抗菌肽Tachyplesin Ⅰ及衍生物對大腸桿菌細胞膜作用機制的對比研究

孫 棟，屈 莎，李 璇，唐善虎，李思寧，郝 剛*

(1.西南民族大學食品科學與技術(shù)學院，成都 610041； 2.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶 401120)

抗生素自規(guī)?；瘧?yīng)用以來，治愈了無數(shù)細菌性疾病，為動物與人類的健康安全發(fā)揮了舉足輕重的作用。但抗生素的長期濫用已導(dǎo)致越來越多的耐藥菌株的出現(xiàn)，如耐藥性大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等。新型高效的抗生素替代品研究開發(fā)已成為業(yè)內(nèi)的研究熱點。而抗菌肽(AMPs)存在于各種生物中，是先天免疫的進化產(chǎn)物，相比抗生素具有廣譜抗菌活性、對宿主的選擇性細胞毒性和不易誘導(dǎo)耐藥性等優(yōu)勢，且天然抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素作用機制不同，不易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性。這些優(yōu)勢都預(yù)示著抗菌肽在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和畜牧業(yè)等領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力。但目前某些天然抗菌肽仍存在殺菌的同時具有溶血性，本身具有毒性無法用于臨床治療等不足，因此針對抗菌肽的研究已從抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與活性研究向作用機制以及人工改造或肽類似物開發(fā)轉(zhuǎn)變。

抗菌肽tachyplesin Ⅰ(TP Ⅰ)是1988年Nakamura等從東方鱟血細胞分離純化，由17個氨基酸殘基(KWCFRVCYRGICYRRCR)組成的具有反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽，其具有抗細菌、真菌、病毒、腫瘤、寄生蟲等作用。本實驗室前期在TP Ⅰ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，利用生物信息學軟件對其分子結(jié)構(gòu)進行了重新設(shè)計，保持TP Ⅰ肽鏈長度與電荷數(shù)不變，將序列中形成TP Ⅰ兩個二硫鍵的4個半胱氨酸用酪氨酸進行替換得到了TP Ⅰ的衍生物，一級結(jié)構(gòu)為KWYFRVYYRGIYYRRYR，命名為TP Ⅰ-Y4。前期研究結(jié)果顯示，TP Ⅰ-Y4相比于母肽TP Ⅰ，熱穩(wěn)定性更好，親水性更強。圓二色譜檢測TP Ⅰ-Y4在水相及在模擬細胞膜的疏水環(huán)境中均表現(xiàn)出β-折疊結(jié)構(gòu)，且β-折疊含量高于相同環(huán)境中的TP Ⅰ。相比TP Ⅰ，TP Ⅰ-Y4對細菌的抑菌活性普遍提高，TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.125 μg·mL，相比于TP Ⅰ最小抑菌濃度降低了4倍，且TP Ⅰ-Y4的溶血性小，細胞毒性低，并具有很強的中和內(nèi)毒素的能力。本研究以大腸桿菌為模式菌，構(gòu)建脂質(zhì)體作為模式膜，對比研究了抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對細菌細胞膜的損傷機制，探討了抗菌肽以細菌細胞膜為作用靶點的抗菌機制，為抗菌肽抑菌機理和構(gòu)效關(guān)系的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4：抗菌肽TP Ⅰ及TP Ⅰ-Y4均由江蘇吉泰肽業(yè)科技有限公司采用標準Fmoc固相化學合成法進行合成，C反相高效液相色譜純化，再進行氨基酸分析及質(zhì)譜鑒定，合成從C端到N端逐一進行，C-端酰胺化，純度≥95%。

菌種：大腸桿菌(ATCC 51459)購自于北京貝北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由本課題組實驗室保存。

LB培養(yǎng)基(g·L)：稱取酵母粉(5)，蛋白胨(10)，NaCl(10)，溶解后調(diào)節(jié)pH(7.0)，固體培養(yǎng)基則加入瓊脂(15～20)，121 ℃高壓滅菌15 min。

M9培養(yǎng)基(g·dL)：稱取NaHPO·7HO(1.28)、KHPO(0.3)、NaCl(0.05)、NHCl(0.1)、CaCl(0.001)、乳糖(0.5)、MgSO(0.05)，121 ℃高壓滅菌15 min。其中，MgSO單獨溶解滅菌后混勻，乳糖待培養(yǎng)基高壓滅菌冷卻后于無菌操作臺內(nèi)加入。

β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液(g·dL)：稱取NaCl(0.8)、KCl(0.02)、NaHPO·12HO(0.29)、KHPO(0.024)、MgSO·7HO(0.025)、β-硫基乙醇(0.39)，121 ℃高壓滅菌15 min。

試劑：鄰硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、利福平、鈣黃綠素、β-巰基乙醇購自上海羅恩試劑公司，紅霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，正十六烷購自成都市科隆化學品有限公司，鉀離子、鈣離子檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式冷凍離心機(5804R)購自德國Eppendorf公司，全自動酶標儀(318 C+)購自上海沛歐，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52A)購自上海亞榮生化，恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2102C)購自上海智城，自動液相色譜分離層析儀(MB99-2)購自上海瀘西，超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-IID)購自寧波新芝生物，激光粒度儀(Zetasizer Nano ZS)購自馬爾文公司，熒光分光光度計(F-4700)購自日本日立公司。

1.3 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面電位的影響

參考陳飛龍的方法略作修改，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液5 000 r·min離心，無菌超純水洗滌2～3次后，重懸至=0.2～0.3。取500 μL菌懸液至離心管后，加入不同濃度TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液，陰性對照為無菌超純水。37 ℃靜置孵育15 min，5 000 r·min離心5 min后，1 mmol·L的KNO(pH6.2)溶液洗滌2～3次，KNO溶液將其重懸稀釋至=0.1，激光粒度儀測定菌體細胞表面電位。每組樣品設(shè)置3組，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.4 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面疏水性的影響

參照郝剛的方法稍作修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液5 000 r·min離心，無菌生理鹽水洗滌2～3次，1 mmol·L的KNO(pH6.2)重懸至=0.2～0.3，取1 mL菌液后加入不同濃度TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液，陰性對照為生理鹽水。37 ℃靜置孵育15 min，630 nm處測值。再取1 mL的菌液加入十六烷0.2 mL，旋渦器混勻充分，室溫下靜置孵育25 min，待兩相完全分離后，取下層水相溶液在630 nm處測值。則大腸桿菌吸附率=(1-)×100%。每組樣品設(shè)置3組，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.5 包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體的制備

參照趙多艷和衛(wèi)延安的方法稍作修改。采用蛋黃卵磷脂和心磷脂(4∶1)進行制備，稱取0.4 g磷脂加入30 mL氯仿溶解，加入10 mL 50 mmol·L鈣黃綠素/PBS緩沖溶液，避光處理后，冰浴置于超聲波細胞粉碎機，300 W間歇超聲30 min，使溶液充分混合呈均一相。35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，待溶液至膠狀時補加2～3 mL PBS溶液洗脫。形成的脂質(zhì)體通過0.22 μm聚碳酸酯濾器過濾，得到大單層囊泡。再上葡聚糖凝膠G-25柱(1.6×50 cm)，PBS緩沖溶液(pH7.4)進行洗脫，分離脂質(zhì)體與未被包裹的鈣黃綠素，收集脂質(zhì)體適當濃縮后4 ℃保存?？瞻字|(zhì)體制備與上述方法相似，使用前適當稀釋。

1.6 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4引起空白脂質(zhì)體膜破裂試驗

取96孔細胞培養(yǎng)板加入100 μL空白脂質(zhì)體，再加入100 μL不同濃度的TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液；陽性對照為90 μL的PBS和10 μL10% Triton X-100溶液；陰性對照為100 μL PBS溶液?；靹蚝笫覝胤跤? min，全自動酶標儀在595 nm處測量值。每組樣品設(shè)置3組，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.7 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4引起包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體的泄漏試驗

取包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體1.5 mL，加入1.5 mL不同濃度的TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液，混勻，室溫下孵育10 min，置于1 cm石英液池中，熒光分光光度計檢測熒光強度F。設(shè)置激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm，光電倍增管電壓400 V，狹縫2.5 nm。陽性對照為1.5 mL的PBS和30 μL的TritonX-100(10%)溶液，記錄熒光強度為；陰性對照為1.5 mL PBS溶液，記錄熒光強度為。根據(jù)鈣黃綠素泄漏率公式計算：泄漏率=(-)/(-)×100%。每組樣品設(shè)置3組，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.8 脂質(zhì)體對TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4熒光光譜的影響

取一定濃度TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液1.5 mL，各加1.5 mL空白脂質(zhì)體混勻后靜置15 min，調(diào)節(jié)pH為9.0后置于1 cm石英液池中測量其熒光光譜，PBS緩沖液作對照試驗。設(shè)定激發(fā)波長355 nm，掃描范圍300～450 nm測定TP Ⅰ溶液中色氨酸的熒光光譜；激發(fā)波長305 nm，掃描范圍230～350 nm測定TP Ⅰ-Y4溶液中酪氨酸的熒光光譜。光電倍增管電壓400 V，狹縫1.0 nm，掃描速度240 nm·min。

1.9 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4引起大腸桿菌胞內(nèi)K+、Ca2+泄漏的測定

參照鉀離子、鈣離子檢測試劑盒說明書進行適當修改后測定。

1.10 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌外膜滲透性的影響

選用疏水性的抗生素利福平和紅霉素與TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4作用，進行對大腸桿菌的協(xié)同抑制試驗。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液5 000 r·min離心，無菌超純水洗滌后，重懸至=0.2左右。吸取菌液160 μL于96孔細胞培養(yǎng)板中，各加入20 μL的TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液，使終濃度為1/2MIC，再加入不同濃度的利福平與紅霉素溶液；陰性對照為20 μL無菌超純水與20 μL紅霉素和利福平溶液。37 ℃孵育10 h后，吸光度的減少量值用全自動酶標儀在630 nm處檢測。試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.11 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌質(zhì)膜滲透性的影響

1.11.1 細胞質(zhì)膜的滲透性檢測 參考蘇戰(zhàn)強等的方法稍作修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液離心，無菌生理鹽水洗滌2～3次后,重懸至=0.2～0.3。吸取2 mL加入10 mL的M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37 ℃下振蕩孵育8 h后,離心洗滌，用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸菌體至=0.2。吸取800 μL菌液于離心管中，分別加100 μL TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液(終濃度為MIC、4MIC)，再加入100 μL的 ONPG(1 mg·mL)混勻，37 ℃孵育培養(yǎng)，每0.5 h測一次值(λ=405 nm)；陰性對照為100 μL β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液+100 μL ONPG，測得值。大腸桿菌質(zhì)膜滲透性增加導(dǎo)致的吸光度值Δ=-。

1.11.2 β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測 取“1.11.1”中β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸菌900 μL，分別加入100 μL TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4溶液(終濃度為MIC、2MIC)混勻，37 ℃孵育1 h后，離心取上清900 μL，加100 μL的ONPG(1 mg·mL)再孵育4 h，測得值(λ=405 nm)；細菌菌液加100 μL無菌水于37 ℃孵育1 h，冰浴置于超聲波細胞粉碎機，300 W間歇破碎45 min后離心取上清，加入100 μL的ONPG(1 mg·mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，作為陽性對照測得值。則β-半乳糖苷酶相對活性=/×100%。

2 結(jié) 果

2.1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面特性的影響機制

2.1.1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面電位的影響 通過馬爾文激光粒度儀檢測抗菌肽對大腸桿菌細胞表面電位的影響。從表1可知，抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4作為陽離子抗菌肽與帶負電的細菌胞膜結(jié)合的第一步是依靠靜電相互吸引作用，這導(dǎo)致了胞膜表面電負性降低，且隨著肽濃度的增大電負性降低趨勢越明顯。與TP Ⅰ相比，TP Ⅰ-Y4引起胞膜表面電負性降低更明顯。

表1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面電位的影響Table 1 Effect of TP Ⅰ and TP Ⅰ-Y4 on the surface potential of E. colimV

2.1.2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面疏水性的影響 正十六烷是一種對細菌沒有損傷性的疏水性有機溶劑，大腸桿菌表面疏水性的變化可由正十六烷的吸附率直接體現(xiàn)。由表2可知，相比于對照組，兩種抗菌肽作用后，大腸桿菌的正十六烷吸附率明顯升高，即細菌表面疏水性提高，且隨濃度梯度的增加吸附率逐漸增大，細菌的表面疏水性在2MIC時較對照組提高了5倍左右?？咕腡P Ⅰ-Y4引起的吸附率增加較TP Ⅰ稍強。TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4作為兩親性陽離子抗菌肽，與大腸桿菌胞膜結(jié)合過程中帶正電荷氨基酸結(jié)合細胞膜，而疏水性氨基酸暴露在細菌表面，進而使細菌表面疏水性提高。

表2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌表面疏水性的影響Table 2 Effect of TP Ⅰ and TP Ⅰ-Y4 on the surface hydrophobicity of E. coli %

2.2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4與脂質(zhì)體的作用機制

2.2.1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對脂質(zhì)體膜破壞的影響 以卵磷脂和心磷脂(4∶1)構(gòu)建脂質(zhì)體模擬細胞膜，考察抗菌肽TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4對脂質(zhì)體膜的破壞作用。由圖1 可看出，陽性對照Triton X-100作為乳化劑可快速溶解脂質(zhì)體。相比于陰性對照PBS，TP Ⅰ未明顯引起脂質(zhì)體膜破裂，而TP Ⅰ-Y4能引起部分脂質(zhì)體膜破壞，隨肽濃度的升高對膜的破壞效果增加，但與陽性對照相比，脂質(zhì)體膜并沒有完全崩塌。

圖1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對脂質(zhì)體膜的破裂Fig.1 Rupture of liposome membrane by TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4

2.2.2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體的影響 通過抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4引起脂質(zhì)體包裹的鈣黃綠素的泄漏率來進一步評價肽對膜的作用。從圖2可看出，兩種抗菌肽均能使鈣黃綠素從脂質(zhì)體中泄漏出來，且是濃度依賴性。相同濃度下，TP Ⅰ-Y4引起的鈣黃綠素泄漏率遠遠大過TP Ⅰ，濃度為0.5 μg·mL時泄漏率就與20.0 μg·mL的TP Ⅰ相當，這說明TP Ⅰ-Y4能對磷脂雙分子層造成很大的破壞。這種結(jié)果也與前面脂質(zhì)體膜破裂結(jié)論相印證，兩種肽在與脂質(zhì)體膜結(jié)合后，插入脂質(zhì)雙分子層中使膜結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄。衍生肽TP Ⅰ-Y4對膜的破壞程度大于TP Ⅰ，這可能也是TP Ⅰ-Y4的抑菌活性強于TP Ⅰ的原因。

圖2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4引起脂質(zhì)體包裹的熒光染料泄漏率Fig.2 Percentage leakage of liposome encapsulated fluorescent dyes induced by TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4

2.2.3 脂質(zhì)體對TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4熒光光譜的影響 蛋白質(zhì)分子在親水環(huán)境中的熒光波長比它在疏水環(huán)境中的長。即溶劑疏水性提高，熒光光譜會藍移，同時，伴隨熒光強度增大。蛋白質(zhì)處于水相環(huán)境中，若λmax藍移或熒光強度增大，則熒光基團必處于疏水環(huán)境?？咕腡P Ⅰ序列N端處含有1個Trp，而TP Ⅰ-Y4序列中分散著6個Tyr，兩者都具有自身熒光光譜，可通過TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4作用于脂質(zhì)體后的熒光光譜的變化來探究肽與膜的作用機制，結(jié)果如圖3所示。TP Ⅰ在354 nm處出現(xiàn)峰值，作用脂質(zhì)體后熒光強度由8.63到737.8，增加了85倍；TP Ⅰ-Y4在304 nm出現(xiàn)峰值，作用脂質(zhì)體后熒光強度由4.341～206.3，增加了47倍。雖然兩者作用脂質(zhì)體后最大熒光強度波長未發(fā)生明顯藍移，但熒光強度增大明顯，表明兩個肽皆能將自身熒光特性殘基插入疏水的脂質(zhì)雙分子層中。色氨酸位于TP Ⅰ序列的N端第2個殘基處，可推測TP Ⅰ的N端與脂質(zhì)體結(jié)合插入到磷脂雙分子層中。而TP Ⅰ-Y4中的6個酪氨酸分散在序列各個位置，且均比色氨酸位置靠后，推測TP Ⅰ-Y4至少是β-折疊結(jié)構(gòu)的頭部甚至整個分子插入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中，引起熒光強度的改變。結(jié)合溶液pH>8.5時色氨酸與酪氨酸的自身熒光強度之比是100∶9分析，TP Ⅰ-Y4與脂質(zhì)體的結(jié)合能力相對較TP Ⅰ強一些。

圖3 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4作用脂質(zhì)體后的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4 acting liposomes

2.3 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4影響大腸桿菌壁膜滲透性及離子泄漏機制

2.3.1 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌胞內(nèi)離子泄漏的影響 抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4造成大腸桿菌胞內(nèi)Ca和K泄漏的結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，兩種肽都能引起胞內(nèi)Ca和K的泄漏，當抗菌肽TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4的濃度為MIC時，Ca泄漏率達到38.75%、52.19%，K泄漏率達到65.84%、73.12%，且隨著濃度的增大泄漏率逐漸增大。TP Ⅰ-Y4引起Ca和K的泄漏率始終強于TP Ⅰ。這種結(jié)果說明了兩種肽作用大腸桿菌后破壞了胞膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)離子泄漏，細胞失去平衡最終導(dǎo)致死亡，TP Ⅰ-Y4對膜的破壞程度更大，抑菌活性更強。

圖4 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4誘導(dǎo)大腸桿菌胞內(nèi)Ca2+和K+的泄漏率Fig.4 Percentage leakage of intracellular Ca2+ and K+ in E.coli by TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4

2.3.2 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌外膜滲透性的影響 通過抗生素利福平和紅霉素這兩種疏水性物質(zhì)的協(xié)同抑菌試驗來探究抗菌肽滲透革蘭陰性菌細胞外膜的能力。這兩種抗生素不能有效穿透完整的革蘭陰性菌的外膜，但能穿過被損壞或有缺陷的菌株外膜，因此可作為檢測TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4誘導(dǎo)的外膜滲透性增加的探針。由圖5可以看出，抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4分別與利福平、紅霉素協(xié)同作用后的吸光度變化值均高于兩種抗生素單獨作用的吸光度變化值。表明抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4與利福平、紅霉素具有明顯的協(xié)同作用，大腸桿菌對任何濃度的抗生素都表現(xiàn)的更加敏感?？咕腡P Ⅰ/TP Ⅰ-Y4均能提高大腸桿菌的外膜滲透性，TP Ⅰ協(xié)同紅霉素及利福平誘導(dǎo)的外膜滲透性要比TP Ⅰ-Y4更加明顯，可能是TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4的自身結(jié)構(gòu)差異，與紅霉素、利福平的協(xié)同抑菌方式不同所致。以上結(jié)果說明，抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4均能破壞大腸桿菌細胞外膜結(jié)構(gòu)，誘使其膜滲透性增加，進而使大腸桿菌細胞形態(tài)發(fā)生變化，受到損傷，甚至死亡。

圖5 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌細胞外膜滲透性的影響Fig.5 Effect of TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4 on the permeability of outer membrane of E.coli

2.3.3 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌質(zhì)膜滲透性的影響

2.3.3.1 細胞質(zhì)膜的滲透性檢測：為進一步探究抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌胞膜的作用機制，通過β-半乳糖苷酶活性探究兩個肽對細菌質(zhì)膜的滲透性。β-半乳糖苷酶存在于細菌胞內(nèi)，可水解ONPG產(chǎn)生半乳糖和黃色的鄰硝基苯酚(ONP)。當細菌質(zhì)膜滲透性增加，小分子ONPG滲透入細菌胞內(nèi)與β-半乳糖苷酶發(fā)生反應(yīng)，因此可測定其水解產(chǎn)物ONP的濃度來反映細胞質(zhì)膜的滲透性。如圖6所示，兩種抗菌肽僅僅作用30 min時，能擾動大腸桿菌內(nèi)膜導(dǎo)致滲透性增加，大量ONPG流入胞內(nèi)。TP Ⅰ-Y4擾動質(zhì)膜引起ONPG滲入胞內(nèi)的能力高于TP Ⅰ。兩個肽的濃度為MIC、4MIC時滲透性變化不明顯，濃度為MIC時已能擾動膜導(dǎo)致細菌質(zhì)膜滲透性提高。這也與前期脂質(zhì)體-鈣黃綠素泄漏、胞內(nèi)離子泄漏試驗結(jié)果相印證。

圖6 TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌細胞質(zhì)膜的滲透性檢測Fig.6 Detection of membrane permeability of E.coli by TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4

2.3.3.2 β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測：為考察抗菌肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4作用后β-半乳糖苷酶作為大分子細菌內(nèi)源酶是否泄漏至胞外，取經(jīng)抗菌肽處理后的細菌上清液檢測β-半乳糖苷酶的相對活性。如表3所示，兩種抗菌肽皆導(dǎo)致β-半乳糖苷酶滲透至胞外。肽液濃度為MIC時，上清液中β-半乳糖苷酶的相對活性為45.77%和52.21%，且隨濃度增加略有升高。TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4均表現(xiàn)出很強的細胞質(zhì)膜破壞能力，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子內(nèi)容物泄漏，TP Ⅰ-Y4對質(zhì)膜的破壞能力較強。

表3 β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測Table 3 Permeability of extracellular β-galactosidase detection %

3 討 論

抗菌肽對微生物的抑制作用可通過多種方式實現(xiàn)，目前研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗菌肽通過細胞質(zhì)膜去極化，誘導(dǎo)磷脂不規(guī)則分布，抑制重要代謝產(chǎn)物的合成而達到殺菌目的。而研究最多的是抗菌肽針對細胞膜的作用機制，即破壞細胞膜的完整性，增加細胞膜的通透性。作者前期在抗菌肽TP Ⅰ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，用4個芳香族氨基酸酪氨酸替換4個構(gòu)成二硫鍵的半胱氨酸，重新設(shè)計了一種不含二硫鍵的衍生肽TP Ⅰ-Y4。研究發(fā)現(xiàn)，相比于母肽TP Ⅰ，TP Ⅰ-Y4的抑菌活性和內(nèi)毒素中和活性更強，溶血活性降低。細胞膜作為細菌的保護屏障，在受損時會導(dǎo)致其通透性改變而影響細菌細胞的新陳代謝。本研究通過探究抗菌肽TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4作用大腸桿菌后對表面特性、離子泄漏和膜滲透性的影響以及與脂質(zhì)體膜的作用，對比研究了兩個肽對大腸桿菌細胞膜的作用機制。

膜電位監(jiān)測和表面疏水性結(jié)果顯示，兩個肽通過與菌體表面帶負電的基團如脂多糖以靜電相互吸引作用結(jié)合膜，導(dǎo)致細菌表面電負性降低、疏水性增強，TP Ⅰ-Y4引起細菌表面電負性降低與疏水性增強要優(yōu)于TP Ⅰ，這說明細菌表面能吸附更多的TP Ⅰ-Y4分子。與細菌表面結(jié)合是抗菌肽實施抗菌活性的第一步，肽最終起到擾動膜結(jié)構(gòu)、破壞細胞壁膜的作用，這也與馮建嶺的研究結(jié)果相一致。肽與脂質(zhì)體作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP Ⅰ-Y4引起鈣黃綠素的泄漏率大于TP Ⅰ，推測TP Ⅰ僅僅是擾動了脂質(zhì)體膜，而TP Ⅰ-Y4能引起部分脂質(zhì)體膜破裂，但膜并不完全崩塌；Doherty等通過NMR技術(shù)研究tachyplesin Ⅰ線性類似物肽與細胞脂膜的相互作用表明，天然鱟素和線性衍生肽對細胞膜的作用機理存在不同。熒光光譜也顯示，兩種肽均能將自身熒光特性氨基酸插入磷脂雙分子層中，使膜結(jié)構(gòu)紊亂，TP Ⅰ-Y4結(jié)合插入脂質(zhì)體的能力強于TP Ⅰ。利福平和紅霉素協(xié)同試驗顯示兩種肽均能降低G菌細胞外膜表面的選擇滲透性功能，離子泄漏試驗表明，TP Ⅰ-Y4隨濃度增大引起的Ca和K的泄漏率比TP Ⅰ大，這與脂質(zhì)體試驗結(jié)果一致。β-半乳糖苷酶滲透性試驗表明,兩個肽濃度在MIC時就能引起內(nèi)膜滲透性增大，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子內(nèi)容物泄漏，設(shè)計肽TP Ⅰ-Y4對細胞膜的破壞程度更大。通過脂質(zhì)體包裹熒光素、離子泄漏及細胞膜滲透性試驗，證實了TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌內(nèi)、外膜都具有很強的破壞能力，導(dǎo)致離子及胞內(nèi)大分子內(nèi)容物泄漏而使細胞死亡。這與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TP Ⅰ通過陽離子性、兩親性與胞膜上脂多糖結(jié)合，改變膜的通透性形成穿膜孔道，引起胞內(nèi)物質(zhì)流出使細胞死亡的結(jié)果一致。

相比母肽TP Ⅰ，Tyr的取代使得衍生肽TP Ⅰ-Y4親水性更強、β-折疊含量更高，同時缺少了二硫鍵的束縛導(dǎo)致分子更加柔韌、伸展，這些結(jié)構(gòu)上的因素導(dǎo)致更多的TP Ⅰ-Y4分子結(jié)合大腸桿菌細胞表面，在插入、穿透細胞外、內(nèi)膜的過程中，對膜的擾動、破壞程度更大，導(dǎo)致離子及細胞內(nèi)容物的泄漏程度更大。這也解釋了為什么相比TP Ⅰ，TP Ⅰ-Y4對大腸桿菌的抑菌活性更強，殺菌速度更快。

4 結(jié) 論

本研究以抗菌肽TP Ⅰ及其衍生肽TP Ⅰ-Y4作用大腸桿菌細胞膜的抑菌機理進行對比研究。結(jié)果表明，TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4均能結(jié)合細胞膜引起膜表面電位升高，疏水性增強等特性變化；TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4均能插入磷脂雙分子層擾動脂質(zhì)體膜引起熒光素的泄漏；TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4均能誘導(dǎo)細胞內(nèi)、外膜通透性增加，引起胞內(nèi)離子以及大分子物質(zhì)的泄漏。相比之下，衍生肽TP Ⅰ-Y4能更強地結(jié)合細胞膜，對膜的表面特性影響更大，膜的擾動、破壞程度更強，促使膜滲透性增加導(dǎo)致離子及大分子的泄漏更突出。作為β-折疊型抗菌肽的典型代表，tachyplesin I及其衍生物在活性、結(jié)構(gòu)與膜作用機制之間的構(gòu)效關(guān)系，有待進一步探索研究。