RP-HPLC法測定大鼠血漿中木犀草苷的濃度*

孫赫陽 于 寧 潘德麗 田景振 李 菲

1. 山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)，山東 泰安 271016；2. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是一種天然黃酮類化合物。研究發(fā)現，木犀草苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、祛痰等多種功效，具有抗呼吸道合胞病毒、流感A型病毒等多種病毒活性[1-2]。同時，對損傷的心肌細胞具有較強的保護作用，并可抑制多種腫瘤細胞增殖，起到抗腫瘤作用[3-4]。部分菊科、忍冬科、豆科等植物中都含有木犀草苷，2015年版《中國藥典》要求將木犀草苷作為金銀花、菊花、錦燈籠控制藥材質量的指標。因此，木犀草苷作為上述藥材的質量控制指標，是含有金銀花、菊花等中成藥的主要活性成分，也是此類中成藥進行質量控制和考察制劑藥動學特征的主要指標成分[5-7]。本研究建立了HPLC法測定大鼠血漿中木犀草苷的濃度，便于含有木犀草苷的制劑進行藥動學及生物利用度的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 依利特P230Ⅱ高效液相色譜儀(包括UV230Ⅱ紫外-可見檢測器，EC2006色譜數據處理工作站，大連依利特分析儀器有限公司)；TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；3K30超速冷凍離心機(德國Sigma公司)；UPT-I-107超純水機(成都超純科技有限公司)；BT-25S電子天平(塞多利斯科學儀器北京有限公司)。

1.1.2試劑 蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y22S6S3719)；木犀草苷對照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號17030705)；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3實驗動物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由山東魯抗醫(yī)藥有限公司提供，合格證號：SCXK(魯)20130001。

1.2 方法及統計學分析

1.2.1溶液的配制 對照品溶液：精密稱取木犀草苷對照品4.8 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到質量濃度為96.0 μg·ml-1對照品儲備液。儲備液加甲醇逐級稀釋，分別得到48、24、12、6、3 μg·ml-1系列濃度的溶液。

內標溶液：精密稱取蘆丁對照品5.0 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到濃度為100 μg·ml-1對照品儲備液。

1.2.2檢測波長的選擇 分別取蘆丁對照品和木犀草苷對照品適量，加甲醇溶解，以甲醇為空白對照，分別在UV波長200～400 nm范圍內進行掃描。

1.2.3色譜條件 色譜柱：大連依利特C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，并配以C18預柱(10 mm × 4.6 mm)；流動相：乙腈-0.2﹪磷酸(20∶80)；內標：蘆丁；檢測波長：348 nm；流速：1.0 ml·min-1；柱溫：室溫；進樣量：20 μl。

1.2.4血漿樣品的處理 取血漿樣品200 μl，加入內標蘆丁溶液20 μl，渦旋30 s。分別加入甲醇、乙腈各200 μl，渦旋30 s，4 ℃、15000 r·min-1離心15min。取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“1.2.3”項下色譜條件進行HPLC測定。

1.2.5線性范圍和定量下限 取大鼠空白血漿160 μl，加入不同濃度的木犀草苷對照品溶液40μl，使得血漿中木犀草苷濃度分別為0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 μg·ml-1。按照“1.2.4”項處理血漿，進樣測定，以木犀草苷與蘆丁的峰面積比值(Ai/A，Y)對木犀草苷質量濃度(X)進行線性回歸。

1.2.6回收率 取大鼠空白血漿160 μl，加入不同濃度木犀草苷對照品溶液40 μl，使血漿中木犀草苷濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每個濃度5個樣品。按照“1.2.4”項下方法處理后進樣測定，依照標準曲線的回歸方程計算樣品中所含木犀草苷量，計算方法回收率。

1.2.7精密度 取大鼠空白血漿160 μl，加入木犀草苷對照品溶液，制成血漿中木犀草苷濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1的樣品，按照“1.2.4”項下方法處理，分別于1d內連續(xù)測定5次及5 d內每天測定1次，計算日內精密度以及5 d內的日間精密度。

1.2.8穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿160 μl，加入木犀草苷對照品溶液，使木犀草苷在血漿中濃度分別為4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每個濃度樣品各5個，在以下不同條件下處理：室溫放置8 h、-20 ℃凍存1周和-20 ℃冷凍-室溫解凍3次，按照“1.2.4”項下方法處理后進樣測定，測得值與0 h測得值比較計算回收率。

2 結 果

2.1 檢測波長的選擇

蘆丁對照品和木犀草苷對照品溶液UV波長200～400 nm范圍內掃描結果見圖1。

圖1 蘆丁(A)和木犀草苷(B)對照品紫外掃描圖譜

由圖1可見，蘆丁和木犀草苷均在348 nm波長處有較大吸收峰，故檢測波長確定為348 nm。

2.2 方法的專屬性

大鼠空白血漿、空白血漿加入內標溶液、空白血漿加入內標和木犀草苷對照品溶液、樣品血漿加入內標溶液的色譜圖見圖2。

圖2 大鼠空白血漿(A)、大鼠空白血漿+內標(B)、空白血漿+內標+木犀草苷(C)、血漿樣品+內標(D)HPLC色譜圖 1-內標；2-木犀草苷

從圖2可知，內標蘆丁和木犀草苷的保留時間分別為8.0、10.1 min，且主峰、內標峰及相鄰物質峰間可完全分離，內源性成分對測定無干擾。

2.3 線性范圍和定量下限

以木犀草苷與蘆丁的峰面積比值(Ai/A，Y)對木犀草苷質量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.0865X+0.0232，r=0.9980。結果表明，木犀草苷在0.60～ 19.20 μg·ml-1范圍內線性關系良好，定量下限為0.60 μg·ml-1。

2.4 回收率

低、中、高三個濃度的血漿樣品中木犀草苷的方法回收率結果見表1。

表1 木犀草苷在大鼠血漿中的方法回收率

2.5 精密度

日內精密度以及日間精密度結果見表2。

表2 木犀草苷在大鼠血漿中的精密度

結果表明，低、中、高三個濃度的血漿樣品中木犀草苷的回收率在90.53%～94.97%，RSD均小于6%，說明該法的方法回收率符合樣品測定要求。

由表2可見，樣品日內和日間的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性

木犀草苷在大鼠血漿中的穩(wěn)定性結果見表3。

表3 木犀草苷在大鼠血漿中的穩(wěn)定性

由表3可見，木犀草苷血漿樣品在不同處理條件下均穩(wěn)定，符合樣品測定要求。

3 討 論

結合相關文獻[8-9]報道，實驗中分別考察了金絲桃苷、黃芩苷、刺五加苷B、槲皮素作為內標的情況。結果表明，在流動相為乙腈-0.2%甲酸(20∶80)時，金絲桃苷的保留時間為9.6 min，與木犀草苷峰無法完全分離；黃芩苷、刺五加苷B和槲皮素的保留時間均大于20 min，與木犀草苷保留時間相差過多。蘆丁與木犀草苷的保留時間接近，且二者的色譜峰完全分離，利于提高檢測的準確度和效率。同時，二者在348 nm均有較強吸收，可以采用同一波長進行測定，避免了切換波長可能導致基線波動的情況出現。血漿樣品處理采用的是蛋白沉淀法，固定有機溶劑和血漿的體積比為2∶1，單用甲醇沉淀蛋白木犀草苷的提取率為56.95%，采用甲醇和乙腈(1∶1)處理血漿木犀草苷提取率達到85.0%以上。因此，選擇甲醇和乙腈(1∶1)為溶劑采用蛋白沉淀法處理樣品。該法藥物的回收率高，重現性好，且操作簡便、快速，可用于測定血漿中木犀草苷的濃度。