薏苡種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記篩選及親緣關(guān)系分析

陸秀娟 潘虹 李祥棟 魏心元 陸平 石明

摘要：利用ISSR標(biāo)記對(duì)92份薏苡種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，從100條ISSR通用引物中篩選出11條多態(tài)性較好的引物，共擴(kuò)增出49條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占各自總條帶的比例為66.6%～100.0%;非加權(quán)組平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）對(duì)92份薏苡種質(zhì)的聚類結(jié)果一致，均分為3個(gè)類群，云南、貴州、福建3個(gè)省份的種質(zhì)表現(xiàn)出比較豐富的遺傳多樣性，其他省份的多樣性水平相對(duì)較低。

關(guān)鍵詞：ISSR標(biāo)記;遺傳多樣性;種質(zhì)資源;薏苡;類群;主成分分析

中圖分類號(hào)： S519.024? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0032-05

收稿日期：2018-04-23

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃（編號(hào)：黔科合重大專項(xiàng)字[2014]6023、黔科合支撐[2016]2608）;貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合人才[2015]4016）。

作者簡(jiǎn)介：陸秀娟（1989—），女，布依族，貴州冊(cè)亨人，從事作物栽培與生物技術(shù)研究。E-mail：lowaterve_643@126.cm。

通信作者：李祥棟，農(nóng)藝師，從事植物生理與分子調(diào)控研究，E-mail：lixiangdongsiji@163.com;石 明，研究員，從事作物遺傳育種研究，E-mail：shiming1616@126.com。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是育種的基礎(chǔ)，科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，從整體上把握物種資源的遺傳變異信息及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，可有針對(duì)性地選擇合適親本，為遺傳育種工作提供有益參考。

薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡屬1年生或多年生草本植物，是重要的藥食同源作物之一。目前，薏苡屬作物在世界范圍內(nèi)約有10個(gè)種或變種，《我國植物志》將薏苡屬分為5個(gè)種4個(gè)變種[1]。DNA分子標(biāo)記是研究遺傳多樣性和親緣關(guān)系的重要工具，近年來，Qin等采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）等分子標(biāo)記方法對(duì)薏苡種質(zhì)進(jìn)行篩選應(yīng)用[2-5]。Ma等利用17對(duì)SSR引物聚類分析來自我國和韓國的79份薏苡種質(zhì)資源時(shí)發(fā)現(xiàn)，我國薏苡和韓國薏苡有著比較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，大部分我國薏苡聚為1類，而所有的韓國薏苡被聚為1類[6]。江忠東等以薏苡（原變種）、念珠薏苡（變種）、薏米、水生薏苡、小珠薏苡等42份薏苡屬植物為材料，篩選出5對(duì)與落粒性基因相關(guān)的STS引物，并對(duì)薏苡屬植物的DNA多樣性進(jìn)行了分析，根據(jù)DNA多態(tài)性特征討論了薏苡屬植物的遺傳進(jìn)化關(guān)系[7]。當(dāng)前，薏苡的基因組信息尚未公布，相關(guān)遺傳性研究所用的標(biāo)記數(shù)量極為有限。簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間標(biāo)記（inter-simple sequence repeats，ISSR）由于不需要知道研究材料的遺傳背景，多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性研究[8-12]。本研究通過篩選ISSR分子標(biāo)記，對(duì)薏苡種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為薏苡優(yōu)異資源的挖掘、品種改良和分子鑒定提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試薏苡種質(zhì)材料共92份，其中，86份來自我國貴州、云南、福建等省份，5份來自老撾，1份來自韓國，詳見表1。

1.2 DNA提取

取薏苡飽滿籽粒，采用苗盤育苗;待生長(zhǎng)至3～4葉，采用天根植物新型基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度。

1.3 ISSR擴(kuò)增

將DNA稀釋至30～50 ng/μL再進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，10 μmol/L引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，45～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。12 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行ISSR分型檢測(cè)，ISSR引物來自網(wǎng)絡(luò)公布的100條通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 結(jié)果調(diào)查與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，記錄每個(gè)樣品在每個(gè)引物位點(diǎn)上條帶的有無，同一遷移位置有帶的記為1，無帶的記為0。采用Ntsys 2.10e軟件計(jì)算遺傳距離矩陣，并分別采用非加權(quán)組平均法（UPGMA法）、主成分分析（PCA）對(duì)親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物的篩選和擴(kuò)增條帶多態(tài)性

選取編號(hào)為71、72的樣品采用100條通用ISSR引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增，由表2可見，共篩選得到11對(duì)多態(tài)性引物、49條多態(tài)性條帶，引物最佳退火溫度（Tm）在48～55 ℃之間;11對(duì)引物中每對(duì)引物的總擴(kuò)增條帶數(shù)為3～10個(gè)，多態(tài)性條帶為3～8個(gè)，多態(tài)性條帶占比在66.7%～100.0%之間，其中，808、809、810、811、814、836、840、842、864這9對(duì)引物的多態(tài)性條帶占比為100.0%（圖1）。此外，從擴(kuò)增效果看，篩選出的引物基序分別為（AG）n、（GA）n、（CT）n、（ATG）n，其中以（AG）n、（GA）n重復(fù)基序?yàn)橹鳎@從側(cè)面反映出薏苡基因組AG、GA重復(fù)序列比較豐富，為下一步利用ISSR開發(fā)定向薏苡SSR標(biāo)記創(chuàng)造了條件。

2.2 薏苡種質(zhì)聚類分析

2.2.1 非加權(quán)組平均法（UPGMA） 由表3、圖2可見，以相似性系數(shù)0.57為標(biāo)準(zhǔn)，可將92份薏苡種質(zhì)劃分為2個(gè)大類3個(gè)類群;第Ⅰ大類包含2個(gè)亞類，即Ⅰ-1亞類、Ⅰ-2亞類，第Ⅰ-1亞類共48份，占供試種質(zhì)的52.17%，分別為我國云南15份、貴州13份、福建5份、湖南4份、河北2份、遼寧2份、浙江1份、江蘇1份、其他1份，老撾4份;第Ⅰ-2亞類共8份資源，占供試種質(zhì)的8.70%，均來自我國，其中云南6份、貴州2份;第Ⅱ類共36份資源，占供試種質(zhì)的39.13%，分別為我國云南8份、貴州9份、四川3份、福建3份、河北2份、山西2份、浙江1份、江蘇1份、山東1份、北京1份、其他3份，老撾、韓國各1份。從聚類結(jié)果整體來看，云南、貴州、福建3個(gè)省份的種質(zhì)表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性，其他國家或地區(qū)的多樣性水平相對(duì)較低，這可能與不同地區(qū)供試種質(zhì)數(shù)目的多少也有一定關(guān)系。

2.2.2 主成分分析法（PCA） 通過對(duì)92份薏苡種質(zhì)進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果表明，第一、第二主成分值分別為 13.73、3.28，貢獻(xiàn)率分別為34.12%、8.16%，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為42.28%，并可將92份薏苡種質(zhì)聚類分為A、B、C這3個(gè)類群（圖3）。主成分分析與UPGMA法聚類分析的結(jié)果基本一致，相比之下，類群A、B和Ⅰ-1、Ⅰ-2類群基本吻合，且2個(gè)類群的發(fā)散方向比較一致，均匯集成一個(gè)大類;類群C與類群A、B有不同的發(fā)散方向，且離遠(yuǎn)點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，因此，C類群與其他2個(gè)類群相比，具有更高的遺傳異質(zhì)性。

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)是育種的基礎(chǔ)。ISSR標(biāo)記屬顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、在不同作物中通用性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于多種作物的品種鑒定及遺傳多樣性分析評(píng)價(jià)中，特別是適用于沒有參考基因組序列信息的物種。汪斌等利用ISSR標(biāo)記結(jié)合SRAP、SSR標(biāo)記，繪制了紅麻、黃麻的DNA指紋圖譜用于不同品種的分子識(shí)別[12-13];馬紅勃等采用篩選的68個(gè)ISSR和SRAP標(biāo)記，構(gòu)建了187個(gè)單株的F2連鎖遺傳圖譜，可用于煙草重要農(nóng)藝性狀的基因定位和分子輔助選擇[14];李本英等篩選出18個(gè)ISSR標(biāo)記，分析了18個(gè)種群134份云南茶樹種質(zhì)的親緣關(guān)系和多樣性，全部材料間的相似系數(shù)為0.445～0.819，平均為0.512[15];李超等利用ISSR標(biāo)記技術(shù)，分析163份新疆核桃種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，居群間的遺傳距離與居群的地理距離之間具有較高的相關(guān)性[16];雒新艷等利用ISSR標(biāo)記探討了5個(gè)瓣類大菊品種的遺傳多樣性、分化程度和親緣關(guān)系[17];劉娟等則利用ISSR標(biāo)記遺傳距離結(jié)合不同取樣策略，構(gòu)建了新疆野杏的核心種質(zhì)[18]。夏發(fā)剛等利用16對(duì)SRAP引物初步構(gòu)建了73份薏苡種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，為薏苡遺傳研究、品種選育與資源保護(hù)提供了一定依據(jù)，但是在更多資源的指紋鑒定中卻力有未逮[19]。本研究從100對(duì)ISSR通用引物中篩選出11對(duì)多態(tài)性引物，可較好地劃分92份薏苡種質(zhì)，在薏苡基因組信息未公布而分子標(biāo)記相對(duì)缺乏的前提下，可用作薏苡分子指紋鑒定和遺傳多樣性研究的重要候選標(biāo)記，并與有限的SRAP、SSR標(biāo)記聯(lián)合使用，用于薏苡的遺傳分析。

一直以來，非加權(quán)組平均法（UPGMA法）聚類分析是遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析的重要方法，而主成分分析在研究物種親緣關(guān)系、不同種群的地理生態(tài)分布等方面有所應(yīng)用。聚類分析提供了豐富的數(shù)量信息，能夠量化地表現(xiàn)出不同種質(zhì)間的關(guān)系[20];而主成分分析則從不同的方向和層面提供更多個(gè)體或居群之間的信息，能夠直觀、形象地描述種質(zhì)資源或居群間的來源（或遺傳）差異[21]。有研究表明，種質(zhì)資源個(gè)體或居群間的親緣關(guān)系往往和地理分布有一定的關(guān)聯(lián)性[22]，但也有例外，本研究將92份薏苡種質(zhì)劃分為3類，但并不是來自同一地區(qū)的種質(zhì)都聚在一起，如編號(hào)為75、76、77、78的樣品和編號(hào)為74、79、80的樣品均為福建來源種質(zhì)，卻分別聚為2個(gè)類群，親緣關(guān)系和地理來源之間并未表現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián)性，這可能與取樣的不均衡性和標(biāo)記數(shù)量較少有關(guān)。張大樂等以聚類和主成分分析方法揭示了12個(gè)啤酒大麥品種的遺傳背景差異[23];宋燁等采用12對(duì)SSR引物，通過聚類和主成分分析將20個(gè)蘋果品種劃分為4個(gè)類群，比較準(zhǔn)確地反映了不同蘋果品種的親緣關(guān)系和加工品質(zhì)特點(diǎn)[24]。本研究通過非加權(quán)組平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）對(duì)92份薏苡種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，均分為3個(gè)類群，聚類結(jié)果基本一致，與前人的研究結(jié)論[23-24]相似。UPGMA聚類和主成分分析在遺傳關(guān)系聚類分析方面各有所長(zhǎng)，可結(jié)合2種分析方法互為印證、補(bǔ)充，更準(zhǔn)確地判斷不同個(gè)體或居群間的遺傳關(guān)系。

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