現(xiàn)代生物技術推動塑料中聚對苯二甲酸乙二酯綠色降解的研究進展

李磊，高鑫，齊宏斌，李超，路福平，3，毛淑紅，3，秦慧民，3

（1工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300457）

塑料類產品是人類生產和生活的必需品，為人類的日常生活帶來了諸多便利，因其成本低、絕緣性好、可塑性強等優(yōu)點被廣泛使用。由于人類對塑料的需求急劇上升，在過去25年里，全球塑料產量翻了兩倍［1］。Borrelle等對173個國家的塑料使用進行定量評估，2016年全球廢棄塑料量有1900萬～2300萬噸，到2030年預計達到5300萬噸/年［2］。同時，國內塑料的生產與處理情況亦日益嚴重，2020全年塑料丟棄量高達3840萬噸（圖1）。由于不合理處置，大多數(shù)的塑料垃圾被傾倒在陸地和海洋中。早在21世紀初，塑料就占到海洋垃圾的60%～80%，某些地區(qū)甚至高達90%～95%［3］。顯然“白色污染”已經(jīng)成為一種全球的威脅，嚴重影響到全球海洋及生態(tài)系統(tǒng)。此外，廢棄在陸地上的塑料暴露在氧氣和強烈的陽光下，經(jīng)過衰變和裂解會形成微塑料，被鳥類和魚類誤食后，通過食物鏈被人體攝入從而帶來極大的危害［4］。

圖1 2020年中國塑料生產及處理情況Fig.1 Plastic production and processing in China in 2020(The data in the figure come from the National Bureau of Statistics.In 2020,the output of plastic products in China was 76.032 million tons,and the consumption of plastics was 90.877 million tons.Compared with 2019,this was a 12.2%increase.Plastic waste was 38.4 million tons.Green recycling accounts for 17.6%of the total waste)

從塑料加工生產的原材料來看，由天然或者生物大分子組成的高聚物可作為天然塑料，這類塑料雖然能被微生物降解，但是占比較?。?］，僅占塑料市場的25%～30%左右；另一類是單體經(jīng)聚合反應形成的高分子聚合物合成塑料，這類塑料種類繁多、廣泛應用于各個領域，但很難被降解。塑料產品中使用較為廣泛的聚對苯二甲酸乙二酯（polyethylene terephthalate，PET），是由對苯二甲酸二甲酯與乙二醇酯交換或以對苯二甲酸與乙二醇酯化先合成對苯二甲酸雙羥乙酯，再經(jīng)縮聚反應形成，屬于結晶型飽和聚酯，根據(jù)所用領域的不同對PET結晶度調整；2013年全球產量高達5600萬噸［6］。因其成本低、耐用性好以及優(yōu)良的食品包裝性能，PET成為最受歡迎的塑料之一，全球有一半以上的合成纖維和塑料瓶屬于PET。PET塑料的骨架上存在芳香化合物對苯二甲酸（TPA）難以被降解，因此，PET塑料的回收方式及有效降解成為其綠色發(fā)展的卡脖子問題。

傳統(tǒng)的PET處理的方法主要包括填埋、回收、焚燒、化學降解等［7-8］，還會造成降級使用、工藝復雜、二次污染大等問題，利用新興的合成生物學技術手段探索塑料的生物降解能避開這些缺點，通過代謝將其轉化為水、二氧化碳、生物質等進入地球循環(huán)系統(tǒng)；20多年來，對PET生物降解的研究一直是全球熱門問題［5］。大多數(shù)可生物降解的塑料都是聚酯塑料，盡管PET主鏈中含有對苯二甲酸酯以及PET的半結晶性質會影響自身降解，但在利用生物降解方面潛力依然很大。利用微生物代謝或者多酶級聯(lián)反應將PET解聚成單體，同時也可進一步反應生成高附加值產品；通過對酶元件和新型改良PET材料利用計算機模擬進行“雙向改造”，達到預期的降解效果。本文重點綜述了包括宏基因組學在內的多種酶的篩選與挖掘方法、PET的雙向改造以及相關酶的計算機智能設計與改造情況，同時還總結了降解PET的微生物和酶的研究進展。

1 塑料降解微生物及新酶基因篩選與挖掘方法

過去幾十年間用于挖掘微生物和新酶基因的常規(guī)培養(yǎng)方法一直被延用，利用該方法發(fā)現(xiàn)了迄今大多數(shù)的塑料降解酶，但這種方法限制了挖掘新的塑料降解酶的篩選速度［9-12］。首先選取環(huán)境樣本，在塑料作為唯一碳源的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，分離出可利用塑料的功能性菌株，再進行全基因組測序和基因文庫構建，然后通過克隆篩選，選出可降解塑料的優(yōu)良微生物菌株，并鑒定相關酶系，進行序列比對追溯其同源性，最后對該微生物改良馴化或對酶進行表征［圖2（b）］［13］。但這種方法限制了挖掘新的塑料降解酶的篩選速度，據(jù)估計地球上只有不到1%的微生物被培養(yǎng)，大數(shù)據(jù)時代新型挖掘方法的綜合利用改變了這一現(xiàn)狀，大大拓寬了塑料降解酶的篩選范圍［14］。

圖2 塑料降解酶篩選與挖掘方法Fig.2 Schematic diagram of screening and mining methods for plastic-degrading enzymes

1.1 宏基因組學法

近年來，宏基因組學方法已經(jīng)成為探索微生物的有力工具，這是一種在基因組水平上分析微生物群落的戰(zhàn)略方法，從污染環(huán)境中識別和篩選宏基因組在宏基因組研究中至關重要；宏基因組學法的使用有助于從環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)新基因，對功能和系統(tǒng)發(fā)育基因進行大規(guī)模表征，以及分離以前未培養(yǎng)但無處不在群體的成員，提高了研究微生物群落及其復雜性和動態(tài)的分辨率，以揭示其遺傳潛力和功能多樣性［15-16］。應用該技術手段，現(xiàn)已從多種宏基因組樣本中篩選出很多能編碼降解各種類型塑料的基因［圖2（a）］。

在利用宏基因組學法篩選過程中，通常以序列為基礎或者以功能為基礎進行篩選，以序列為基礎的篩選是通過對生物信息數(shù)據(jù)庫中的序列同源性以及功能基因比較來篩選目的基因［17］，但是已知的塑料降解酶生物信息數(shù)據(jù)庫的大小和功能基因標注的水平的缺陷限制了篩選和挖掘；序列同源性的大小只能作為參考，并不能保證兩種降解酶活性的相似性，需要通過對其功能和酶學性質的表征來驗證，也可能會因為序列相似性較差而遺漏一些新的塑料降解酶［18］。Sulaiman等［19］以序列為基礎從放線菌的宏基因組文庫中發(fā)現(xiàn)了一種葉枝堆肥-角質酶（LCC），在pH 8.0、50℃條件下，其活性很高，并得出了嗜熱放線菌是PET水解酶最有前途的微生物來源的結論。LCC不僅可以作為理解PET降解酶分子機制的良好模型，而且還可能適用于表面改良和PET降解。Gaytán等［20］從垃圾填埋場衍生的宏基因組中檢索到了許多與編碼具有降解聚氨酯（PU）塑料活性的已知酶的基因序列相似的基因序列。

以功能為基礎篩選時從基因文庫出發(fā)查找所需表型并檢測其活性，在挖掘新酶方面遠超于序列篩選，挖掘全新的酶基因組時，這些酶的序列與現(xiàn)有的同源酶差異較大，因此高通量篩選方法將會大大提高篩選速率［21-22］。替代表達系統(tǒng)可用于確保功能性酶表達，例如具有二硫鍵的塑料降解酶的功能性表達不適合在普通大腸桿菌中構建，需要在畢赤酵母中構建［23］。質粒文庫因其覆蓋范圍小不適合功能篩選，而基因文庫的規(guī)模和覆蓋范圍在功能篩選方面起重要作用。此外，噬菌體來源的基因文庫篩選的有毒塑料降解酶不僅有利于在大腸桿菌中異源表達，而且有利于酶學性質的表征。Danso等［24］使用hiddenMarkov模型算法，從宏基因數(shù)據(jù)庫中對504個可能的PET水解酶候選基因進行挖掘，篩選出4種候選酶，并異源表達驗證了這些酶的功能，最后篩選出PET水解酶（PET2），證實了這種算法的有效性。通過從堆肥中構建宏基因組文庫，篩選并異源表達了新型酯酶EstC7，EstC7表現(xiàn)出突出的活性和對聚已二酸/對苯二甲酸丁二酯（PBAT）芳香酯鍵水解的強烈偏好，這也說明從極端自然生態(tài)系統(tǒng)的微生物中挖掘新型水解酶的巨大潛力［25］。

宏基因組樣本來源在塑料降解酶的挖掘中起著決定性作用，這些樣本中的微生物構成了用于生物修復的巨大酶庫，其中絕大多數(shù)的微生物存在于高度復雜的生態(tài)系統(tǒng)中［26］。通過對全球海陸環(huán)境的宏基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)編碼PET水解酶的基因分布廣泛，但具有低頻性，說明此類PET水解酶在環(huán)境中自然進化較慢。相比于自然環(huán)境，在聚合物含量高的地方發(fā)現(xiàn)塑料降解酶的概率更大，Mayumi等［27］利用靶向宏基因組學篩選降解酶，將微生物在塑料產品中孵育，分離出酶學性質好的解聚酶。Jacquin等［28］提出了塑料圈“plastisphere”的概念，即：微生物在這里適者生存，利用環(huán)境即可篩選。但此類基因文庫還需進一步開發(fā)。最近，科學家將宏基因組學挖掘方法與13C同位素標記法共用，可以直接研究酶或微生物對塑料的降解過程［29］。

1.2 蛋白質組學法

蛋白質組學可以對蛋白質直接檢測和量化表達，在廣泛的微生物種群中用于生物技術應用的新酶挖掘方面表現(xiàn)出巨大潛力［30］。Schneider等［31］利用蛋白質組學對真菌產生的生物降解酶進行定性和定量分析，揭示真菌和細菌在垃圾分解過程中的各自作用；蛋白質組學在生物聚合物降解酶挖掘中的可行性已經(jīng)被證明，激發(fā)了研究者應用蛋白質組學挖掘生物降解酶的動力。利用蛋白質組學挖掘塑料降解酶首先將微生物置于含有塑料的培養(yǎng)基里生長，因為塑料可以不同程度地誘導功能微生物表達具有塑料水解活性的酶，蛋白質組學之所以廣泛用于塑料降解酶的挖掘是由于相關微生物和塑料一起孵育時，會刺激塑料降解酶的表達［32］；然后微生物培養(yǎng)產生的蛋白質被提取并消化成小肽進行測序，利用生物信息學分析進行蛋白質鑒定，由于塑料無法進入微生物體內，參與解聚的酶需要釋放到體外，所以胞外蛋白是塑料降解酶篩選的主要目標；最后對篩選的目標酶進行結構解析、酶動力學表征等［圖2（c）］；Tesei等［33］把PBAT作為黑色真菌（Knufia chersonesos）的唯一碳源，對分泌類聚酯酶進行篩選，蛋白質組學揭示了多種組成型表達的蛋白質，并對蛋白質進行功能分析和結構預測。Zadjelovic等［34］利用蛋白質組學對營養(yǎng)缺乏的海洋微生物進行篩選，發(fā)現(xiàn)了有生物降解能力的α/β水解酶，這種酯酶的異源過表達證明了水解天然和合成聚酯的非凡能力。通過對假產堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）分泌蛋白進行蛋白質組學篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)了新型酯酶PpEst，這是首次利用蛋白質組學篩選鑒定PBAT降解酶的報告［35］。Jhong等［36］在抗微生物肽（AMP）的挖掘中，從大規(guī)模轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)出發(fā)，為AMP提供全面的功能和物理化學分析，通過對AMP數(shù)據(jù)庫中AMP-蛋白質相互作用的信息的分析、“神秘”區(qū)域檢測的抗菌效力分析、AMP目標物種的注釋以及轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)集進行檢測，以期對AMP進行功能分析和發(fā)現(xiàn)新抗菌藥物。這些研究為蛋白質組學挖掘塑料降解酶提供了堅實的理論研究基礎和重要參考。

由于生物信息學數(shù)據(jù)庫規(guī)模的局限性以及高純度蛋白質提取困難，利用蛋白質組學從復雜環(huán)境樣品中挖掘塑料降解酶仍然具有挑戰(zhàn)性；盡管近年來蛋白質組學引導的塑料降解酶挖掘被廣泛應用，但該挖掘方法仍然處于起步階段，目前所有的報道都是對單微生物的誘導培養(yǎng)。

2 塑料降解酶與微生物的研究現(xiàn)狀

PET是通過酯鍵聚合而成的水解型塑料，但由于產品的結晶程度不同，對其內部酯鍵的水解難易程度也不同［37］；現(xiàn)已篩選出多種具有降解PET性能的微生物和酶，微生物分泌的胞外解聚酶對酯鍵進行水解，把PET降解成小分子聚合物，然后被微生物進一步分解成水和二氧化碳。酶對PET降解時，要考慮5個因素：①最適反應溫度最好超過玻璃化溫度（Tg）；②吸水性與溫度、結晶度和聚合物鏈的取向高度相關；③結晶度；④聚合物鏈的取向是否有序；⑤表面拓撲結構，這取決于聚合物鏈的結晶度和取向。一些來自真菌和放線菌的脂肪酶、酯酶［38］以及角質酶［39］被報道，這些酶具有水解非晶態(tài)PET及修飾PET膜表面的功能，酯酶作用于短鏈酰基酯，角質酶作用于中鏈?；ィǜ哌_C8～C10），而脂肪酶作用于中長鏈?；?。

2.1 角質酶

天然或合成的脂肪族聚酯產品如PET、對苯二甲酸丁二醇酯-己二酸共聚物（BAT）在室溫下可被各種酯鍵水解酶水解，Müller等［40］首次報道了PET可被聚酯酶水解的可能。真菌角質酶包括來自植物病原菌、非植物病原真菌以及放線菌的角質酶，Kleeberg等［41］首次純化了來自真菌和嗜熱子囊菌（Thermobifida fusca）的蛋白，該酶可以解聚BAT，并確定了蛋白的氨基酸序列。隨后Baker等［42］對聚酯降解進行研究，發(fā)現(xiàn)角質酶在聚酯的水解中起著重要作用。胡小平等［43］從嗜熱芽孢桿菌屬中分離出聚脂酶，并且從嗜熱菌（Thermobifida albaAHK119）中克隆出一個新的角質酶，由兩個串聯(lián)角質酶基因組成。Ribitsch等［44］從T.albaDSM43185克隆出角質酶；此外，Acero等［45］在嗜熱菌（Thermobifida cellulosilyticaDSM44535）里發(fā)現(xiàn)了編碼角質酶（Tc_Cut1、Tc_Cut2）的基因，其蛋白質的氨基酸序列與此前在T.fuscaNTU22中發(fā)現(xiàn)的角質酶Tfu_0883和Tfu_0882相同，科研人員還測定了角質酶的活性，Tc_Cut1的活性大于Tc_Cut2，在50℃下，Tc_Cut1對37%結晶度的PET水解作用可以持續(xù)120 h。迄今為止報道的所有嗜熱菌屬都存在串聯(lián)角質酶基因，雖然同源性較高，但活性差異很大，即便是來源于不同種屬的角質酶基因也有很高的同源性，角質酶的起源種屬可能是嗜熱菌屬，擁有聚酯降解性角質酶的種屬在傳代過程中不斷進化從而產生了差異。特異腐質菌（Humicola insolens）（HiC）、門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）和腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）來源的角質酶被用來催化低結晶度的PET，HiC在70℃下反應96 h轉化率可達到100%，而另外兩種酶在50℃下就會失活［46］。綠圓跳蟲（Sminthurus viridisAHK190）來源的角質酶（Cut190）突變體Cut190/Q138A（Cut190/S226P/R228S/Q138A）在65℃下反應15 h可將結晶度為14.1%的PET超纖維完全水解［47］；包括HiC在內的很多角質酶已經(jīng)被報道有水解結晶度較大PET的能力，這說明高結晶度的PET有被水解的潛力。來源于植物堆肥的角質酶LCC在70℃條件下催化24 h，可降解25%無定形PET薄膜，LCC與TfH聚酯 水 解 酶 有 一 定 的 同 源 性［48］，而T.fuscaDSM43793來源的角質酶TfH在55℃條件下催化3周，可使結晶度為10%的PET膜質量損失50%［49］（表1）。角質酶的獨特性質取決于這些蛋白質結構缺乏覆蓋在活性位點的蓋子，所以活性位點經(jīng)常暴露在溶液中，PET水解是聚合物鏈的靈活性和角質酶結構相互作用的結果。

表1 PET降解酶研究進展Tab.1 Research progress of PET degrading enzymes

2.2 酯酶與脂肪酶

酯酶是與對硝基苯酚（p-NP）的短鏈?；ケ憩F(xiàn)出更高的活性的一類酶，被認為優(yōu)先水解PET的非定形區(qū)域，結晶度的增加會限制聚合物鏈的擺動，并降低酶對聚合物鏈攻擊概率；Ribitsch等［50］從嗜鹽耐熱雙歧桿菌（Thermobifida halotoleransDSM44931）發(fā)現(xiàn)了可降解PET的酯酶，可在50℃條件下與PET相互作用，并且與放線菌來源的角質酶有高度同源性。嗜熱鏈霉菌（Thermobifida insolens）產生一種分子量大約為20～21 kDa的脂肪酶在pH 8.5、80℃下展現(xiàn)出最大活性，該酶的活性位點由Ser140、Asp195和His208組 成，T.insolens的 結 構 與F.solani的 酶 有較高的同源性［51-52］。嗜熱絲狀真菌的脂肪酶由269個氨基酸組成，分子量為31.7 kDa，其蛋白結構已經(jīng)被解［53］。米曲霉（Aspergillus oryzae）產生的脂肪酶被對苯二甲酸雙酯（BHET）誘導后，可水解對苯二甲酸二乙酯（DP），并且提高該酶對PET的親和力［54］。

2.3 PET水解酶

PET水解酶與許多來自非嗜熱細菌的水解酶（PET降解能力尚未見報道）具有65%以上的序列同源性，其中來自德氏嗜酸菌（Acidovorax delafieldiiBS-3）的解聚酶顯示出最高同源性（82%）［55］。Yoshida等［56］將Ideonella sakaiensis在結晶度為1.9%的PET上進行培養(yǎng)，可在30℃下生長40 d，并從中克隆出PET水解酶（PETase）基因，PETase與放線菌來源的角質酶有45%～53%的氨基酸序列相同，I.sakaiensis來源的PETase（IsPETase）在迄今為止報道的所有PET降解酶中在溫和條件下具有最高的PET降解活性，在30℃下僅需3周即可完全降解PET，但其低熱穩(wěn)定性限制了有效和實用的PET酶促降解能力。

盡管PET降解酶類的挖掘和研究處于剛剛起步階段，但是在晶體解析催化機理方面發(fā)展卻很迅速，目前已經(jīng)有多類酶的結構被解析，在定向改造方面發(fā)揮了極大的作用?？蒲腥藛T已經(jīng)對I.sakaiensis來源的PETase晶體結構進行了報道，PETase屬于典型的α/β-水解酶折疊類型，包含1個扭曲的中央β-折疊，由9個β-鏈組成，中間夾有6個α-螺旋，經(jīng)過與其他角質酶的同源性比對，發(fā)現(xiàn)PETase的催化三聯(lián)體為S131-H242-D177，PETase的活性口袋比其他角質酶的更寬，所以PET可以輕易進入PETase的活性位點，科研人員還對底物結合和催化機制進行了研究［57-59］。郭瑞庭等通過對PETase晶體結構與底物和產物類似物復合體的結構分析，發(fā)現(xiàn)PETase中W156在同源酶對應位點是高度保守的，而PETase的W156可以展現(xiàn)出多個擺動構象，185位點的殘基會影響W156自身的靈活性，進而影響底物結合模式［60］；此外還分析了PETase與底物和產物類似物的結合，推動了對PETase反應機理的理解，PET主要通過疏水相互作用與口袋結合，PET的羰基位于催化中心，其中O原子面向氧陰離子孔，W156處于B構象（S185）時可為PET的TPA部分提供T堆積力，通過發(fā)生經(jīng)典水解反應，連續(xù)形成酰基酶中間體，水分子進行第2次親核攻擊以裂解酯鍵，其余苯甲酸基與W156發(fā)生較強的π堆疊作用，底物被分解并最終從活性中心釋放出來。Perz等［61］從肉毒梭菌（Clostridium botulinumATCC3502）克隆了兩個編碼酯酶（Cbotu_EstA、Cbotu_EstB）的基因，而且還得到了酶Cbotu_EstA的晶體結構。晶體結構的解析在同源性的追溯方面也意義重大，T.albaAHK119來源的Est119角質酶晶體結構被解析，科研人員將Est119序列與水解角質的酯酶進行比對分析，發(fā)現(xiàn)芳香聚酯酶屬于角質酶家族［62］。Est119還與鏈霉菌（Streptomyces exfoliates）來源的脂肪酶結構進行比對分析，通過結構比對發(fā)現(xiàn)Est119是一種α/β水解酶，9條β鏈被8條α螺旋包圍，并發(fā)現(xiàn)該酶是一種沒有蓋子的角質酶。通過對晶體結構分析，還可以得到輔因子對活性及其空間構象的影響；S.viridisAHK190來源的角質酶突變體Cut190-S176A與Ca2+結合后得到非活性形式的晶體結構，分析Cut190的底物識別機制，并且通過突變分析了Ca2+的作用；Ca2+在第1位點（Ser76、Ala78、Phe81和Asn133）的結合是Cut190獨有的，這直接關系到酶的激活與否，但第2位點（Glu220、Asp250和Glu296）的結合在Est119和其他角質酶中很常見，影響著酶的熱穩(wěn)定性［63-64］。Bollinger等發(fā)現(xiàn)并解析了能降解PET的聚酯水解酶（PE-H），該酶為α/β水解酶折疊類型，中間由9條β鏈組成，兩側有7個α螺旋，PE-H中有兩個二硫鍵，連接C214-C251和C258-C302，該結構在Ⅱ型PET降解酶中較為常見，高度保守的殘基S171、D217、H249構成了PE-H的催化三聯(lián)體［65］。

2.4 塑料降解微生物的鑒定

Yoshida等［56］從 環(huán) 境 中 的PET上 篩 選 出I.sakaiensis201-F6，該菌可以把PET作為碳源和能源物質，生成無害的TPA和乙二醇（EG）。Fusarium oxysporum和F.solani是可以生長在含有PET的培養(yǎng)基中的絲狀真菌，但是研究者并沒有對其生長水平進行檢測［66-67］。De Castro團隊［68］對環(huán)境中降解PET的微生物篩選時，發(fā)現(xiàn)H.insolens具有很好降解PET的潛能，并且與南極假絲酵母協(xié)同作用比單獨使用轉化效率高2.2倍。Streptomyces scabies中的基因sub1編碼的蛋白可降解PET生成TPA，在添加Triton后其活性明顯增強，且37℃下至少穩(wěn)定20 d［69］。Farzi等［70］評估了鏈霉菌屬對PET的降解和動力學表征，利用GC-MS分析了生物降解過程（圖3）。在海洋微生物Pseudomonas aestusnigriVGXO14T基因組中鑒定出的新型羧酸酯水解酶有聚酯降解能力，可在30℃下對無定形PET降解［65］。Beaulieu等［71］篩選的S.scabies具有顯著的穩(wěn)定性和降解PET的能力。此外，P.citrinum、T.reesei以及B.cepacia被鑒定出也具有降解PET的能力［72-74］（表2）。

表2 PET降解微生物研究進展Tab.2 Research progress of microorganisms in PET degradation

圖3 微生物降解PET過程Fig.3 Process of microbial PET degradation

3 雙向改造

塑料工業(yè)應用的目的是讓降解最大化、污染最小化，雙向改造基于工業(yè)應用的思想，對可塑性降解酶和可降解塑料進行同步改造，以期獲得高效產品。在雙向改造過程中，不僅可以從酶制劑自身出發(fā)對自身進行改造和設計，還可以在保證塑料產品適用性的前提下，對其原材料進行綠色設計，從而達到工業(yè)應用的要求。

3.1 PET降解酶的改造升級

塑料降解酶因穩(wěn)定性差、催化效率低等原因限制了其規(guī)?；a與應用［75-77］，通過利用包括人工智能、同源模擬、液滴微流控在內的現(xiàn)代生物技術、半理性設計、隨機突變等來克服PET降解酶現(xiàn)存的這些弊端，也可應用多酶共固定化、級聯(lián)反應技術來提高產率，使其應用于規(guī)?；a。

3.1.1 PET降解酶的傳統(tǒng)改良方法

利用基因隨機突變和重組方法對酶進行定向進化，然后與酶理性修飾方法相結合，通過各種組合選擇出適合的方法來避免定向進化和理性設計的限制，液滴微流控的技術手段極大提高了隨機突變篩選效率；全細胞催化、金屬離子的存在、共固定化以及多酶級聯(lián)反應［78］等方面在提高PET降解酶活性也有積極作用。

杜文斌等開發(fā)了一種熒光液滴分選（FADS）管道，可用于對PET降解微生物或酶的高通量篩選，也可廣泛用于發(fā)現(xiàn)新的PET降解微生物和各種環(huán)境中的酶以及定向進化［79］。通過利用定點誘變對嗜熱細菌T.fusca來源的角質酶基因進行基因修飾，獲得的雙重突變體G132A/T101A改善了酶的疏水性和底物結合位點，使得突變體催化PET的活性大大提高［80］。對Fusarium solanipisi來源的角質酶（FsC）進行基因改造時，利用丙氨酸替代活性中心位點附近的氨基酸殘基，擴大了底物結合口袋，突變體FsC-L81A對PET的水解活性提高了5倍［81］。王澤方等把PETase導入到畢赤酵母中進行表達，再分泌到細胞表面進行全細胞催化，發(fā)現(xiàn)PETase的催化效率是游離酶的36倍，且pH和熱穩(wěn)定性都有顯著提高［82］。Carniel等［83］發(fā)現(xiàn)南極假絲酵母脂肪酶（CALB）和角質酶（HiC）共同存在情況下會促進PET水解，雙酶級聯(lián)反應會加速PET的水解生成TPA。

金屬離子的添加會影響酶的熱穩(wěn)定性，盡管在α-淀粉酶中已經(jīng)探索了Ca2+誘導酶的熱穩(wěn)定性和活性，但對降解PET角質酶的機制仍然知之甚少。Miyakawa等［84］首次發(fā)現(xiàn)了降解PET角質酶中Ca2+對于酶結構穩(wěn)定性和活性的影響，并對S.viridisAHK190來源的角質酶突變體Cut190-S226P進行研究，研究了Ca2+結合以及自由態(tài)下的突變體結構，并發(fā)現(xiàn)了該突變體較好的熱穩(wěn)定性。Sulaiman等［48］也發(fā)現(xiàn)了在添加了Ca2+和Mg2+后，這些角質酶的活性和熱穩(wěn)定性增加。向聚酯水解酶TfH、BTA2、Tfu_0882、Tf_Cut1和Tf_Cut2添 加Ca2+、Mg2+時，這些聚酯水解酶的熔點溫度提高了10.8～14.1℃［85］。在Clostridium botulinum來 源 的 酯 酶（Cbotu_EstA）中發(fā)現(xiàn)了與Zn2+結合相關的結構域，并發(fā)現(xiàn)該結構域附近的殘基突變不會改變鋅的結合能力，如突變體Cbotu_EstA-S199A不僅沒有改變鋅的結合能力，反而催化活性提高了7倍［86］。科研人員分析了不同的二價陽離子（Zn2+、Mn2+和Mg2+）對聚酯水解酶Cut190與Ca2+相比的活性和熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+可以很容易地取代Ca2+，但Cut190在Zn2+存在下的酶活性非常低［87］。除金屬離子外，磷酸根離子也可以提高PET降解酶的熱穩(wěn)定性［40］。

3.1.2基于PET降解酶結構的改造

在所有對酶修飾的措施中，從酶結構解析基礎上進行改造以提高其活性的研究較為普遍；Austin等［88］將PETase的結構與T.fusca來源的角質酶結構進行比對，發(fā)現(xiàn)PETase結合位點附近存在多個裂隙，會影響底物與酶的結合，將PETase兩個活性位點殘基突變?yōu)榻琴|酶中保守的結合裂縫氨基酸殘基，縮小了PETase結合位點的裂隙大小，從而改善了PET的降解［圖4（a）］。Son等［89］基于結構生物信息學對I.sakaiensis來源的IsPETase進行蛋白質工程改造，通過使用分子對接把IsPETase與4種PETase進行比對，獲得使Loop環(huán)結構更穩(wěn)定的三重突變體S121E/D186H/R280A，該酶的熔點溫度提高了8.81℃，PET降解活性在40℃下提高了14倍；他們繼續(xù)對IsPETase結構進行優(yōu)化，獲得四重突變體S121E/D186H/S242T/N246D，該突變體較野生型相比底物結合位點得到了優(yōu)化，在37℃下，突變體的活性比野生型提高58倍［90］。Maurer等［91］從T.cellulosilytica來源的角質酶（Thc_Cut1）結構出發(fā)進行改造，拓展了Thc_Cut1的底物譜，使得該酶可以解聚人工尼龍和聚酰胺。

圖4 PET降解酶基于結構的改造Fig.4 Structure-based modification of PET degrading enzyme

通過對結構進行改造是提高酶熱穩(wěn)定性的一種方法。Nakamura等［92］利用同源模擬工具對PET降解酶PET2的結構進行比對，最終發(fā)現(xiàn)對表面電荷進行修飾突變成帶正電荷的氨基酸、添加二硫鍵以及提高骨架穩(wěn)定性，可以使PET2 7M（7重突變體）的熔點溫度從69℃提高到75.7℃［圖4（b）］。Marty等使用分子對接和酶表面分析來研究底物結合模式，最后發(fā)現(xiàn)把二硫鍵加入LCC中去取締金屬離子結合位點附近的氨基酸殘基，使得LCC的熔點溫度提高了9.8℃［93］。將二硫鍵引入到聚酯水解酶Tf_Cut2催化位點附近，Tf_Cut2的熔點溫度提高了25℃，半失活溫度提高了17℃，并且在70℃處理48 h，該酶的催化效率較原來提高了1倍［94］。在PET降解酶中引入疏水蛋白來改變酶的結構以及酶與底物的結合能力已經(jīng)被廣泛應用于這類研究中。Ribitsch等［95］把水解PET的角質酶與疏水蛋白融合來改變活性中心的構象，疏水蛋白是一種可以改變表面物理化學性質的小真菌蛋白，可以顯著提高角質酶對PET的水解水平，說明偶聯(lián)疏水蛋白或者兩性分子可以提高酶分子疏水性。孫巖等對PETase進行了廣泛的分子模擬來分析酶的結構轉化和酶與底物的相互作用，把活性位點附近的殘基突變成谷氨酸和賴氨酸，會改變酶的表面電荷分配，使得其活性位點附近的疏水性增大，從而提高了底物與酶的結合效率［96］。劉兵等［97］將PETase的結構與F.solani來源的角質酶進行催化三聯(lián)體位點結構的比對分析，發(fā)現(xiàn)BHET對PETase的催化三聯(lián)體存在明顯競爭，利用PETase與BHET的分子對接證實了以上觀點，提供了PETase改造的理論研究基礎。Ren等［98］通過利用分子模擬工具比對T.fuscaKW3來源的Tf_Cut2和LCC結構，把第62位的氨基酸換成LCC對應的氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)Tf_Cut2-G62A與對苯二甲酸單酯（MHET）結合效率大大降低，水解PET的活性提高了2.7倍；因為PET降解酶除了會與PET結合外，該類酶的水解產物BHET和MHET也會與PET競爭酶的活性中心，從而抑制PET降解。郭瑞庭團隊［60］解析了一種來自PET消耗型微生物I.sakaiensis的新型PETase以及與底物和產物類似物復合體的結構。通過結構分析，誘變和活性測量，提出了底物結合模式，并闡明了對催化至關重要的特征，為PETase在塑料生物轉化中的進一步工程設計和應用提供指導。

3.1.3 PET降解酶的人工智能設計

近年來，大數(shù)據(jù)時代人工智能的發(fā)展，很大程度上減少了實驗重復操作的工作量，并且比傳統(tǒng)的方法更加高效、準確；計算機穩(wěn)定性設計方法在過去的20年里從選擇性地解決邊際穩(wěn)定性的某些方面的方法開始，發(fā)展到現(xiàn)在更加全面，人工智能設計通過將系統(tǒng)發(fā)育分析與原子設計相結合，在保持蛋白質主要分子活性的同時，溶解性、熱穩(wěn)定性和抗聚集性也有了顯著改善［99］。

盡管在氨基酸序列的從頭設計方面取得了重大突破，但當前的計算機蛋白質設計仍存在明顯的局限性，為了克服這些短板，需要計算模型來補充當前的模型和實驗工具來為理論提供廣泛的反饋。劉海燕等開發(fā)了一種用于蛋白質設計的神經(jīng)網(wǎng)絡能量函數(shù)模型，補充和完善了已有模型的缺點［100］。Guerois等［101］開發(fā)了一種計算機算法——FOLDEF，可以快速定量估計蛋白質和蛋白質復合物穩(wěn)定性的相互作用，該能量函數(shù)使用最少的計算資源，因此可以很容易地用于蛋白質設計算法以及蛋白質結構和折疊途徑預測領域。Meng等開發(fā)了一種新的突變設計工具——Premuse，用來整合基于自然序列進化的首選突變序列比對和定量選擇，使用Premue對I.sakaiensis201-F6來源的IsPETase進行計算，最后從1486個同源序列中篩選出雙點突變體W159H/F229Y，在40℃下，PET的降解活性增加了近40倍［102］。崔穎璐等［103］設計了一個蛋白質工程的貪婪累積策略——GRAPE，利用聚類算法和貪婪算法優(yōu)點，大幅規(guī)避了不同突變位點間的負協(xié)同作用，短時間內最大限度地探索序列空間疊加路徑，提高了來自I.sakaiensis的PETase的熱穩(wěn)定性，通過聚類分析結合計算得出有益突變的貪婪積累，重新設計出一種變體DuraPETase，該突變體的表觀熔融溫度較野生型提高31℃，可以在溫和條件下將2 g/L微塑料完全生物降解為水溶性產物。Marty團隊利用計算機輔助酶工程技術，對PET水解酶LCC重新設計，實現(xiàn)了在不到10 h的時間內將酶催化的PET解聚，提高了90%的轉化率［93］。Knott等［104］從對苯二甲酸單酯水解酶（MHETase）的結構、生化和生物信息學的方法出發(fā)，利用計算機分析MHETase與PETase的協(xié)同作用，研究了該酶體系對PET的催化級聯(lián)反應，發(fā)現(xiàn)雙酶體系下的水解效率比只有PETase存在情況下提高了3倍，這給雙酶PET降解系統(tǒng)提高了研究方向?？蒲腥藛T通過動力學模擬和分子分層計算方法（ONIOM）分析了MHETase的催化機制，利用高理論水平和廣泛抽樣的結合生成了穩(wěn)健的計算預測，這些信息可以更詳細了解MHETase催化功能以及開發(fā)更高活性的突變體［105］。

智能計算已經(jīng)發(fā)展到以原子級精度進行從頭設計各種結構的地步，迄今為止，幾乎所有的蛋白質工程都涉及對天然蛋白質的修飾［106］（圖5）。一系列的計算設計模型在實驗中展現(xiàn)出極大利好，在蛋白質改造領域擁有廣闊前景。

圖5 智能計算策略Fig.5 Schematic diagram of smart-computing strategy

3.2 PET原材料的綠色設計

塑料制品因耐用而被廣泛使用，但自身降解也變成極大的挑戰(zhàn)，絕大多數(shù)塑料即使被降解后也逃離不了被填埋的命運，號稱可“生物降解”塑料最后也和普通塑料一樣降解不徹底，最后也被填埋進入生態(tài)環(huán)境，給人類健康帶來隱患。Xu等為了制造出真正可降解、不留隱患的塑料，所以直接將能降解塑料的聚酯酶作為原料，添加到塑料生產的過程中，將數(shù)十億個被包裹起來的酶與塑料樹脂珠進行混合，用于塑料生產，只要加上水和熱量，這些酶就會發(fā)揮功效降解塑料，說明通過使用具有活性位點暴露在表面的酶來設計酶-保護劑-聚合物的復合物是可行的［107］。利用這一技術所生產出的新型塑料，98%可降解成小分子，且不會產生微塑料等對環(huán)境有害的物質。通過把合成PET的石油基原材料TPA、EG等轉變成生物質來源的原料，最后合成生物PET（Bio-PET），不僅減少了對原始PET的依賴，也提高了Bio-PET降解率。目前已知的途徑都不能利用中間體直接生產TPA，但是有科學家提出莽草酸途徑可用于生產對甲苯甲酸，隨后將其轉化為TPA［108］。更加可持續(xù)、環(huán)保的原材料木質素可以作為原料，利用生物乙醇途徑生產Bio-PET的原材料［109］。Lee等［110］還發(fā)現(xiàn)利用對二甲苯可實現(xiàn)TPA的生物合成。EG占Bio-PET聚合物重量的30%，很多科學家利用微生物從可再生植物原料中獲得了EG［111］；和TPA一樣，EG也能利用生物質直接獲得，可以通過纖維素脫水、木糖醇氫解和廢棄秸稈加氫而形成［112］?？蒲腥藛T利用塑料薄膜A（30%淀粉、70%塑料和添加劑）和塑料薄膜B（95%以上塑料、少量添加劑）作為底物研究黃粉蟲（yellow meal worms）對改良塑料的降解，發(fā)現(xiàn)A類塑料在25 d內被完全降解［113］；Ganesan等應用酶嵌入聚合物的表面澆注方法，把南極念珠菌脂肪酶包埋在塑料薄膜中，嵌入了2%～8%重量脂肪酶的聚己內酯（PCL）塑料薄膜，隨著脂肪酶含量和孵育天數(shù)的增加，塑料薄膜的失重增加［114］。通過將薄膜分割成更小的碎片，加速嵌入酶降解的速度，這可作為微塑料生物降解的模型實驗，具有特定嵌入酶和包埋法生產的各種可生物降解塑料將有助于解決全球環(huán)境問題，這些方法也可以為PET的綠色設計所借鑒。

4 前景與展望

近年來，科研人員發(fā)現(xiàn)了許多可降解PET的酶和微生物，在PET的酶法降解與催化機制方面取得了重大進展［115-117］，合成生物學和蛋白質工程的快速發(fā)展為發(fā)現(xiàn)、表征和修飾PET降解酶提供了一系列強大的工具，包括Toulouse White Biotechnology（TWB）在內的多家公司已經(jīng)具備完整的PET降解工業(yè)鏈。盡管降解技術和資源發(fā)展迅猛，但聚酯水解酶對PET的有效水解仍然為生物催化PET廢物回收技術的進一步發(fā)展提出了許多挑戰(zhàn)，現(xiàn)存許多問題還有待突破：PET水解酶只能水解非晶體部分，而對于晶體部分的水解效率極低，所以還無法降解高結晶度的產品；從PET塑料到高附加值產品高效轉化的代謝路徑還有待構建，另外還有一系列問題需進一步解決。

（1）開發(fā)新型PET聚酯水解酶篩選方法：目前基于瓊脂平板的篩選方法靈敏度和通量相對較低，所以需要開發(fā)高效的高通量篩選方法來更高效和準確地識別新的塑料降解酶，如液滴微流控的分選手段極大推動了新酶挖掘和突變體的篩選，這一技術手段的更新將有望從源頭上解決高晶體產品的降解工作；人工智能在挖掘微生物和酶方面也有很大潛能，以Python爬蟲為代表，目前，該應用主要集中在公眾熱點問題的分析中，但這一技術的優(yōu)點使得Python網(wǎng)絡爬蟲在文獻分析中顯現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。這一技術手段無疑將為塑料降解微生物及新酶基因篩選與挖掘提供重要的參考價值。

（2）PET聚酯水解酶結構-功能關系解析：因為對塑料降解酶的結構與功能的理解相對缺乏，所以現(xiàn)在的很多合理的設計方法都是經(jīng)驗性的，精確預測突變位點還很困難，計算機輔助模擬和人工智能的發(fā)展可能會對酶結構-功能關系的認識不斷增加，有望以更具預測性和精確性的方式指導PET聚酯水解酶的改造工作。

（3）多酶催化/全細胞催化體系構建：PET在被降解過程中會產生BHET和MHET等中間產物，會與PET競爭酶的底物結合位點，影響酶的降解效率，發(fā)展多酶級聯(lián)反應和共固定化技術不僅可以做到高效降解，還可以在酶的循環(huán)利用方面取得重大突破；全細胞體系的構建可以很大程度上提高降解酶的pH和穩(wěn)定性，尋找合適的宿主微生物在應對工業(yè)塑料降解環(huán)境中發(fā)揮高效降解將有很大前景。

（4）構建高附加值產品轉化代謝路徑：因為塑料結構復雜和解聚條件差異性等原因導致解聚產物眾多從而產生二次污染，現(xiàn)有技術還不能做到PET綠色回收，建立高附加值產品轉化代謝路徑不僅可以做到保護生態(tài)環(huán)境，而且能帶動經(jīng)濟循環(huán)發(fā)展，通過定向挖掘可以利用解聚產物的微生物，如何應用合成生物學構建合適的代謝路徑，將有望做到真正的零污染、高回收。

（5）可降解塑料的研發(fā)創(chuàng)新：現(xiàn)行塑料降解條件苛刻、降解過程復雜等諸多因素影響降解效果，尤其是對于高結晶度的產品，在不改變實用性的前提下，尋找合適的方式向塑料中添加碳源等添加劑、基于仿生思想設計新型可降解塑料在此后的塑料降解研究中也可作為一個探索方向。

（6）其他方面的創(chuàng)新突破：目前PET降解酶可在大腸桿菌、畢赤酵母等宿主中進行可溶性表達，但是PETase等水解酶異源表達水平還較低，利用現(xiàn)代生物技術克服異源表達中蛋白質之間的相互作用有望突破這一瓶頸；利用傳統(tǒng)的物理化學誘變手段來篩選具有特殊功能的塑料降解菌也是一個研究方向；此外，可以開發(fā)對PET的預處理方式來改善提高降解效率。