丁酸鈉通過AMPK通路調(diào)控LPS造成牛乳腺上皮細胞脂代謝紊亂的作用機制

李 林，曹 萌，宮彬彬，趙 梅，王 婕，張曉輝

(1.邢臺學院生物科學與工程學院，邢臺 054001； 2.河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院病理科，邢臺 054000； 3.海南大學動物科技學院，海口 570100)

在反芻動物中，乳脂肪是由三酰甘油(triacylglycerols，TG，>95%)、磷脂、膽固醇以及少量的游離脂肪酸構(gòu)成。乳脂肪不僅可以為幼崽提供生長發(fā)育所需的大部分能量、必需脂肪酸和生物活性物質(zhì)，也可以滿足人體營養(yǎng)和能量的需求。反芻動物在泌乳期間用于合成TG的脂肪酸,一部分通過乳腺自身從頭合成，另一部分直接從血液中獲取。

革蘭陰性菌細胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)也被稱為細菌內(nèi)毒素，在臨床疾病如瘤胃酸中毒、乳腺和子宮感染以及熱應(yīng)激時，細菌均會釋放大量LPS。LPS的大量釋放會引起奶牛全身性和局部炎癥反應(yīng)，最終導致乳脂率嚴重下降，影響乳品質(zhì)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。LPS可以降低血液中乳脂合成前體物的含量，并且還會誘導肝的急性期反應(yīng)，導致肝脂代謝紊亂，從而無法提供足夠數(shù)量的極低密度脂蛋白用于組裝合成乳脂前體物的載脂蛋白。

丁酸鈉的有效成分為丁酸，由腸道菌群通過發(fā)酵不可吸收的碳水化合物和蛋白質(zhì)(如纖維)產(chǎn)生。丁酸鈉作為一種飼料添加劑，可用于改善動物生長性能、減少乳腺炎的發(fā)生，并且可以提高乳中乳脂肪的含量。目前，有關(guān)丁酸鈉的研究大多集中在哺乳動物其腸道形態(tài)、乳品質(zhì)改善和抗氧化能力等方面；在體外的研究主要多集中在炎癥反應(yīng)、細胞增殖等方面，而關(guān)于細胞代謝機制方面的研究較少。因此，本試驗探討體外添加丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞脂代謝紊亂的保護作用與調(diào)節(jié)機制，旨在為養(yǎng)殖實踐中改善反芻動物乳腺健康及調(diào)控乳脂肪合成等實際應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

牛乳腺上皮細胞系(MAC-T)：南京農(nóng)業(yè)大學張源淑教授饋贈，本實驗室凍存。

1.2 主要試劑

丁酸鈉購于美國Sigma公司，TG試劑盒、油紅O染色試劑盒、牛TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購于南京澤優(yōu)生物科技有限公司，P-AMPK-兔/AMPK-兔抗體均購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司，山羊抗兔IgG購于上海生工生物工程有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 MAC-T細胞脂代謝紊亂模型建立

根據(jù)前期預(yù)試驗，分別用不同濃度的LPS(0、1、10、100、1 000、10 000 ng·mL)刺激MAC-T細胞1、3、6、9、12 h后，通過檢測細胞相對活力，結(jié)果顯示,LPS濃度為1 000 ng·mL刺激9 h后，其細胞活力顯著下降。因此，本試驗篩選出最佳LPS刺激濃度為1 000 ng·mL，最佳刺激時間為9 h，該結(jié)果用于后續(xù)試驗處理。

將細胞按照合適密度接種于6孔板中，待細胞融合至80%時，棄去培養(yǎng)液，對細胞進行饑餓處理12 h后，加入1 000 ng·mLLPS的不完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)9 h，收集上清和細胞。收集的細胞在冰浴環(huán)境下破碎，4 ℃離心，取細胞上清為待測樣品。每個處理設(shè)3個平行孔，收集細胞上清通過試劑盒GPO-PAP法進行TG含量指標檢測。

將細胞按照合適密度接種于6孔板中，待細胞融合至80%時，棄去培養(yǎng)液，對細胞進行饑餓處理，加入1 000 ng·mLLPS的不完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)9 h，室溫條件下,PBS沖洗3遍，10%福爾馬林將細胞固定30 min；PBS沖洗3遍，室溫條件下，用油紅O染液染色10 min，PBS緩沖液洗2次；倒置顯微鏡觀察細胞內(nèi)脂滴染色情況，并通過Image Pro plus 6.0軟件對脂滴面積進行統(tǒng)計分析。

1.4 丁酸鈉對MAC-T細胞的影響

將MAC-T細胞培養(yǎng)于6孔板中，當細胞融合度達到80%～90%時，用2、8、16 μmol·L的丁酸鈉處理細胞12 h。收集細胞，加入200 μL的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)原液重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，采用美國BD FACS Calibur型流式細胞術(shù)檢測熒光強度，計算細胞凋亡率。

1.5 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞的影響

將細胞按照合適密度接種于6孔板中，待細胞融合至80%時，棄去培養(yǎng)液，對細胞進行饑餓處理后，將細胞分為1) 空白對照組:加入同體積的無血清培養(yǎng)基；2) LPS處理組：終濃度為1 000 ng·mLLPS；3) 2 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組：終濃度為2 μmol·L丁酸鈉以及終濃度為1 000 ng·mLLPS共同處理；4) 8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組：終濃度為8 μmol·L丁酸鈉以及終濃度為1 000 ng·mLLPS共同處理；5) 16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組：終濃度為16 μmol·L丁酸鈉以及終濃度為1 000 ng·mLLPS共同處理。在2 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組、8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組中，均為2 h后加入LPS。

每組處理設(shè)置3個平行孔，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中處理9 h后，收集各孔細胞和細胞上清，用于后續(xù)ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8的含量及TG含量指標檢測，操作步驟按照說明書進行。提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定并計算出蛋白濃度。

1.6 Western blot分析MAC-T細胞AMPK通路蛋白

Western blot檢測各處理細胞中P-AMPK/AMPK蛋白的表達變化，參照李林等的方法進行操作。用ECL發(fā)光液進行Western blot圖像處理。用Image Lab 6.0分析條帶灰度值。

1.7 MAC-T細胞脂代謝相關(guān)關(guān)鍵酶的表達

將收集的細胞采用TRIzol法直接提取總RNA，利用BioPhotometer測定樣品總RNA濃度，分析OD/OD值，判斷提取總RNA的純度，OD/OD必需為1.8～2.0，并且OD/>2.0。取1 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,詳細操作步驟參照說明書進行。

參照GenBank上牛的乙酰CoA羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)、牛的硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(Stearyl coenzyme A desaturated enzyme-1，SCD-1)、山羊的脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、山羊的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(Carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)、牛的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶II(Carnitine palmitoyltransferase-2，CPT-2)、牛的脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACO)及-內(nèi)參基因引物序列，用Primer Premier 5軟件自行設(shè)計引物，并送上海Sangon公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因及β-Actin引物序列Table 1 Prime sequence of targeted gene and β-Actin

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 LPS對MAC-T細胞脂滴及TG含量的影響

1 000 ng·mLLPS刺激細胞9 h后，圖1A顯示，與對照組相比，LPS處理組細胞總脂滴面積顯著下降(<0.05)；圖1B顯示，與對照組相比，細胞TG含量極顯著下降(<0.01)。

與對照組比較，*. P<0.05; **. P<0.01Compared with control group，*.P<0.05；**.P<0.01圖1 MAC-T細胞脂滴及TG含量變化Fig.1 The lipid droplets and TG content changes in the MAC-T cells

2.2 丁酸鈉對MAC-T細胞總凋亡率的影響

分別用低(2 μmol·L)、中(8 μmol·L)、高(16 μmol·L)濃度的丁酸鈉作用MAC-T細胞12 h后，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)不同濃度的丁酸鈉對細胞凋亡率均無影響(圖2)，證明丁酸鈉對細胞無毒害作用，可以進行下一步試驗。

圖2 MAC-T細胞總凋亡率變化Fig.2 The total rate of apoptosis changes in the MAC-T cells

2.3 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞TG含量的影響

通過圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組TG含量極顯著下降(<0.01)；而8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著上升(<0.05)。

**. P<0.01；*.P<0.05圖3 丁酸鈉對MAC-T細胞TG含量的影響Fig.3 Effect of sodium butyrate on TG content in MAC-T cells

2.4 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞AMPK信號通路的影響

進一步檢測細胞AMPK相關(guān)信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4)，與對照組相比，LPS處理組P-AMPK表達水平顯著上升(<0.05)；而2 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組、8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組分別相比，其P-AMPK表達水平均顯著下降(<0.05)。

*.P<0.05圖4 MAC-T細胞P-AMPK蛋白表達水平變化Fig.4 The P-AMPK protein expression level in the MAC-T cells

2.5 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞脂合成代謝的影響

通過檢測與AMPK信號通路下游相關(guān)的關(guān)鍵脂合成代謝的基因，圖5A發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組ACC mRNA表達含量顯著下降(<0.05)；而8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著上升(<0.05)。圖5B發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組SCD-1 mRNA表達含量極顯著下降(<0.01)；而8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著上升(<0.05)。圖5C發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組FAS mRNA表達含量顯著下降(<0.05)；而8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著上升(<0.05)。

**. P<0.01；*.P<0.05圖5 MAC-T細胞脂合成代謝相關(guān)基因表達水平變化Fig.5 The expression levels of genes related to lipid metabolism in the MAC-T cells

2.6 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞脂分解代謝的影響

進一步檢測與AMPK信號通路下游相關(guān)的關(guān)鍵脂分解代謝的基因，圖6A發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組CPT-1 mRNA表達含量顯著上升(<0.05)；而8 μmol/L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著下降(<0.05)。圖6B發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組CPT-2 mRNA表達含量顯著上升(<0.05)；而其它處理組與LPS處理組相比，其TG含量無明顯變化。圖6C發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組ACO mRNA表達含量顯著上升(<0.05)；而16 μmol/L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，其TG含量顯著下降(<0.05)。

**. P<0.01；*.P<0.05圖6 MAC-T細胞脂分解代謝相關(guān)基因表達水平變化Fig.6 The expression levels of genes related to lipid catabolism in the MAC-T cells

2.7 丁酸鈉對LPS誘導的MAC-T細胞炎癥因子指標的影響

如表1所示，與對照組相比，LPS處理組TNF-α和IL-6含量顯著上升(<0.05)；而經(jīng)過丁酸鈉處理后，發(fā)現(xiàn)8 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組和16 μmol·L丁酸鈉+LPS處理組與LPS處理組相比，TNF-α和IL-6含量顯著下降(<0.05)。

表1 MAC-T細胞炎癥因子指標測定Table 1 Determination of inflammatory factors in MAC-T cells μg·L-1

3 討 論

牛奶和乳制品，在人類日常飲食中起著重要的作用。乳脂肪是哺乳動物能量、脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性脂質(zhì)的重要來源。它不僅是一種具有生物活性的脂類成分的來源，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)輸送介質(zhì)，包括脂溶性維生素。牛奶中的生物活性脂類包括TG、飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸以及磷脂。內(nèi)源性的LPS會造成脂代謝紊亂，乳脂肪前體物合成的減少，進而導致乳脂肪含量降低，以及乳腺炎的發(fā)生。乳腺炎是奶牛最常見的疾病之一，其中，革蘭陰性菌是牛乳腺炎的主要病因，乳腺炎會嚴重影響奶業(yè)的健康發(fā)展。目前，常規(guī)手段是通過抗生素來治療該疾病。然而，過度使用抗生素會引起人們對負面影響以及人類健康的擔憂。丁酸鈉作為一種安全的抗生素替代品，在養(yǎng)殖業(yè)備受關(guān)注。丁酸鈉作為一種有效的飼料添加劑，可改善高溫氣候條件下肉雞的生產(chǎn)性能、肝功能和抗氧化應(yīng)激能力。Ohira等研究發(fā)現(xiàn)，丁酸能減輕脂肪細胞和巨噬細胞相互作用產(chǎn)生的炎癥(TNF-α、MCP-1、IL-6)和脂肪的分解作用。本研究發(fā)現(xiàn)，用1 000 ng·mLLPS刺激細胞9 h后，細胞總脂滴面積顯著下降；細胞內(nèi)TG含量極顯著下降。進一步向正常的MAC-T細胞中添加丁酸鈉，發(fā)現(xiàn)2、8、16 μmol·L丁酸鈉處理下，細胞的生長狀態(tài)良好，凋亡率與對照組無顯著差異。本試驗結(jié)果表明，LPS確實會造成MAC-T細胞的脂代謝紊亂。并且丁酸鈉對MAC-T細胞無毒副作用，因而可用于后續(xù)試驗的研究，并為丁酸鈉作為一種綠色安全的飼料添加劑提供了理論基礎(chǔ)。

用于合成乳脂肪的脂肪酸通常由乳腺從頭合成或者由乳腺上皮細胞從血液當中攝取，當泌乳奶牛處于能量負平衡狀態(tài)時，這時候就要動用體內(nèi)內(nèi)源性脂肪(脂肪或肝脂類)來滿足泌乳的需要。邢媛媛等研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可促進奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)TG的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，在1 000 ng·mLLPS處理下，與對照組相比，TG含量極顯著下降，而8 μmol·L丁酸鈉與LPS共同孵育的情況下，與LPS處理組相比，其TG含量顯著上升。本試驗檢測的是細胞上清中TG含量，而檢測細胞內(nèi)TG含量更能準確反映細胞真實產(chǎn)出的TG水平，因此后續(xù)研究中應(yīng)對細胞內(nèi)TG含量進行檢測分析。AMPK(AMP-activated protein kinase)是能量穩(wěn)態(tài)的中央調(diào)節(jié)因子，它協(xié)調(diào)代謝途徑，從而平衡營養(yǎng)供應(yīng)和能量需求。當AMPK磷酸化被激活時，會加快細胞能量的攝取以及脂肪的氧化。本試驗通過研究與脂代謝相關(guān)的AMPK信號通路，發(fā)現(xiàn)在1 000 ng·mLLPS處理下，與對照組相比，P-AMPK蛋白表達水平顯著上升，而2、8、16 μmol·L丁酸鈉與LPS分別共同孵育的情況下，與LPS處理組相比，其P-AMPK蛋白表達水平均顯著下降。說明丁酸鈉通過AMPK途徑調(diào)控了MAC-T細胞TG的合成。

用于合成TG的脂肪酸從頭合成受多種酶調(diào)控，其中，包括ACC、SCD-1、FAS等關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)。在機體中當檸檬酸和乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a后，ACC依賴ATP的羧化作用催化乙酰輔酶a生成丙二酰輔酶a用于脂肪酸的合成。SCD-1是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中膜內(nèi)的蛋白，它催化硬脂酰輔酶a(16:0)或棕櫚酰輔酶a(16:0)生成單不飽和脂肪酸油酸(18:1)或棕櫚油酸(16:1)。FAS是一種關(guān)鍵的脂肪生成酶，催化脂肪酸從頭生成的最后一步。脂肪酸的分解代謝受到CPT-1、CPT-2等酶的調(diào)控，其中，CPT系統(tǒng)將脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體，這是脂肪酸在β-氧化過程中產(chǎn)生乙酰輔酶a的限速步驟。在泌乳期間，乳腺上皮細胞中與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，ACC等都會顯著上調(diào)，而與脂肪酸分解的關(guān)鍵酶會受到相應(yīng)的抑制。本研究在1 000 ng·mLLPS處理下，與對照組相比，脂肪酸合成代謝的相關(guān)酶、mRNA表達水平顯著下降，并且-1極顯著下降；而8 μmol·L丁酸鈉與LPS共同孵育的情況下，與LPS處理組相比，其、-1 mRNA表達水平均顯著上升；16 μmol·L丁酸鈉與LPS共同孵育的情況下，mRNA表達水平顯著上升。

另外，在1 000 ng·mLLPS處理下，與對照組相比，脂肪酸分解代謝的相關(guān)酶-1、-2和ACO mRNA表達水平顯著上升；而8、16 μmol·L丁酸鈉與LPS共同孵育的情況下，與LPS處理組相比，其-1 mRNA表達水平均顯著下降；16 μmol·L丁酸鈉與LPS共同孵育的情況下，mRNA表達水平顯著下降。以上結(jié)果提示，丁酸鈉可以通過AMPK信號通路調(diào)控脂代謝關(guān)鍵酶的活性，使脂肪酸的從頭合成途徑被激活，脂分解途徑被抑制，進而提高MAC-T細胞TG的合成。

TNF-α、IL-6和IL-8是幾種重要的促炎介質(zhì)，由LPS激活的巨噬細胞產(chǎn)生，在體內(nèi)外均發(fā)揮著重要的介導和調(diào)節(jié)炎癥的作用。其中，TNF-α主要由活化的巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子之一，通過調(diào)節(jié)某些黏附分子促進炎癥活性。IL-6由角化細胞、表皮細胞、成纖維細胞和真皮內(nèi)皮細胞分泌，可促進T和B淋巴細胞的分化和某些炎癥細胞因子的釋放，通過調(diào)節(jié)細胞的生長、存活和分化，參與各種生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)，包括免疫反應(yīng)、炎癥、造血和腫瘤發(fā)生。TNF-α、IL-6和IL-8是導致組織功能障礙和代謝紊亂的主要因素，這些功能障礙和紊亂是疾病發(fā)展的重要原因。本試驗發(fā)現(xiàn)，用1 000 ng·mLLPS刺激細胞9 h后，會造成細胞內(nèi)的TNF-α和IL-6顯著升高，而不同濃度丁酸鈉和LPS共同孵育MAC-T細胞后，發(fā)現(xiàn)8和16 μmol·L丁酸鈉對LPS造成的細胞炎癥損傷有保護作用，可大大減少TNF-α和IL-6炎癥因子的分泌。該試驗提示，丁酸鈉對細胞炎癥損傷具有保護作用，能夠抵抗炎癥因子的侵襲。

4 結(jié) 論

LPS會造成MAC-T細胞脂代謝紊亂，并且相關(guān)炎癥因子升高；而不同濃度丁酸鈉的加入不僅會通過AMPK通路抑制脂分解代謝，激活脂合成代謝，進而增加TG的合成，而且可以抑制LPS對炎癥反應(yīng)的上調(diào)效應(yīng)并對細胞的炎癥損傷具有一定的保護作用。