苯基吡啶酮衍生物影響豬δ冠狀病毒復(fù)制的作用分析

姚 晨，郭 萌，胡 慧，史晨曦*，楊國宇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002； 3.河南省動物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

冠狀病毒(Coronavirus)屬于套式病毒目()，冠狀病毒科()，冠狀病毒亞科()的成員，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈不規(guī)則形狀，直徑60～220 nm，根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)及分子系統(tǒng)發(fā)育樹，冠狀病毒可分為α、β、γ和δ 4個屬。迄今為止，已確定能感染豬的冠狀病毒有6種：α冠狀病毒，包括豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、豬腸道甲型冠狀病毒(swine enteric alphacoronavirus, SeACoV)和豬呼吸道冠狀病毒；β冠狀病毒，包括豬血凝性腦脊髓炎病毒；以及豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV，也稱豬丁型冠狀病毒)。其中，TGEV、PEDV、PDCoV和SeACoV臨床癥狀極其相似，均能引起豬腹瀉病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。

PDCoV是近年新發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道致病性冠狀病毒，在全球范圍內(nèi)持續(xù)傳播，給經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生帶來了壓力。2012年，PDCoV首次在中國香港豬糞便中檢測到，2014年,在美國首次暴發(fā)，隨后,在世界其他國家和地區(qū)也檢測到PDCoV，PDCoV會導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水，死亡率為40%～50%。2021年，在海地三名兒童的血漿樣本中檢測到了突變后的PDCoV，提示PDCoV可能存在感染人的風(fēng)險。目前，仍無抗PDCoV的疫苗或藥物。因此，有必要篩選出有效對抗PDCoV感染的藥物。

苯基吡啶酮衍生物JIB-04是一種體內(nèi)、外Jumonji去甲基化酶抑制劑，而且不影響其他α-酮戊二酸依賴性羥化酶或組蛋白修飾酶。JIB-04會抑制癌細(xì)胞的生長，但不會影響正常細(xì)胞的生長。已證實(shí)，JIB-04對包括結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌細(xì)胞在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，但抑制機(jī)制尚不清楚。此外，在患有嚴(yán)重?cái)U(kuò)張型心肌病的小鼠模型中，JIB-04通過抑制Jumonji去甲基化酶活性，導(dǎo)致心臟中的組蛋白去甲基化酶功能降低和組蛋白甲基化水平升高，從而延長小鼠生存期。目前，關(guān)于JIB-04的研究多集中在抗腫瘤領(lǐng)域，對于JIB-04的抗病毒報(bào)道并不多見。本研究證實(shí)了JIB-04抑制PDCoV復(fù)制的生物學(xué)功能，為抗冠狀病毒藥物的研發(fā)提供依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

JIB-04由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物化學(xué)與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成，并利用核磁共振對化合物進(jìn)行表征分析，無雜峰，純度> 95%；高糖DMEM培養(yǎng)液購自北京索萊寶公司；MEM培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素混合液(100×)、HEPES、NEAA、0.05%胰蛋白酶、胎牛血清、細(xì)胞CO培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱購自美國Thermo公司；豬源PDCoV多克隆一抗由河南省動物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；anti-GAPDH、羊抗兔和羊抗豬IgG二抗均購自Proteintech公司； ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK-8試劑盒購自碧云天生物公司；Amersham ImageQuant 800生物分子成像儀購自美國GE Amersham生物公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇等分子試劑購自北京化工公司；熒光定量RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 病毒和細(xì)胞培養(yǎng)

LLC-PK細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)為本實(shí)驗(yàn)室保存；本研究所使用的PDCoV為HNZK-02(GenBank登錄號：MH708123.1)，為本實(shí)驗(yàn)室分離自河南周口某暴發(fā)PDCoV感染豬場的腹瀉病料樣品，經(jīng)LLC-PK細(xì)胞連續(xù)傳代，本研究所用PDCoV為第33代病毒。LLC-PK細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，用含有5%胎牛血清、1%雙抗、1% HEPES、1% NEAA的MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力檢測

按照每孔約5×10個細(xì)胞接種96孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，用PBS洗2遍，隨后換成含不同濃度JIB-04(0、5、10、20、40、80、160、320、640 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基，設(shè)置只含不同濃度JIB-04的無細(xì)胞空白對照組，24 h后，移除培養(yǎng)基，換成含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基(每孔100 μL)培養(yǎng)2 h，讀取450 nm的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力和半數(shù)毒性濃度(CC)。

半數(shù)有效濃度(EC)的測定，分別用含不同濃度JIB-04(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、8、9.6、12.8、16 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞2 h，PBS洗2遍，用含不同濃度JIB-04的無血清培養(yǎng)基稀釋病毒并接種細(xì)胞，接毒量為MOI=0.1，37 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，加入含不同濃度JIB-04的無血清培養(yǎng)基，22 h后移除培養(yǎng)基，換成含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基(每孔100 μL)培養(yǎng)2 h，讀取450 nm的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力、半數(shù)有效濃度(EC)和藥物選擇性指數(shù)(SI=CC/ EC)。

1.4 JIB-04的抗病毒作用

按照每孔約4×10個細(xì)胞接種12孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時用PBS洗2遍，按以下方式處理。JIB-04對病毒感染的預(yù)防作用：每孔加入含不同濃度JIB-04(0、5、10、20 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS洗2遍，隨后接種病毒，接毒量為MOI=0.1，37 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，每孔加入1 mL含胰酶的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)22 h，收取細(xì)胞混合液。JIB-04對病毒感染的治療作用：用含不同濃度JIB-04(0、5、10、20 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基稀釋病毒并接種細(xì)胞，接毒量為MOI=0.1，37 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，每孔加入1 mL含不同濃度JIB-04和胰酶的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)22 h，收取細(xì)胞混合液。將上述細(xì)胞混合液放置-80 ℃，反復(fù)凍融3次，用于TCID試驗(yàn)。

1.5 JIB-04對病毒吸附細(xì)胞的影響

為了檢測JIB-04對病毒吸附的影響，根據(jù)之前的研究方法，進(jìn)行試驗(yàn)：按每孔約4×10個細(xì)胞接種12孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時用PBS洗2遍，加入含JIB-04(10 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基，對照組為不含JIB-04的無血清培養(yǎng)基，37 ℃處理2 h，用PBS洗2遍，隨后接種10 MOI的PDCoV，4 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，每孔加500 μL培養(yǎng)基，收取細(xì)胞混合液。將上述細(xì)胞混合液放置-80 ℃，反復(fù)凍融3次，用于TCID試驗(yàn)。

1.6 JIB-04對病毒入侵宿主細(xì)胞的影響

為了檢測JIB-04對病毒入侵細(xì)胞的影響，根據(jù)之前的研究方法進(jìn)行試驗(yàn)：按照每孔約4×10個細(xì)胞接種12孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時，置于4 ℃預(yù)冷1 h，用PBS洗2遍，隨后接種病毒(MOI=10)，4 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，加入含JIB-04(10 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基，對照組為不含JIB-04的無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，用PBS洗2遍，隨后用檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0)處理1 min以去除吸附在細(xì)胞表面但未入侵的病毒粒子，每孔加500 μL培養(yǎng)基，收取細(xì)胞混合液。將上述細(xì)胞混合液放置-80 ℃，反復(fù)凍融3次，用于TCID試驗(yàn)。

1.7 JIB-04對病毒復(fù)制的影響

為了檢測JIB-04對病毒復(fù)制的影響，根據(jù)之前的研究方法進(jìn)行試驗(yàn)：按照每孔約4×10個細(xì)胞接種12孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時用PBS洗2遍，加入含JIB-04(10 μmol·L)的無血清培養(yǎng)基，對照組為不含JIB-04的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h，用PBS洗2遍，隨后接種病毒(MOI=0.1)，接毒后將細(xì)胞板置于37 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，每孔加入1 mL含胰酶的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4、10、22 h，收取細(xì)胞混合液。將上述細(xì)胞混合液放置-80 ℃，反復(fù)凍融3次，用于絕對熒光定量RT-PCR試驗(yàn)和TCID試驗(yàn)。

1.8 TCID50的測定

按照每孔約5×10個細(xì)胞接種96孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時進(jìn)行TCID試驗(yàn)。利用含胰酶的培養(yǎng)基依次將上述收取的病毒進(jìn)行倍比稀釋(10～10)，每個稀釋度設(shè)置8個重復(fù)孔，每孔加入100 μL稀釋的病毒液，同時設(shè)不含病毒的陰性對照(無血清培養(yǎng)基)。37 ℃孵育2 h，用PBS洗2遍，每孔加入200 μL含胰酶的培養(yǎng)基。接種第3天后用Reed-Muench法計(jì)算TCID。

1.9 熒光定量RT-PCR

使用Trizol法提取病毒RNA，然后根據(jù)諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用熒光定量試劑盒和特異性引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR，反應(yīng)體系：2.0 μL cDNA，10.0 μL qPCR SYBR Green Master Mix，7 μL HO，0.5 μL上、下游引物各0.5 μL。使用熒光定量RT-PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的絕對熒光定量RT-PCR方法計(jì)算細(xì)胞混合液中PDCoV RNA拷貝數(shù)。PDCoV S引物由尚亞生物公司合成，引物序列(5′→3′)：PDCoV S F：CGTTAACCTCTTCTCACCACTT，PDCoV S R：GCTGAGAGTCTGGTTGGTTATT。

1.10 Western blot

將含蛋白酶抑制劑的NP40裂解液加到細(xì)胞孔中，4 ℃裂解10 min，12 000離心5 min，取上清液用蛋白定量試劑盒定量，加入loading buffer，沸水煮8 min，-40 ℃保存。SAD-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂奶粉封閉后，用一抗(PDCoV多克隆一抗或GAPDH一抗)4 ℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記二抗(羊抗兔和羊抗豬IgG二抗)4 ℃孵育1 h，使用ECL顯色液進(jìn)行曝光。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 JIB-04的細(xì)胞毒性

JIB-04的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1a所示。不同濃度JIB-04處理LLC-PK細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力變化如圖1b所示，JIB-04在所有受試濃度下均沒有改變LLC-PK細(xì)胞的活力。經(jīng)Graphpad Prism 7軟件對不同濃度JIB-04處理后的細(xì)胞活力進(jìn)行曲線擬合并繪制藥物劑量反應(yīng)曲線圖，如圖1c所示，JIB-04在LLC-PK細(xì)胞上CC>640 μmol·L。Graphpad Prism 7軟件對在病毒感染條件下不同濃度JIB-04處理后的細(xì)胞活力進(jìn)行曲線擬合并繪制藥物劑量反應(yīng)曲線圖，如圖1d所示，JIB-04抗PDCoV感染的EC=0.216 μmol·L，計(jì)算得到JIB-04選擇性指數(shù)>2 963。

a. JIB-04的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；b、c. 不同濃度JIB-04作用LLC-PK細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力的變化；d.病毒感染后，不同濃度JIB-04作用細(xì)胞24 h細(xì)胞活力的變化a. Chemical structural formula of JIB-04; b, c. Changes of cell viability after LLC-PK cells were treated with different concentration of JIB-04 for 24 h; d. Changes of cell viability after infected cells were treated with different concentration of JIB-04 for 24 h圖1 JIB-04的結(jié)構(gòu)式、細(xì)胞毒性和抗病毒效果Fig.1 Chemical structural formul, cytotoxicity and antiviral effect of JIB-04

2.2 JIB-04對PDCoV感染有抑制作用

在安全濃度確定后，分別選擇5、10、20 μmol·LJIB-04進(jìn)行抗PDCoV感染研究，試驗(yàn)步驟模式圖如圖2a所示。與未處理的PDCoV感染組相比，5、10、20 μmol·LJIB-04預(yù)處理細(xì)胞組的病毒滴度無明顯變化(圖2b)。與未處理的病毒感染組相比，病毒感染后應(yīng)用5和10 μmol·LJIB-04作用細(xì)胞(圖2b)，病毒滴度極顯著下降(<0.001)，其中，未處理的病毒感染組的TCID為8.26 lg TCID·0.1 mL，5和10 μmol·LJIB-04處理組的TCID分別為6.47和6.29 lg TCID·0.1 mL，當(dāng)JIB-04濃度為20 μmol·L時，能夠極顯著抑制PDCoV復(fù)制(<0.000 1)，病毒滴度降低至4.78 lg TCID·0.1 mL。

a. 試驗(yàn)步驟模式圖；b. 不同濃度JIB-04預(yù)處理對PDCoV感染LLC-PK細(xì)胞的影響；c. 不同濃度JIB-04與PDCoV共處理LLC-PK細(xì)胞對病毒感染的影響。***.P<0.001，****.P<0.000 1a. Diagram of experiment procedure; b. Effects of JIB-04 pre-treatment on the infection of PDCoV in LLC-PK cell; c. Effects of JIB-04 co-treatment on the infection of PDCoV in LLC-PK cell. ***. P<0.001, ****. P<0.000 1圖2 JIB-04對PDCoV感染LLC-PK細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of JIB-04 on the infection of PDCoV in LLC-PK cell

2.3 JIB-04不影響PDCoV吸附和入侵細(xì)胞

鑒于JIB-04對PDCoV的復(fù)制有抑制作用，檢測了其對病毒吸附和入侵階段的影響，結(jié)果如圖3所示。TCID的試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組吸附和入侵LLC-PK細(xì)胞的PDCoV 滴度沒有明顯變化(圖3a)。

a. JIB-04對PDCoV吸附細(xì)胞的影響；b. JIB-04對PDCoV入侵細(xì)胞的影響a. Anti-attachment effect of JIB-04 on PDCoV; b. Anti-penetration effect of JIB-04 on PDCoV圖3 JIB-04對病毒吸附和入侵過程的影響Fig.3 Anti-attachment and anti-penetration effect of JIB-04

2.4 JIB-04抑制PDCoV的復(fù)制

由于JIB-04對病毒的吸附和入侵過程沒有影響，作者進(jìn)一步檢測了JIB-04對病毒復(fù)制的影響。qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4a)，PDCoV感染LLC-PK細(xì)胞6 h后，未處理的病毒感染組和JIB-04處理組病毒基因組拷貝數(shù)分別是5.53、5.43 lg GE PDCoV·mL，下降20.57%；感染12 h后，各組病毒基因組拷貝數(shù)分別為7.07、6.61 lg GE PDCoV·mL，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組病毒基因組拷貝數(shù)極顯著下降(<0.01)，下降65.33%；感染24 h后，各組病毒基因組拷貝數(shù)分別為8.06、7.12 lg GE PDCoV·mL，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組病毒基因組拷貝數(shù)極顯著下降(<0.01)，下降88.52%。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4b)，PDCoV感染LLC-PK細(xì)胞12和24 h后，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組PDCoV N表達(dá)量極顯著降低(<0.0001)，12 h時蛋白合成量下降85.13%，24 h時蛋白合成量下降89.07%。

a. JIB-04作用細(xì)胞對PDCoV感染后不同時間點(diǎn)病毒基因組拷貝數(shù)的影響；b. JIB-04處理對PDCoV感染后不同時間點(diǎn)PDCoV N蛋白表達(dá)的影響；c. JIB-04處理對PDCoV感染后不同時間點(diǎn)病毒滴度的影響。**.P<0.01，***.P<0.001，****.P<0.000 1a. Effects of JIB-04 on PDCoV genome copies after cells were infected with PDCoV at different hours post-infection. b. Effects of JIB-04 on PDCoV N expression after cells were infected with PDCoV at different hours post-infection. c. Effects of JIB-04 on virus titer after cells were infected with PDCoV at different hours post-infection. **. P<0.01, ***. P<0.001, ****. P<0.000 1圖4 JIB-04對病毒復(fù)制的影響Fig.4 Effect of JIB-04 on virus replication

TCID試驗(yàn)檢測了JIB-04作用下具有感染能力的病毒數(shù)的變化，結(jié)果如圖5c所示。PDCoV感染LLC-PK細(xì)胞6 h后，未處理的病毒感染組和JIB-04處理組的TCID分別為4.59、2.95 lg TCID·0.1 mL，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組病毒滴度極顯著下降(<0.01)，下降97.71%；感染12 h后，未處理的病毒感染組和JIB-04處理組的TCID分別為7.06、5.76 lg TCID·0.1 mL，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組病毒滴度極顯著下降(< 0.001)，下降94.99%；感染24 h后，未處理的病毒感染組和JIB-04處理組的TCID分別為8.26、6.29 lg TCID·0.1 mL，與未處理的病毒感染組相比，JIB-04處理組病毒滴度極顯著下降(<0.001)，下降98.93%。

3 討 論

仔豬腹瀉是威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染性疾病，PDCoV是引起仔豬腹瀉的重要病原體，迄今為止，PDCoV已在多個國家暴發(fā)。PDCoV感染仔豬后，在豬群中快速傳播，病死率高，嚴(yán)重困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對PDCoV仍然沒有有效的疫苗或藥物可用，因此急需研究可以抵抗PDCoV感染的藥物，為動物疫病防治提供有效的手段，為抗擊冠狀病毒感染提供新的理論依據(jù)。

本試驗(yàn)首先對JIB-04進(jìn)行了細(xì)胞毒性的檢測，并計(jì)算了CC，結(jié)果表明，JIB-04的CC在LLC-PK細(xì)胞上>640 μmol·L，由于本試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)JIB-04的濃度在1 280 μmol·L時不溶于培養(yǎng)基，因此未測定更高濃度藥物作用下的細(xì)胞活力。據(jù)報(bào)道，Griffithsin是一種血凝素，可以抵抗PDCoV的感染，其在IPI-2I細(xì)胞上的選擇性指數(shù)較高，為635.11，在ST細(xì)胞上的選擇性指數(shù)為141.62，是一種潛在的可以預(yù)防和治療PDCoV感染的候選藥物。GC376是冠狀病毒3C樣蛋白酶(3CLpro)抑制劑，體外可以抑制PEDV的復(fù)制，該抑制劑的選擇性指數(shù)>17.89。本研究結(jié)果表明，JIB-04對細(xì)胞的毒性較低，藥物的選擇性指數(shù)>2 963，具有進(jìn)一步開發(fā)成為藥物的潛力。

由于JIB-04可以有效緩解PDCoV感染對宿主細(xì)胞造成的細(xì)胞活力的下降，作者進(jìn)一步用TCID方法檢測了JIB-04是否可以抑制病毒復(fù)制，結(jié)果表明，在PDCoV感染時，使用5 μmol·LJIB-04即可顯著地抑制病毒復(fù)制，而單獨(dú)在感染前應(yīng)用JIB-04處理細(xì)胞并不能明顯抑制病毒復(fù)制，說明在細(xì)胞試驗(yàn)中，JIB-04對PDCoV的感染沒有預(yù)防作用，而是在病毒感染過程中發(fā)揮作用的。病毒感染入侵細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制需要經(jīng)過幾個基本過程，即吸附、入侵、合成、組裝、釋放，釋放出胞的病毒對周圍的細(xì)胞進(jìn)行下一輪感染。因此，作者分析了JIB-04是否可以抑制病毒吸附或入侵從而發(fā)揮抗病毒功能，結(jié)果顯示，JIB-04并沒有改變吸附到細(xì)胞上或者入侵進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)病毒的滴度，表明JIB-04不影響病毒吸附或入侵細(xì)胞的過程，提示JIB-04可能是通過抑制病毒復(fù)制來發(fā)揮抗病毒作用的。

進(jìn)一步的研究表明，在病毒感染細(xì)胞12和24 h后，JIB-04顯著降低了病毒基因組拷貝數(shù)和病毒蛋白的合成，證明其的確抑制了病毒的復(fù)制，對病毒的合成過程有抑制作用。病毒感染6 h后，JIB-04降低了44倍具有感染能力的病毒粒子數(shù)量，但卻只降低了1.25倍病毒基因組拷貝數(shù)，表明在病毒生命周期中JIB-04很可能不僅在合成階段起作用，在病毒組裝階段同樣有抑制作用。本研究僅在細(xì)胞層面上證實(shí)了JIB-04的抗病毒效果，沒有深入研究宿主組蛋白去甲基化在病毒感染過程中的機(jī)制。但是作者猜測，可能是病毒在感染過程中為了實(shí)現(xiàn)自身復(fù)制而改變了宿主組蛋白的甲基化修飾水平，改變某些宿主蛋白的翻譯和轉(zhuǎn)錄，從而為病毒自身合成和組裝提供有利的環(huán)境，這將是人們進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，JIB-04細(xì)胞毒性低，而在較低濃度時即可抑制PDCoV的復(fù)制，具有較高的藥物選擇性指數(shù)，本研究為JIB-04在抗冠狀病毒領(lǐng)域的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

JIB-04的細(xì)胞毒性較低，藥物選擇性指數(shù)較高，在體外能抵抗PDCoV感染，可以作為潛在的抗病毒藥物。在PDCoV感染過程中，JIB-04通過抑制病毒核酸和蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮抗病毒作用。