高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定廣東紫珠中5種成分的含量Δ

吳穎欣，王汝上，林明越

(1.佛山市中醫(yī)院西藥房，廣東 佛山 528000；2.廣州康臣藥物研究有限公司研發(fā)中心，廣州 510530；3.佛山市中醫(yī)院制劑中心，廣東 佛山 528000)

廣東紫珠CallicarpakwangtungensisChun為馬鞭草科紫珠屬落葉小灌木，通常高約2 m，主要分布于江西、湖南、福建、廣東和廣西等南方地區(qū)的低海拔山林之中[1]。廣東紫珠原為江西萍鄉(xiāng)地區(qū)民間習(xí)用藥，最早被收載于1996年《江西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]；由于其療效確切，應(yīng)用較為廣泛，是中成藥抗宮炎片、抗宮炎顆粒的主要原料之一，隨后于2010年被新增收載于《中華人民共和國(guó)藥典：一部》[3]。近年來(lái)，隨著對(duì)廣東紫珠資源的不斷開(kāi)發(fā)，對(duì)其所含化學(xué)成分研究的報(bào)道日益增加，從廣東紫珠地上部分分離鑒定到黃酮類、酚酸類、三萜類和苯丙素類等數(shù)十種化合物，包括含量較高的金石蠶苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素及木犀草苷[4-8]。

廣東紫珠以其干燥莖枝和葉入藥，中醫(yī)認(rèn)為其具有收斂止血、散瘀、清熱解毒的功效，可用于衄血、咯血、吐血、便血、崩漏、外傷出血及肺熱咳嗽等癥狀[9]。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，廣東紫珠具有抗炎[10-11]、抗菌[12-13]和止血[14-15]等活性，其所含的苯丙素類、黃酮類成分為其潛在主要藥理活性成分。動(dòng)物抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣東紫珠含有的苯丙素類成分連翹酯苷B能有效抑制小鼠耳腫脹及降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)6水平[16]；體外細(xì)胞抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)抑制作用，并能降低細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6水平[16]。上述研究結(jié)果提示，3種苯丙素類苷類化合物均具有較強(qiáng)的抗炎作用。廣東紫珠中的木犀草素和木犀草苷等主要黃酮類化合物經(jīng)藥效評(píng)價(jià)顯示具有抗炎、止血作用，這可能是廣東紫珠具有收斂止血、清熱解毒功效的主要活性部位[17-19]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)，其所含活性成分眾多，作用機(jī)制復(fù)雜多樣，采用限定1～2個(gè)化合物含量的傳統(tǒng)質(zhì)控方法常具有較大片面性，難以充分反映藥材真實(shí)質(zhì)量信息。因此，建立以有效成分為核心的多指標(biāo)中藥質(zhì)控體系方法具有較大現(xiàn)實(shí)意義。現(xiàn)行藥典僅對(duì)廣東紫珠中金石蠶苷及連翹酯苷B的含量做出規(guī)定，而毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷作為其中含量較高、藥理活性明確的有效成分未見(jiàn)有相關(guān)含量研究報(bào)道。因此，本研究采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)廣東紫珠中的連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草素和木犀草苷5種主要有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期為廣東紫珠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)；ME204E萬(wàn)分之一分析天平(d=0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；KQ-300DE型超聲波清洗器(功率為300 W，頻率為40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；AX-205十萬(wàn)分之一電子天平(d=0.000 01 g，瑞士Mettler公司)；CX-500A型高速多功能粉碎機(jī)(上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司)；Milli-Q Synergy型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

廣東紫珠購(gòu)自廣州清平藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地為廣西桂林市(8批均采自同一種植基地)，采收時(shí)間為2019年8月至2019年11月，經(jīng)廣州康臣藥物研究有限公司王汝上高級(jí)工程師鑒定為馬鞭草科植物廣東紫珠CallicarpakwangtungensisChun的干燥莖枝及葉。連翹酯苷B(批號(hào)：111811-201603；含量以96.6%計(jì))、金石蠶苷(批號(hào)：111812-201303；含量以96.9%計(jì))、毛蕊花糖苷(批號(hào)：111530-201914；含量以95.2%計(jì))、木犀草素(批號(hào)：111520-201605；含量以99.6%計(jì))及木犀草苷(批號(hào)：111720-201810；含量以93.5%計(jì))對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品食品檢定研究院。乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸(色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；其余所用試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

將采購(gòu)的廣東紫珠低溫干燥過(guò)夜，迅速粉碎后過(guò)三號(hào)藥篩，稱取過(guò)篩后的干粉約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，50 ℃下超聲提取30 min，室溫(25 ℃)放冷后，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量；搖勻后靜置取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得廣東紫珠供試品溶液。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取木犀草苷、連翹酯苷B、木犀草素、金石蠶苷和毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加入適量70%甲醇超聲溶解，放冷至室溫后用70%甲醇定容至刻度，制得連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷及木犀草素濃度分別為1.857、1.533、0.562、0.129及0.354 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性考察

色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫：0～5 min，20%A；5～20 min，20%～50%A；20～30 min，50%A；30～70 min，50%～80%A。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

取空白提取溶劑、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，依照上述該色譜條件進(jìn)樣分析，觀測(cè)5種待測(cè)成分峰形、分離度和理論塔板數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果顯示，5種待測(cè)成分色譜峰峰形尖銳對(duì)稱，無(wú)峰前沿或拖尾，分離度均≥1.5，理論塔板數(shù)按照連翹酯苷B計(jì)算不低于3 000，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素保留時(shí)間分別為17.911、26.026、39.767、45.480和57.003 min，表明該方法專屬性良好?？瞻滋崛∪軇?、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

A.空白對(duì)照品；B.混合對(duì)照品；C.供試品；1.連翹酯苷B；2.金石蠶苷；3.毛蕊花糖苷；4.木犀草苷；5.木犀草素A.blank control;B.mixed reference substance;C.test samples;1.forsythiaside B;2.poliumoside;3.verbascoside;4.galuteolin;5.luteolin圖1 HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0和2.0 mL至10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，充分混合均勻后即得梯度濃度混合對(duì)照品工作液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以對(duì)應(yīng)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Tab 1 Regression equation of standard curve of 5 components

2.5 檢測(cè)限、定量限考察

取最低濃度的混合對(duì)照品工作液(連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素濃度分別為46.43、38.33、14.05、3.23和8.85 μg/mL)，用70%甲醇稀釋成系列濃度的溶液。分別按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=3為檢測(cè)限(LOD)，以信噪比S/N=10為定量限(LOQ)。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素的LOD分別為0.348、0.383、0.281、0.215和0.295 ng，LOQ分別1.160、1.277、0.936、0.717和0.983 ng。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次，記錄5種待測(cè)成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素6次測(cè)定峰面積的RSD分別為0.46%、0.48%、0.67%、0.53%和0.98%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12和24 h時(shí)進(jìn)樣分析，記錄5種待測(cè)成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，24 h內(nèi)6次進(jìn)樣連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素峰面積的RSD分別為0.84%、0.58%、0.78%、0.69%和0.54%，表明樣品供試品溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取廣東紫珠樣品(批號(hào)：190816)粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按上述已建立的方法分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，記錄5種待測(cè)成分峰面積并計(jì)算6次測(cè)定的平均含量和RSD。結(jié)果顯示，連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素平均含量分別為7.84、6.88、1.29、0.09和0.20 mg/g，6次測(cè)定的RSD分別為0.98%、0.81%、1.01%、0.88%和0.85%(n=6)，表明建立的方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn)：稱取廣東紫珠(批號(hào)：190816)粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入新配置對(duì)照品溶液，按上述已建立的方法分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5種待測(cè)成分平均加樣回收率。結(jié)果顯示，連翹酯苷B平均加樣回收率為99.59%，RSD為1.04%；木犀草苷平均加樣回收率為100.20%，RSD為2.30%；金石蠶苷平均加樣回收率為98.98%，RSD為1.51%；毛蕊花糖苷平均加樣回收率為99.05%，RSD為2.04%；木犀草素平均加樣回收率為99.83%，RSD為1.87%，表明建立的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of recovery rate

2.7 樣品的測(cè)定

取8個(gè)不同采收批次(采收時(shí)間自2019年8月至2019年11月)的廣東紫珠樣品，分別按上述已建立的方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，記錄各樣品峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5種成分的平均含量，見(jiàn)表3。

表3 樣品的含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)Tab 3 Content determination results of samples (n=3,mg/g)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定

提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間對(duì)藥材中有效成分溶出提取均有較大影響。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別考察了料液比、提取溶劑、提取方法以及提取時(shí)間對(duì)5種成分提取率的影響，結(jié)果提示，料液比為1 ∶ 50、以70%甲醇為提取溶劑、超聲處理30 min對(duì)5種待測(cè)成分綜合提取效率最高。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參照已有的文獻(xiàn)報(bào)道，連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷最大吸收波長(zhǎng)在330 nm附近，木犀草苷和木犀草素最大吸收波長(zhǎng)在350 nm附近[20-22]。對(duì)供試品和對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)(190～400 nm)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)取330 nm時(shí)，5種待測(cè)成分色譜峰基線較平穩(wěn)、分離效果好、響應(yīng)值均較大，能較好反映樣品中5種待測(cè)成分的含量信息，故本方法最終采用330 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 柱溫的選擇

柱溫對(duì)色譜保留時(shí)間、分離度及峰形均有不同程度的影響，較高的柱溫可有效縮短色譜峰保留時(shí)間和降低峰寬，從而縮短分析時(shí)間、提高待測(cè)成分信噪比。本實(shí)驗(yàn)考察了室溫至45 ℃范圍內(nèi)不同溫度對(duì)5種待測(cè)成分分離測(cè)定效果的影響。結(jié)果顯示，柱溫取35 ℃最優(yōu)，5種待測(cè)成分保留時(shí)間適中，色譜峰形良好、信噪比較高且與相鄰色譜峰均能有效分離。

3.4 測(cè)定結(jié)果分析

黃酮類與苯丙素類成分為廣東紫珠的主要化學(xué)成分，含量豐富，且具有較為顯著的藥理活性，是評(píng)價(jià)廣東紫珠藥用價(jià)值與質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[11-15]。《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2020年版)中，廣東紫珠僅以連翹酯苷B和金石蠶苷含量為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)，中藥具有整體性、多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，僅以上述2種成分作為廣東紫珠的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)不夠全面，所以本實(shí)驗(yàn)考察了廣西桂林市同一種植基地中不同采收期廣東紫珠中連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷和木犀草素5種有效成分的含量，結(jié)果顯示，8—11月采收的8批次廣東紫珠中連翹酯苷B及金石蠶苷總量均能滿足現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2020年版)的要求(兩者總量≥0.5%)，說(shuō)明廣東紫珠在8—11月時(shí)間段采收均能滿足入藥要求。比較5種待測(cè)成分在廣東紫珠中的含量，發(fā)現(xiàn)5種成分在廣東紫珠中的含量差異較大，廣東紫珠不同采收期5種成分含量從高到低均為連翹酯苷B>金石蠶苷>毛蕊花糖苷>木犀草素>木犀草苷，故當(dāng)前《中華人民共和國(guó)藥典》選擇連翹酯苷和金石蠶苷為質(zhì)控指標(biāo)。比較5種有效成分不同采收期的含量，結(jié)果顯示，5種有效成分含量在8—11月均先升高后降低，其中連翹酯苷B、金石蠶苷和毛蕊花糖苷在10月中下旬含量最高，木犀草苷和木犀草素在9月下旬含量最高，按照當(dāng)前《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)要求，最佳采收期可為10月份。

本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定廣東紫珠中連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、木犀草苷和木犀草素5種主要有效成分的HPLC法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、簡(jiǎn)便性和準(zhǔn)確度均能較好地滿足科研和生產(chǎn)需求，可為廣東紫珠質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升提供一定的參考依據(jù)。