組平均值的RSD,見(jiàn)表3。

    表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表

    表3 均勻設(shè)計(jì)結(jié)果

    設(shè)Y為RSD%值,X1為樣品重量,X2為藥材粉碎粒度,X3為甘油量。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果可得:Y=117.760-0.937X2,R= 0.966,F(xiàn)= 55.063,Ymin =24.06。由此可知,影響RSD值的主要因素為X2粉碎粒度,X1、X3與Y無(wú)明顯相關(guān)性,可依實(shí)驗(yàn)情況而定。為降低RSD值,最佳水平組合條件為:樣品重量120 mg,粉碎粒度100目,加入甘油2 mL。

    2.1.2 牡丹皮中顯微特征指數(shù)的測(cè)定

    取22 批牡丹皮藥材粉末過(guò)100 目篩,精密稱定120 mg藥粉于10 mL容量瓶中,精密加入2 mL甘油,用水合氯醛定容,搖勻,用微量移液器吸取50 μL 于載玻片上,蓋好蓋玻片,每份溶液平行紙片50 張,于顯微鏡下觀察簇晶,計(jì)數(shù),所得結(jié)果分為5組并取每組平均值,按照公式(1)計(jì)算[15],結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。可以看出個(gè)別批次的牡丹皮顯微特征指數(shù)明顯較高,有的牡丹皮顯微特征指數(shù)區(qū)間相近。

    表4 牡丹皮顯微特征指數(shù)測(cè)定結(jié)果(±s)

    表4 牡丹皮顯微特征指數(shù)測(cè)定結(jié)果(±s)

    樣品號(hào)顯微特征指數(shù)(個(gè)/mg)顯微特征指數(shù)(個(gè)/mg)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 343±270 1 307±289 1 632±190 1 484±278 1 088±285 1 276±260 1 396±338 1 293±276 1 361±313 1 305±224 1 523±321樣品號(hào)12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 706±309 1 831±217 2 188±433 1 445±257 2 016±407 1 636±343 2 681±663 1 856±170 2 023±319 1 461±332 1 597±293

    其中,P:定量藥材顯微特征指數(shù)(個(gè)/mg);X:每片蓋玻片下藥材顯微特征數(shù);V:定量藥材混懸液總體積(mL);V':蓋玻片下藥材混懸液體積(mL);W:藥材重量(mg,按干燥品計(jì))。

    2.1.3 牡丹皮簇晶數(shù)據(jù)聚類分析

    以簇晶數(shù)據(jù)為變量,采用系統(tǒng)聚類法對(duì)不同來(lái)源的牡丹皮進(jìn)行聚類分析,所得垂直冰柱圖見(jiàn)圖1。

    圖1 牡丹皮簇晶數(shù)據(jù)垂直冰柱圖

    當(dāng)群集數(shù)為5時(shí),22批牡丹皮被劃分為5類:第Ⅰ類群包括11個(gè)品種,編號(hào)分別為1、2、4、6、7、8、9、10、11、15、21;第Ⅱ類群僅1 個(gè)品種,編號(hào)為5;第Ⅲ類群包括6 個(gè)品種,編號(hào)分別為3、12、13、17、19、22;第Ⅳ類群包3個(gè)品種,編號(hào)分別為14、16、20;第Ⅴ類群僅1個(gè)品種,編號(hào)為18。將顯微特征指數(shù)測(cè)定值與聚類分析結(jié)合,按照顯微特征指數(shù)測(cè)定值高低分出5 個(gè)類群的大小排列:Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。

    2.2 牡丹皮抗炎活性測(cè)定

    2.2.1 供試品溶液制備

    取22 批牡丹皮藥材適量,分別加5 倍量75%乙醇,回流提取2 次,過(guò)濾,合并濾液,減壓濃縮,得到牡丹皮流浸膏[16]。

    2.2.2 牡丹皮抗炎情況測(cè)定

    小鼠250 只,隨機(jī)分為25 組,每組10 只,分別為空白組、模型組、給藥組1~22組和陽(yáng)性組[17]。其中,各給藥組小鼠分別灌胃給予22 批牡丹皮提取液0.6 g/mL,陽(yáng)性組小鼠灌胃陽(yáng)性對(duì)照品阿司匹林溶液0.125 g/mL[18]。連續(xù)灌胃4 d,最后1次灌胃40 min后,除空白組外,對(duì)其余各組小鼠采用左后足趾處注射1%角叉菜膠混懸液0.05 mL 的方法建立炎性小鼠模型[19],空白組小鼠于同部位注射等量生理鹽水。于造模前及造模5、30 min和1、2、4 h后測(cè)量各組小鼠左足踝關(guān)下0.5 mm 處的周長(zhǎng)[20]。足腫脹抑制率用造模后相對(duì)于造模前周長(zhǎng)的增加值表示[21]。結(jié)果見(jiàn)表5,可以看出個(gè)別牡丹皮的抑制率較高,有的牡丹皮的抑制率區(qū)間相近。

    表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結(jié)果(±s)

    表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結(jié)果(±s)

    樣品號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11抑制率(%)39.54±31.82 39.80±36.97 46.11±26.90 75.04±17.88 63.48±20.13 68.84±26.24 73.71±36.23 31.80±39.73 81.61±49.81 49.95±26.61 61.74±19.09樣品號(hào)12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22抑制率(%)58.93±22.94 65.51±23.69 60.72±26.27 60.76±39.04 80.89±24.69 73.27±33.00 97.76±37.50 52.59±25.84 96.41±19.36 60.86±34.06 89.14±24.62

    足腫脹抑制率=(對(duì)照組足平均腫脹度-給藥組足平均腫脹度)/對(duì)照組足平均腫脹度×100%

    2.2.3 牡丹皮抗炎情況聚類分析

    以抗炎數(shù)據(jù)為變量,采用系統(tǒng)聚類法對(duì)不同產(chǎn)地的牡丹皮進(jìn)行聚類分析,所得垂直冰柱圖如圖2所示。

    圖2 牡丹皮抗炎情況垂直冰柱圖

    當(dāng)群集數(shù)為5時(shí),22批牡丹皮被劃分為5類:第Ⅰ類群包括3 個(gè)品種,編號(hào)分別為1、2、8;第Ⅱ類群包括3個(gè)品種,編號(hào)為3、10、19;第Ⅲ類群包括11個(gè)品種,編號(hào)分別為4、7、17、6、5、13、11、14、15、21、12;第Ⅳ類群包括3 個(gè)品種,編號(hào)分別為9、16、22;第Ⅴ類群包括2 個(gè)品種,編號(hào)為18、20。將足腫脹抑制率數(shù)值與聚類分析結(jié)合,按照足腫脹抑制率高低分出5 個(gè)類群的大小排列:Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。

    2.3 牡丹皮簇晶顯微特征指數(shù)與抗炎藥效相關(guān)性研究

    運(yùn)用SPSS 17.0 軟件,對(duì)簇晶顯微特征指數(shù)與足腫脹抑制率進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析,結(jié)果如下:相關(guān)系數(shù)R= 0.518,變量呈中等程度正相關(guān);P= 0.007 <0.01,變量相關(guān)性顯著??梢钥闯霾煌瑏?lái)源牡丹皮藥材簇晶顯微特征指數(shù)與其足腫脹抑制率呈顯著中等程度正相關(guān),即簇晶顯微特征指數(shù)越大,足腫脹抑制率越高。

    3 小結(jié)與討論

    本實(shí)驗(yàn)基于牡丹皮顯微特征(簇晶)與抗炎活性的相關(guān)性分析來(lái)評(píng)價(jià)闡釋“辨狀論質(zhì)”理論機(jī)制。相關(guān)性分析結(jié)果中,不同來(lái)源牡丹皮中簇晶顯微特征指數(shù)與抗炎活性有較顯著的相關(guān)性,呈中度正相關(guān),中藥的藥理活性直接反映藥材的優(yōu)劣,說(shuō)明牡丹皮簇晶的顯微特征指數(shù)可作為判斷藥材品質(zhì)優(yōu)劣的參考指標(biāo)。聚類分析結(jié)果中,山東青島的牡丹皮藥材(編號(hào)18)中簇晶的顯微特征常數(shù)明顯多于其他來(lái)源,其抗炎藥理作用也較其他來(lái)源的牡丹皮較為顯著,說(shuō)明產(chǎn)于山東青島的牡丹皮品質(zhì)較優(yōu),在牡丹皮的使用中可以優(yōu)先考慮該來(lái)源。其余的21 個(gè)品種中,相同產(chǎn)地的大都分為一類,說(shuō)明來(lái)源相同的牡丹皮質(zhì)量基本保持一致。

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)微觀性狀-簇晶進(jìn)行了研究,拓展了中藥“辨狀論質(zhì)”理論中“狀”的范圍,即中藥的“狀”既包括藥材宏觀性狀,也應(yīng)包括微觀性狀,即藥材的顯微特征。通過(guò)“狀-效”關(guān)聯(lián)研究,表明藥材的顯微特征與藥理活性存在關(guān)聯(lián),可以通過(guò)定性定量測(cè)定藥材性狀判別藥材品質(zhì),可為中藥“辨狀論質(zhì)”科學(xué)內(nèi)涵的研究提供參考依據(jù)。

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