HPLC法測(cè)定諾氟沙星膠囊的有關(guān)物質(zhì)

★李麗云 黎艷剛 朱海（云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650111）

諾氟沙星又稱(chēng)氟哌酸，是人工合成的第三代喹諾酮類(lèi)抗菌藥，1979年日本杏林制藥公司發(fā)現(xiàn)了該化合物并申請(qǐng)了專(zhuān)利。1983年該藥由默沙東作為申請(qǐng)人在意大利最初上市生產(chǎn)，當(dāng)時(shí)采用片劑形式，商品名為Noroxin。1984年由杏林制藥作為申請(qǐng)人在日本上市生產(chǎn)，所用商品名為Baccidal，同樣采用片劑形式，該藥目前仍然在日本上市。諾氟沙星膠囊于1987年在國(guó)內(nèi)上市，目前有批文690余條[1］，已有兩家制藥企業(yè)通過(guò)仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)。諾氟沙星在抗菌方面具備廣譜性，特別在抵抗需氧GNB（革蘭陰性桿菌）方面具備高效性，于體外可有效抑制腸桿菌科細(xì)菌中的多數(shù)菌屬，同時(shí)體外可抵御多種耐藥菌，對(duì)因敏感菌引發(fā)的尿路感染、傷寒、淋病、腸道感染、前列腺炎、其它沙門(mén)菌感染等具有治療作用[2］。

本文通過(guò)對(duì)中國(guó)藥典[3］所收載的諾氟沙星膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法及歐洲藥典所收載、參考文獻(xiàn)[4］所記載的諾氟沙星有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行了考察和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)上述方法存在雜質(zhì)控制不嚴(yán)、溶劑峰對(duì)主峰及雜質(zhì)峰的測(cè)定產(chǎn)生干擾、梯度洗脫過(guò)程中容易出現(xiàn)基線(xiàn)波動(dòng)等不足。因此，此項(xiàng)研究經(jīng)色譜條件的篩選，完成諾氟沙星膠囊相關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的建立，同時(shí)對(duì)其開(kāi)展方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，奧豪斯EX125ZH電子天平，梅特勒 DELTA 320型pH計(jì)。

諾氟沙星對(duì)照品及雜質(zhì)A對(duì)照品、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）對(duì)照品、依諾沙星（Enoxacin）對(duì)照品，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；諾氟沙星雜質(zhì)D對(duì)照品及雜質(zhì)2對(duì)照品均購(gòu)于TLC公司；諾氟沙星雜質(zhì)H對(duì)照品、雜質(zhì)B對(duì)照品、雜質(zhì)K對(duì)照品及雜質(zhì)E對(duì)照品均購(gòu)于CATO公司；諾氟沙星膠囊（自研）。甲醇為色譜純，水為純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用安捷倫 ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm× 4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為0.015 mol/L磷酸溶液（由三乙胺將pH調(diào)節(jié)為3.0±0.1）-甲醇（85∶15），流動(dòng)相B為甲醇，根據(jù)表1實(shí)施線(xiàn)性梯度洗脫處理；柱溫、流速分別設(shè)定為30 ℃、1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)為262 nm與278 nm。

2.2 溶液的配制

稀釋劑：即“2.1”項(xiàng)下的流動(dòng)相A。

供試品溶液：取適量諾氟沙星膠囊內(nèi)容物（與15 mg諾氟沙星相當(dāng)），精密稱(chēng)定，移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻后濾過(guò)，即得供試品溶液。

各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液：分別取諾氟沙星雜質(zhì)D、K、B、E 、2、A、H對(duì)照品約15 mg，精密稱(chēng)定，移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。

峰定位溶液：取諾氟沙星對(duì)照品約15 mg，精密稱(chēng)定，移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，分別量取上述雜質(zhì)對(duì)照品貯備液各4 mL，再通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻，作為峰定位溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：分別取環(huán)丙沙星對(duì)照品和依諾沙星對(duì)照品約15 mg，精密稱(chēng)定，移至50 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，加流動(dòng)相A定容至50 mL，搖勻；再取諾氟沙星對(duì)照品約15 mg，精密稱(chēng)定，并移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再加入1 mL上述混合液，之后通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻，即得系統(tǒng)適用性溶液。

空白輔料溶液：取適量諾氟沙星空白輔料（與15 mg的諾氟沙星相當(dāng)），精密稱(chēng)定，再移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，通過(guò)2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻后濾過(guò)，即得空白輔料溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的峰定位溶液、系統(tǒng)適用性溶液分別進(jìn)樣，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄。所得結(jié)果見(jiàn)圖1，系統(tǒng)適用性溶液和峰定位溶液中各雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離完全，分離度均大于2.0，理論塔板數(shù)均大于4 000，符合系統(tǒng)適用性要求。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

2.4.1 輔料干擾試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制備的峰定位溶液、供試品溶液、空白輔料溶液與稀釋劑分別進(jìn)樣，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄。所得結(jié)果見(jiàn)圖1，各雜質(zhì)峰處均未見(jiàn)空白輔料與稀釋劑出峰，表明輔料與溶劑皆不會(huì)影響對(duì)諾氟沙星膠囊的雜質(zhì)測(cè)定。

圖1 典型色譜圖

2.4.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和空白輔料溶液，分別置于2 mol/L鹽酸溶液中、105 ℃條件下酸破壞4 h；2 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液內(nèi)，105 ℃溫度時(shí)堿破壞4 h；30%雙氧水溶液0.1 mL中，105 ℃條件下氧化破壞3 h；105 ℃高溫下破壞24 h；光照（5 000±500）lx條件下1個(gè)月，處理完成后分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明諾氟沙星膠囊在酸、堿、氧化、高溫、光照條件下均相對(duì)穩(wěn)定，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物較少，各降解產(chǎn)物峰與諾氟沙星主峰能完全分離，峰純度合格，滿(mǎn)足專(zhuān)屬性強(qiáng)制破壞要求。

2.5 線(xiàn)性和范圍

取諾氟沙星對(duì)照品約15 mg，精密稱(chēng)定，移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻，即得諾氟沙星對(duì)照品貯備液；分別精密量取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液1 mL以及上述諾氟沙星對(duì)照品貯備液1 mL，移至25 mL量瓶?jī)?nèi)，通過(guò)流動(dòng)相A定容至25 mL，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液；對(duì)此混合液分別進(jìn)行不同量的準(zhǔn)確量?。?.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.06、0.1 mL，逐一移至液相色譜儀，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄。橫坐標(biāo)（X）、縱坐標(biāo)（Y）分別為“對(duì)照品的進(jìn)樣量（單位：ng）”“峰面積”，開(kāi)展線(xiàn)性回歸，得到回歸方程與相關(guān)系數(shù)r。見(jiàn)表2。

2.6 定量限和檢測(cè)限

分別量取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液及“2.5”項(xiàng)下諾氟沙星對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相A稀釋至信噪比為10∶1和3∶1的濃度，精密量取上述對(duì)照品溶液各0.02 mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見(jiàn)表2。

表2 諾氟沙星及已知雜質(zhì)的線(xiàn)性關(guān)系及靈敏度測(cè)定結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 儀器精密度 精密量取1 mL“2.5”項(xiàng)下諾氟沙星對(duì)照品貯備液，移至25 mL量瓶?jī)?nèi)，用流動(dòng)相A定容至25 mL，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取上述對(duì)照品溶液0.02 mL，注入液相色譜儀，共進(jìn)行6次不間斷進(jìn)樣，記錄色譜圖，通過(guò)主峰峰面積與保留時(shí)間的RSD波動(dòng)，考察儀器于此色譜條件下的精密狀況。結(jié)果顯示，關(guān)于對(duì)照品溶液，其主峰峰面積、保留時(shí)間RSD值依次是1.88%、0.69%，可見(jiàn)儀器于此色譜條件下具備良好精密度表現(xiàn)。

2.7.2 重復(fù)性 依照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法，完成6份供試品溶液的制備，之后分別準(zhǔn)確吸量0.5 mL，移至100 mL量瓶?jī)?nèi)，通過(guò)流動(dòng)相A定容至100 mL，搖勻，即得對(duì)照溶液；分別準(zhǔn)確吸量此對(duì)照溶液與供試品溶液0.02 mL，移入液相色譜儀，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄，根據(jù)外標(biāo)法，通過(guò)峰面積對(duì)已知雜質(zhì)含量展開(kāi)求解，得到雜質(zhì)K的RSD值是1.97%，可見(jiàn)此法具備良好重復(fù)性。

2.7.3 中間精密度 依照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法，由不同操作者，借助不同儀器于不同時(shí)間，取12份批次相同的樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，考察方法的中間精密度，其中第1天的數(shù)據(jù)引用重復(fù)性項(xiàng)下的結(jié)果，結(jié)果顯示雜質(zhì)K的RSD值等于3.93%，可見(jiàn)此法具備良好中間精密度。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別量取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液及“2.5”項(xiàng)下諾氟沙星對(duì)照品貯備液2 mL，移至50 mL量瓶?jī)?nèi)，通過(guò)流動(dòng)相A定容至50 mL，搖勻，即得對(duì)照品混合貯備液；之后量取2.5 mL，移至50 mL量瓶?jī)?nèi)，通過(guò)流動(dòng)相A定容至50 mL，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液。取空白輔料適量，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，分別加入對(duì)照品混合貯備液2.0、2.5和3.0 mL，通過(guò)流動(dòng)相A定容至50 mL，搖勻后濾過(guò)，取續(xù)濾液制備不同濃度供試品溶液，低、中、高濃度依次為80%、100%、120%，各濃度皆重復(fù)配樣3份，分別移入液相色譜儀，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄，借助外標(biāo)法，經(jīng)由峰面積對(duì)已知雜質(zhì)含量展開(kāi)計(jì)算。結(jié)果顯示，諾氟沙星雜質(zhì)D、K、B、E、2、A、H及諾氟沙星的平均回收率為99.19%、107.95%、98.85%、103.43%、106.16%、106.05%、102.35%、99.04%，RSD值為0.60%、2.40%、1.28%、1.51%、1.28%、1.29%、0.98%、2.64%，表明本法檢查有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

依照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法進(jìn)行供試品溶液的制備，靜置于室溫中，分別于0、4、8、12、16、20、24 h精密吸量上述樣品溶液0.02 mL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液內(nèi)總雜質(zhì)、最大單雜、已知雜質(zhì)皆未見(jiàn)明顯改變，同時(shí)無(wú)新雜質(zhì)形成，可見(jiàn)供試品溶液于室溫靜置24 h依然具備穩(wěn)定性。

2.10 耐用性試驗(yàn)

經(jīng)由調(diào)整流速、流動(dòng)相比例、磷酸鹽酸堿度、柱溫、廠(chǎng)家不同、批號(hào)不同的色譜柱來(lái)考察擬定色譜條件的耐用性。準(zhǔn)確吸量0.02 mL供試品溶液，移至液相色譜儀，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄。結(jié)果表明當(dāng)流速變動(dòng)±10%、柱溫變動(dòng)±5 ℃、磷酸鹽pH值變動(dòng)±0.2、流動(dòng)相的比例變動(dòng)±2%、改變色譜柱時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果不造成影響，說(shuō)明本法對(duì)流速、柱溫、磷酸鹽pH值、流動(dòng)相的比例、色譜柱的耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

按照經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對(duì)自研諾氟沙星膠囊的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查。見(jiàn)表3。

表3 關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果………… %

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，河南省藥檢所于2018年對(duì)43批次諾氟沙星膠囊進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)督抽驗(yàn)，按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，部分批次的諾氟沙星膠囊主峰前有一雜質(zhì)峰與主峰未完全分離，該雜質(zhì)峰應(yīng)為雜質(zhì)E[5］；與此同時(shí)，浙江省臺(tái)州市藥檢所于2017年對(duì)57批次諾氟沙星膠囊進(jìn)行了抽驗(yàn)，有關(guān)物質(zhì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)廠(chǎng)家的5批次樣品中檢出雜質(zhì)E超標(biāo)，1批檢出雜質(zhì)K在限度邊緣[1］。因此，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，諾氟沙星膠囊的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法需要修訂提高。

本研究是在《中國(guó)藥典》收載的諾氟沙星膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件進(jìn)行了調(diào)整，經(jīng)專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、定量限和檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性等試驗(yàn)的驗(yàn)證后，確認(rèn)該檢測(cè)方法不僅準(zhǔn)確可靠，而且可以檢測(cè)出諾氟沙星的7個(gè)雜質(zhì)，尤其是諾氟沙星原料于合成期間生成的雜質(zhì)E和雜質(zhì)K。如表3所示，自研的諾氟沙星膠囊中含0.12%的雜質(zhì)K，說(shuō)明該有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法更有利于控制原料藥及產(chǎn)品的質(zhì)量。