黃芪多糖降低脂多糖對雞巨噬細胞促炎細胞因子和TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響的效應(yīng)分析

劉 倩，李大鵬，張 宏，劉 琴，王學智， 李建喜，楊孝樸*，張景艷*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050； 3.河北農(nóng)業(yè)大學中獸醫(yī)學院，保定 071001； 4.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所， 蘭州 730000)

黃芪性甘，微溫，入脾、肺、肝、腎經(jīng)，有“補氣之長”之稱。作為補氣要藥，其調(diào)節(jié)免疫的作用已被廣為認知。黃芪主要包含生物堿、皂苷類、葡萄糖醛酸、黃酮類、多糖等生物活性物質(zhì)，其中，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)作為一類生物大分子成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)，抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化等多種生物學作用。在臨床應(yīng)用中，APS常作為免疫增強劑與疫苗聯(lián)合，用于提高幼畜天然免疫的調(diào)節(jié)能力和疫苗保護效果。巨噬細胞作為機體重要的天然免疫效應(yīng)細胞，是機體造血系統(tǒng)中可塑性最強的一類細胞，具有極強的功能多樣性，在機體正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和抗感染中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞主要分為M1和M2型，其中，M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能，對于早期抵御畜禽感染性疾病至關(guān)重要，它能被集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α和 IFN-γ單獨或與細菌的LPS 一起極化，表達促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23 和 TNF-α等；M2型巨噬細胞在組織修復(fù)和恢復(fù)過程中大量存在，會被Th2 細胞因子(如 IL-4、IL-10和IL-13)極化，并產(chǎn)生抗炎細胞因子[如IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)]等。中藥有效成分對巨噬細胞極化及功能的影響是近年來的研究熱點。已有研究表明，APS可抑制炎癥損傷小鼠或人巨噬細胞中炎癥因子的過度釋放，保護和調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能，發(fā)揮抗炎、抗感染的生物學作用。禽類天然免疫系統(tǒng)與哺乳類動物有一定差異，但鮮見APS對雞巨噬細胞調(diào)節(jié)作用及其分子機制的研究報道。因此，本試驗建立LPS誘導(dǎo)損傷雞巨噬細胞(HD11)細胞模型，開展APS對LPS炎癥損傷HD11細胞形態(tài)、LDH活性、NO釋放、炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、IFN-α、IL-10)mRNA水平表達的調(diào)控作用和s mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期為中藥多糖對禽類天然免疫的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機制研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

HD11細胞由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院王晶鈺老師饋贈，BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，內(nèi)毒素測定試劑盒、苯酚購自北京索萊寶科技有限公司，1%青鏈霉素、胰酶、DMEM培養(yǎng)基、雞血清購自美國Gicbo公司，LDH試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Griess試劑購自美國Thermo Fisher公司，LPS(大腸桿菌O55∶B5)購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購自上海澤塔生物科技有限公司。

超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force，HE90)，超聲波細胞粉碎機(JY99-IIDN)。立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZM-60KCS-II，上海申安醫(yī)療器械廠)，多功能酶標儀(Enspire，鉑金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司)，CO細胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Fisher Scientific，HERA cell 150i)，實時熒光定量 PCR儀(美國 Thermo Fisher Scientific，ABI Q5)。

1.2 黃芪多糖的提取與表征

參考秦哲關(guān)于APS的提取方法，稱取一定量的黃芪粉于燒杯中，加入蒸餾水80 ℃溫浸提取3次，合并上清液，過濾并濃縮，加入Sevag試劑處理至無蛋白質(zhì)層出現(xiàn)，流水透析(截留分子量為7 ku)處理48 h，加入無水乙醇靜置過夜，取沉淀物依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，待溶劑揮干后蒸餾水沖洗，最后冷凍干燥，并稱重。所得提取物即為試驗用APS樣品。采用苯酚硫酸法，測定APS樣品中還原糖的含量。采用3,5-二硝基水楊酸比色法，測定APS樣品中還原糖的含量。采用BCA蛋白試劑盒說明書進行樣本配制，測定APS樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3 HD11細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

取凍存HD11細胞在37 ℃水浴融解，1 000 r·min離心5 min, 棄上清，加入完全培養(yǎng)液(89% DME高糖培養(yǎng)液+10%雞血清+1%青鏈霉素)重懸并移入細胞瓶，37 ℃、5 % CO培養(yǎng)至細胞密度為90%以上時，消化后傳代培養(yǎng)。

1.4 LPS誘導(dǎo)HD11細胞炎癥模型的建立

將消化的HD11細胞離心，調(diào)整細胞濃度為5×10·mL，按100 μL·孔完全培養(yǎng)液(89% DMEM高糖培養(yǎng)液+10%雞血清+1%青鏈霉素)接種于96孔板，37 ℃、5% CO條件培養(yǎng) 6 h，棄上清。分別加入100 μL LPS溶液(用含97%DMEM高糖培養(yǎng)液+2%雞血清+1%青鏈霉素培養(yǎng)液稀釋至0、2.44、4.88、9.76、19.53、39.06、78.12 μg·mL)，另外，以含89% DMEM高糖培養(yǎng)液+10%雞血清+1%青鏈霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)HD11細胞為對照組1，以含97% DMEM高糖培養(yǎng)液+2%雞血清+1%青鏈霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)HD11細胞為對照組2，在37 ℃、5%CO條件下，孵育32 h，每個濃度設(shè)置8個重復(fù)，觀察細胞形態(tài)，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性，確定誘導(dǎo)HD11細胞炎癥模型的LPS工作濃度。

1.5 APS工作濃度范圍的篩選

將消化后的HD11細胞離心，調(diào)整細胞濃度為5×10·mL，按100 μL·孔89%DMEM高糖培養(yǎng)液+10%雞血清+1%青鏈霉素培養(yǎng)液接種于96孔板，37 ℃、5% CO條件培養(yǎng) 6 h，棄上清。分別加入100 μL APS溶液(用含97%DMEM高糖培養(yǎng)液+2%雞血清+1%青鏈霉素培養(yǎng)液稀釋至0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μg·mL)，在細胞中按100 μL·孔添加APS溶液，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中孵育24 h，每個濃度設(shè)置8個重復(fù)，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性，確定APS工作濃度范圍。

1.6 APS干預(yù)LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞的處理方法

將消化后的HD11細胞離心，調(diào)整細胞濃度為5×10·mL，按1 mL·孔(89%DMEM高糖培養(yǎng)液+10%雞血清+1%青鏈霉素)培養(yǎng)液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO條件培養(yǎng) 6 h，棄上清。試驗分為空白對照組、APS組、LPS組、APS+LPS組。APS組細胞中加入100 μg·mLAPS 溶液孵育12 h，棄上清，用預(yù)熱PBS清洗兩遍，再加入(97% DMEM高糖培養(yǎng)液+2%雞血清+1%青鏈霉素)培養(yǎng)液培養(yǎng)32 h。LPS組細胞中加入(97% DMEM高糖培養(yǎng)液+2%雞血清+1%青鏈霉素)培養(yǎng)液孵育12 h，棄上清，用預(yù)熱PBS清洗兩遍，再加入9.76 μg·mLLPS溶液，孵育32 h。APS+LPS 組細胞中加入100 μg·mLAPS溶液，孵育12 h，棄上清，用預(yù)熱PBS清洗兩遍，再加入9.76 μg·mLLPS溶液，孵育32 h。收集上清液或細胞進行后續(xù)試驗。

1.7 APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞NO釋放的影響

按“1.6”方法收集各處理組的細胞上清液，采用Griess法用 NO 檢測試劑盒測定各組細胞中 NO 含量，繪制標準曲線，并計算各組細胞中NO 濃度。

1.8 APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞乳酸脫氫酶(LDH)含量的影響

按“1.6”方法處理后，棄上清，加入細胞提取液，超聲波破碎細胞后,8 000 g 4 ℃離心10 min，取上清，應(yīng)用LDH檢測試劑盒進行樣本處理，450 nm下測定吸光度，制備標準曲線，計算細胞中LDH含量。

1.9 APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞炎癥因子mRNA水平的表達

收集“1.6”方法中各組細胞，采用Trizol-Reagent法提取細胞總RNA并測定其濃度以及OD/OD比值，檢測合格后，保存?zhèn)溆?。如?合成引物，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄方法加樣，并進行擴增。采用RQ-PCR檢測后，通過2-ΔΔ方法計算干擾素α(IFN-α)、一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)基因的相對表達量，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因。引物的合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

表1 炎癥因子及內(nèi)參基因的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences of inflammatory factors and internal reference genes

1.10 APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞TLRs基因mRNA水平的影響

收集“1.6”方法中各組細胞，采用Trizol-Reagent法提取細胞總RNA并測定其濃度以及OD/OD比值，檢測合格后，保存?zhèn)溆?。如?合成引物，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄方法加樣，并進行擴增。采用RQ-PCR檢測后，通過2-ΔΔ方法計算Toll樣受體1(TLR1)、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)、Toll樣受體15(TLR15) 基因的相對表達量，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因。引物的合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

表2 TLRs及內(nèi)參基因的PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences of TLRs and internal reference genes

1.11 統(tǒng)計學分析

用 Graph PadPrism 9.0.0 軟件繪制柱狀圖，并進行數(shù)據(jù)分析，柱狀圖中的“*”或“**”表示與空白組相比，差異顯著或極顯著(<0.05 或<0.01)，“#”或“##”表示與 LPS 組相比，差異顯著或極顯著(<0.05 或<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 APS的提取與表征

測得試驗用 APS總多糖含量為95.31%±3.55%；APS還原性多糖含量1.96%±0.03%；APS蛋白質(zhì)含量為6.50%±0.80%。

2.2 不同LPS濃度對HD11細胞的影響

如圖1所示，與對照組(CON1)相比，2%雞血清+1%雙抗的完全培養(yǎng)液對HD11細胞(CON2)的增值活力無顯著變化(>0.05)。隨著LPS濃度的增加(>2.44 μg·mL)，在2%雞血清+1%雙抗的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)的HD11細胞的增值活力持續(xù)下降。與CON2組相比，9.76～78.13 μg·mLLPS在37 ℃、5% CO下作用32 h可極顯著降低HD11細胞的增值活力(<0.01)。因此，在后續(xù)試驗中選擇9.76 μg·mLLPS刺激HD11細胞32 h作為HD11細胞過度損傷的炎癥模型。

與空白組相比，*.P<0.05, **.P<0.01Compared with blank group, *.P<0.05, **.P<0.01圖1 LPS對HD11細胞活力的影響Fig.1 Effect LPS on cell viability of HD11

2.3 APS工作濃度范圍的篩選

如圖2所示，為了評價不同濃度APS對HD11細胞增殖活力的影響并確定APS工作濃度，本研究用不同濃度APS(6.25～800 μg·mL)在37 ℃、5% CO作用HD11細胞24 h。與對照組相比，當APS濃度>50 μg·mL時，細胞增殖活性持續(xù)上升，其中在APS濃度>200 μg·mL時細胞增殖活性極顯著上升(<0.01)。本試驗中選擇100 μg·mL為APS后續(xù)試驗的工作濃度。

與空白組相比，*.P<0.05, **.P<0.01Compared with blank group, *.P<0.05, **.P<0.01圖2 APS對HD11細胞活力的影響Fig.2 Effect APS on cell viability of HD11

2.4 APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞NO含量的影響

如圖3所示，與對照組細胞相比，LPS處理組細胞中NO釋放量極顯著高于對照組(<0.01)；100 μg·mLAPS處理組細胞NO釋放量極顯著高于對照組(<0.01)，但極顯著低于LPS處理組(<0.01)；APS+ LPS處理組細胞NO釋放量極顯著小于LPS處理組(<0.01)，極顯著高于對照組(<0.01)。

與空白組相比，*.P<0.05, **.P<0.01;與LPS組相比，#.P<0.05或##.P<0.01Compared with blank group *.P<0.05, **.P<0.01. Compared with LPS group, #.P<0.05, ##.P<0.01圖3 APS對LPS刺激HD11細胞NO的含量Fig.3 Effect of APS on NO content of HD11 stimulated by LPS

2.5 APS對LPS刺激HD11細胞LDH含量的影響

如圖4所示，與對照組細胞相比，LPS處理組細胞LDH釋放量顯著高于對照組(<0.05)；APS處理組HD11細胞LDH釋放量顯著高于對照組(<0.05)，但顯著低于LPS處理組(<0.05)；APS+LPS處理組細胞NO釋放量顯著小于LPS處理組(<0.05)，顯著高于對照組(<0.05)。結(jié)果表明，100 μg·mLAPS可促進HD11細胞LDH的釋放；其預(yù)先處理HD11細胞12 h，可抑制9.76 μg·mLLPS引起LDH釋放升高。

與空白組相比，*.P<0.05，**.P<0.01，與 LPS 組相比，#.P<0.05或##.P<0.01Compared with blank group, *.P<0.05, **.P<0.01. Compared with LPS group, #.P<0.05, ##.P<0.01圖4 APS對LPS刺激巨噬細胞LDH含量的影響Fig.4 Effect of APS on LDH content of HD11 stimulated by LPS

2.6 APS對LPS刺激HD11細胞促炎癥因子mRNA水平的表達

如圖5所示，與對照組相比，LPS處理組細胞中，-α、-1β、-6、、-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(<0.01)，-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(<0.05)；APS處理組細胞中,-α、-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于對照組(<0.01)，-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(<0.01)，-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比無顯著性差異(>0.05);APS+LPS處理組細胞-1β、-6、mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著小于LPS處理組(<0.05)，APS+LPS處理組細胞-α、-α、-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于LPS處理組(<0.01)；TNF-α mRNA顯著高于對照組,IFN-α和IL-10 mRNA顯著低于對照組(<0.05)。

與空白組相比，*.P<0.05, **.P<0.01。與LPS組相比，#.P<0.05,##.P<0.01Compared with blank group, *.P<0.05, **.P<0.01. Compared with LPS group, #.P<0.05, ##.P<0.01圖5 APS對LPS刺激HD11細胞炎癥因子基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effect of APS on mRNA transcription levels of inflammatory factor gene in LPS-stimulated HD11 cells

2.7 APS對LPS刺激HD11細胞TLRs信號通路相關(guān)基因表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，LPS處理組2、4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(<0.05)；APS處理組細胞中，2、4、15 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組(<0.05)，極顯著低于LPS處理組(<001);APS+LPS處理組細胞2、4和TLR15 mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于LPS處理組(<0.01)，顯著低于對照組(<0.05)。

與空白組相比，*.P<0.05，**.P<0.01。與LPS組相比，#.P<0.05,##.P<0.01Compared with blank group, *.P<0.05, **.P<0.01. Compared with LPS group, #.P<0.05, ##.P<0.01圖6 APS對LPS刺激HD11細胞TLRs信號通路mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Effects of APS on mRNA transcription levels of TLRs signaling pathway of HD11 stimulated by LPS

3 討 論

巨噬細胞作為機體重要的天然免疫效應(yīng)細胞，具有極強的功能多樣性，在機體正常發(fā)育、組織修復(fù)和抗感染中發(fā)揮重要作用。研究表明，APS可促進鼠源正常巨噬細胞中促炎因子的表達，激活M1型巨噬細胞分化，具有與低濃度(不引起毒性反應(yīng))LPS相似的生物學作用。如Wei等研究發(fā)現(xiàn)，分子量為1 334 ku，總糖含量為76.5%，濃度為30 ～ 300 μg·mL的APS可刺激RAW 264.7細胞中TNF-α、IL-6和NO(iNOS)蛋白與基因轉(zhuǎn)錄水平的表達升高。本試驗用100 μg·mLAPS預(yù)先處理HD11細胞12 h，可顯著降低-α、-10 mRNA的表達。結(jié)果表明，APS可促進雞巨噬細胞向M1型分化，增強巨噬細胞的免疫監(jiān)視功能。

炎癥反應(yīng)大多與免疫機制相關(guān)，其中巨噬細胞是啟動炎癥的關(guān)鍵細胞，它通過激活機體的免疫系統(tǒng)，釋放細胞因子等一系列炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)。文獻報道，APS可抑制炎癥損傷下小鼠巨噬細胞中促炎因子的過度釋放，保護和調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能，發(fā)揮抗炎、抗腫瘤的生物學作用。由于雞缺少LPS特異性的TRAM-TRIF(與TRIF相關(guān)的適配分子/包含誘導(dǎo)IFN-β適配體的TIR結(jié)構(gòu)域的)信號通路，因此雞對LPS刺激引起的免疫反應(yīng)相比哺乳類動物耐受。本試驗通過摸索LPS誘導(dǎo)HD11細胞炎癥損傷模型，確定9.76 μg·mLLPS處理培養(yǎng)于2%雞血清+1%雙抗的完全培養(yǎng)液中HD11細胞32 h后，細胞出現(xiàn)明顯的炎癥損傷，并引起-α、-1β、-6、、-α、-10 mRNA表達均顯著升高。該劑量比小鼠巨噬細胞炎癥損傷模型所用LPS的劑量要高。結(jié)果提示，HD11細胞對LPS存在一定程度的耐受。試驗中用100 μg·mLAPS預(yù)先處理HD11細胞12 h，可顯著抑制LPS刺激引起的細胞NO、LDH釋放及炎癥因子mRNA表達的升高。結(jié)果表明，APS可保護LPS誘導(dǎo)損傷的雞巨噬細胞，發(fā)揮抗炎的生物學作用。

Toll樣受體是一類天然免疫模式識別受體，在病原微生物免疫和誘導(dǎo)快速防御反應(yīng)激活中具有重要作用。TLRs在不同宿主中存在多態(tài)性，且由于宿主生存環(huán)境存在的差異，導(dǎo)致TLRs信號途徑介導(dǎo)的宿主免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)分子機制具有差異性。此外，雞缺少在大多數(shù)哺乳動物中存在的TLRs(TLR8、TLR9)，且chT LR15和chT LR21是禽類特有的。研究顯示，用多態(tài)性膜蛋白D(PmpD-N)刺激 HD11 細胞可上調(diào) TLR2、TLR4、MyD 88 和 NF-κB的表達，并受到TLR2/MyD 88/NF-κB 通路的調(diào)控，表明TLR2 受體在雞免疫反應(yīng)中的重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激HD11細胞建立炎癥模型，對刺激組和對照組樣本進行GO 富集分析和 KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)TLR2 信號通路受到主要富集，這可能暗示著 TLR2 在雞抗炎癥免疫反應(yīng)中的重要作用。本試驗通過研究APS對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞1、2、4、15基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)巨噬細胞2、4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，但對1、15 mRNA表達影響不顯著；發(fā)現(xiàn)APS干預(yù)的HD11細胞能顯著降低LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞2、4、15 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)炎癥因子的過度釋放，使HD11細胞發(fā)揮組織炎癥損傷的修復(fù)功能。上述結(jié)果表明，APS對雞巨噬細胞TLR2、TLR4、TLR15均有調(diào)節(jié)作用，但其中TLR2、TLR4可能是其發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞保護作用的關(guān)鍵受體。相關(guān)分子機制有待于進一步的研究證實。

4 結(jié) 論

黃芪多糖對雞巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用存在雙向性，能通過識別TLR2、TLR4、TLR15促進雞巨噬細胞增殖與極化，發(fā)揮免疫增強的調(diào)節(jié)作用；還可通過抑制2、4 mRNA水平表達，發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)損傷HD11細胞免疫損傷的調(diào)節(jié)作用。