類彈性蛋白多肽的生物合成及其藥物遞送應(yīng)用

楊兆穎，張帆，郭建文，高衛(wèi)平

（1北京大學(xué)跨學(xué)部生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100191；2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191）

好的藥物遞送系統(tǒng)有助于提高藥物療效，擴(kuò)展藥物的應(yīng)用范圍。醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展依賴于藥物遞送技術(shù)的進(jìn)步。通過合適的藥物遞送策略可以增強(qiáng)藥物吸收，提高藥物的生物利用率；控制藥物釋放，延長治療周期并降低毒副作用；制作靶向藥物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療［1］。藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展依賴于藥物遞送材料的廣泛開發(fā)，類彈性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）作為一種新興的藥物遞送材料是目前的研究熱點(diǎn)之一。

彈性蛋白（elastin）是結(jié)締組織中常見的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要為動(dòng)脈、韌帶、肺和皮膚等組織提供彈性［2］。受彈性蛋白啟發(fā)，Urry實(shí)驗(yàn)室［3］合成了ELP序列，它衍生于彈性蛋白的疏水區(qū)，主要由五肽重復(fù)單元（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG）串聯(lián)而成［4］，其中，Xaa是除脯氨酸外的任意氨基酸。由于不同的氨基酸具備不同的結(jié)構(gòu)與功能，ELP可隨Xaa的改變表現(xiàn)出不同的生物功能。ELP通過基因工程技術(shù)制備，它的分子量、組成、分散性完全精確可控，并可通過DNA重組技術(shù)在其序列中添加反應(yīng)性氨基酸或多肽，能夠依據(jù)藥物特性來進(jìn)行功能化定制。ELP還具有特殊的溫度響應(yīng)性，ELP會(huì)隨溫度的變化表現(xiàn)出可逆相轉(zhuǎn)變（phase transition）行為，當(dāng)溫度低于其相轉(zhuǎn)變溫度（transition temperature，Tt）時(shí)，ELP呈可溶狀態(tài)，當(dāng)溫度高于其Tt時(shí)，ELP呈不溶的聚集狀態(tài)［5］，可以通過改變ELP中的Xaa和五肽序列重復(fù)數(shù)目來控制其Tt［6］，并且，當(dāng)ELP與其他小分子藥物或多肽偶聯(lián)時(shí)，該特性可以充分保留。基于ELP的特性，ELP可被用來延長藥物半衰期、改善藥物溶解性、進(jìn)行腫瘤的靶向治療、藥物的局部遞送以及藥物在體內(nèi)的緩釋等。同時(shí)，由于ELP來源于天然彈性蛋白，其序列無毒、無免疫原性、可降解、具有良好的生物相容性［7］，使ELP成為遞送小分子藥物或蛋白藥物的理想材料［8］。

本文聚焦ELP，介紹了ELP的構(gòu)建方法、ELP與ELP融合蛋白提純方法，歸納了ELP在藥物遞送中的設(shè)計(jì)思路和遞送策略，并列舉了其中一些較有代表性的一些工作，最后，本文總結(jié)了ELP的優(yōu)勢并提出了展望。

1 ELP的構(gòu)建

早期的ELP合成使用混合酸酐法［9］，但是該方法往往受限于ELP的重復(fù)單元數(shù)目，并且在合成工程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，目前已逐步被異源表達(dá)方法取代。1992年，Urry實(shí)驗(yàn)室［3］首次通過大腸桿菌表達(dá)獲得了ELP(V)20，但是該方法需要通過單酶切的方式向載體內(nèi)插入ELP(V)10基因，而單酶切存在基因序列反向插入以及載體環(huán)化等缺點(diǎn)，因此合成含有較多重復(fù)序列的ELP是該領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。為解決這一問題，Urry實(shí)驗(yàn)室［10-11］通過串聯(lián)連接反應(yīng)（concatenation ligation reaction）構(gòu)建了ELP(V)121，并借助大腸桿菌系統(tǒng)成功表達(dá)。該反應(yīng)耗時(shí)較短，ELP單體基因可通過重疊的黏性末端連接，最終形成含有多個(gè)重復(fù)序列的基因。但該反應(yīng)過程并不能精確控制ELP的長度，易形成不同長度的DNA寡聚物，后續(xù)需要使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)多個(gè)片段進(jìn)行分離，極大降低了成功率。

2002年，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［12］開發(fā)了定向遞歸連接（recursive directional ligation，RDL）技術(shù)，通過多步單酶切將ELP單體基因或寡聚基因插入線性化載體中，從而精確合成具有特定序列長度的ELP［圖1（a）］。除此之外，由于該方法的模塊化特征，可實(shí)現(xiàn)ELP與其他蛋白質(zhì)的融合，且融合順序可自由定義。然而單酶切反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致ELP片段反向插入、多個(gè)插入以及載體的自連接等問題，影響連接效率。為了解決以上問題，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［13］在RDL的基礎(chǔ)上，引入了第2個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)展了通過質(zhì)粒重建的定向遞歸連接（recursive directional ligation by plasmid reconstruction，PRe-RDL）［圖1（b）］。該方法有效克服了RDL帶來的問題，已經(jīng)成為構(gòu)建ELP最常用的手段。

圖1 ELP構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic of ELP construction

與此同時(shí)，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［14］還開發(fā)了另一種快速、高通量且一步即可完成的用于合成ELP基因的方法，即重疊延伸滾環(huán)擴(kuò)增（overlap extension rolling circle amplification，OERCA）。該方法使用環(huán)狀ssDNA為模板，構(gòu)建大量不同長度的線性ssDNA，并以此為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)一步延長基因長度。OERCA是一種強(qiáng)大的方法，可用于構(gòu)建不同序列長度的ELP文庫。但是該方法僅限于合成序列組成較簡單的ELP，不能合成序列復(fù)雜的ELP（如能形成自組裝體的二嵌段ELP）。

2016年Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［15］提出一種新方法，該方法利用密碼子的簡并性，通過密碼子加擾算法優(yōu)化ELP中基因，使用基因特異性引物用于PCR擴(kuò)增，減少聚合酶反應(yīng)過程中重復(fù)編碼序列交叉雜交或者脫靶反應(yīng)的發(fā)生。該方法極大解決了高度重復(fù)編碼序列的合成問題，將成為一種新的構(gòu)建ELP的方法。

研究者可以根據(jù)所設(shè)計(jì)的ELP序列及現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件選擇合適自己的合成方案。在合成序列簡單的ELP時(shí)，可選用OERCA法［14］，這種方法的實(shí)驗(yàn)周期短，可以幫助研究者更快拿到目的序列。在設(shè)計(jì)合成全新、相對(duì)復(fù)雜的ELP序列時(shí)，可用Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［15］提供的算法優(yōu)化密碼子后進(jìn)行基因序列合成，這種方法可以精準(zhǔn)定制ELP的序列，但基因合成時(shí)間和資金成本相對(duì)高。利用PRe-RDL法［13］，研究者可以利用實(shí)驗(yàn)室已有的ELP序列，得到不同組合、不同長度的ELP序列，也可以合成并引入新的ELP序列，但對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的ELP，需要的反應(yīng)次數(shù)較多。

2 ELP的溫度響應(yīng)性及其影響因素

ELP具有特殊的溫度響應(yīng)性，溫度升高后ELP的有序程度增加，這一過程與溫度升高時(shí)物質(zhì)混亂程度增加的情況相反，因此被稱作逆溫度相轉(zhuǎn)變（inverse temperature transition）［16］。ELP在Tt溫度以下呈可溶狀態(tài)；在Tt溫度以上呈不溶的聚集狀態(tài)，并且這種相變是可逆的。

影響ELPTt的因素分為兩類：一類是ELP本身的特性，包括ELP的濃度、氨基酸組成、側(cè)鏈的修飾情況（如離子化、氧化還原、磷酸化、光化學(xué)反應(yīng)等）；另一類是外在條件，包括溶劑環(huán)境中的鹽離子、有機(jī)溶劑和外界壓力等［17］。Urry實(shí)驗(yàn)室［18］量化了Xaa對(duì)ELPTt的影響，并稱之為“ΔTt效應(yīng)”（ΔTteffect）。簡言之，就是引入帶有親水性側(cè)鏈的氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和賴氨酸）會(huì)提高ELP的Tt，而引入帶有疏水性側(cè)鏈的氨基酸會(huì)降低ELP的Tt。當(dāng)Xaa為可電離的氨基酸（如谷氨酸和組氨酸）時(shí)，由于這類氨基酸會(huì)隨溶液pH變化發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，ELP的相變行為會(huì)受溶液pH的影響。Xaa帶電荷時(shí)ELP的Tt會(huì)升高，不攜帶電荷時(shí)ELP的Tt降低。研究者可以參考上述結(jié)論，進(jìn)行ELP序列設(shè)計(jì)或調(diào)整，更有效地將其應(yīng)用于藥物遞送或其他領(lǐng)域。

3 ELP的純化

ELP特有的溫度響應(yīng)性為ELP的純化提供了方便。1995年，Urry實(shí)驗(yàn)室［11］通過大腸桿菌成功表達(dá)ELP之后，首次利用ELP的溫度響應(yīng)性對(duì)其進(jìn)行了提純，發(fā)現(xiàn)一輪的相變反應(yīng)即可得到純度＞95%的ELP。隨后，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［19-20］利用該原理開發(fā)了一種用于純化帶有ELP標(biāo)簽的可溶性融合蛋白的方法，并將其命名為逆相轉(zhuǎn)變循環(huán)（inverse transition cycling，ITC）。如圖2所示，ITC包括3個(gè)主要步驟：第一，裂解已表達(dá)ELP的細(xì)胞，在低于Tt的溫度下離心以除去細(xì)胞碎片；第二，收集含有可溶性ELP的上清液并通過升溫和加鹽使ELP發(fā)生相變、聚集，離心并收集含有ELP的沉淀組分；第三，用預(yù)冷的緩沖液溶解包含ELP的沉淀組分，然后在低于Tt的溫度下離心以去除不溶性雜蛋白，剩余溶液組分即為純化的ELP組分。相比于色譜柱純化，ITC具有純化方式簡單、成本低廉、易于大規(guī)模放大等優(yōu)勢，目前該ELP標(biāo)簽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種重組蛋白的表達(dá)和提純［20-21］。

圖2 逆相轉(zhuǎn)變循環(huán)（ITC）純化ELP與ELP融合蛋白示意圖Fig.2 Purification of elastin-like polypeptides(ELPs)and ELP fusions by inverse transition cycling

4 ELP在藥物遞送方面的應(yīng)用

4.1 ELP分子用于延長藥物體內(nèi)循環(huán)半衰期

小分子類藥物分子量小，在體內(nèi)很快就被代謝清除，需要高頻給藥才能達(dá)到治療效果，這就伴隨了劑量相關(guān)的藥物毒副作用。同時(shí)，疏水類小分子藥物還由于其較差的溶解度，難以達(dá)到需要的給藥劑量而大大限制了其應(yīng)用［22］。雖相較于小分子藥物，蛋白藥物特異性強(qiáng)、活性高、副作用小，但是蛋白藥物也面臨著理化性質(zhì)不穩(wěn)定、易被蛋白酶水解、循環(huán)半衰期短、免疫原性等問題［23-24］。目前，常用聚乙二醇［poly（ethylene glycol），PEG］修飾方法來增大藥物的分子體積，減少腎小球的濾過作用，延長藥物的體內(nèi)循環(huán)半衰期［25］。但PEG化修飾也存在局限性，比如PEG無法在體內(nèi)降解，而ELP作為一種以氨基酸為基元的生物大分子，能生物降解成身體所需的氨基酸，ELP可以作為一個(gè)不錯(cuò)的生物材料用來改善藥物特性，延長藥物半衰期，降低藥物副作用。

4.1.1 ELP分子延長小分子藥物體內(nèi)半衰期

ELP的序列精確可控，通過基因工程設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)反應(yīng)性殘基，可實(shí)現(xiàn)ELP與小分子藥物的共價(jià)偶聯(lián)。阿霉素（DOX）是一種用于治療腫瘤的化療藥物，屬于小分子藥物，DOX頻繁的給藥會(huì)伴有嚴(yán)重的心臟毒性和胃腸道毒性［26］，限制了其臨床應(yīng)用。有研究使用ELP序列中的賴氨酸［27］和半胱氨酸［28-29］殘基作為獨(dú)特反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行了ELP與DOX的偶聯(lián)。并且，研究者通過在ELP與DOX之間引入的可斷裂的連接子，如酸敏性的腙鍵［27］或組織蛋白酶可切割的GFLG肽［29］等，使得ELP藥物偶聯(lián)物被細(xì)胞攝取后，在酸性、富含酶的核內(nèi)體和溶酶體中釋放出游離的藥物［圖3（a）］。在此基礎(chǔ)上，通過基因工程連接靶向肽或細(xì)胞表面受體的配體到ELP藥物偶聯(lián)物上，可進(jìn)一步將藥物靶向呈遞到病理組織而增強(qiáng)藥物的特異性［圖3（b）］。Moktan等［30］將ELP的C端的半胱氨酸殘基與DOX的前體藥物的腙鍵共價(jià)偶聯(lián)，然后用細(xì)胞穿透肽SynB1修飾ELP的N端以增強(qiáng)腫瘤內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的攝?。?1-33］，這種共價(jià)偶聯(lián)修飾提高了DOX的循環(huán)半衰期，使偶聯(lián)藥物的半衰期達(dá)到了游離DOX的10倍。SynB1-ELP-DOX偶聯(lián)物不僅能逃避腎臟清除，還通過增強(qiáng)的通透性和滯留效應(yīng)（EPR，enhanced permeability and retention effect）滲入和富集在腫瘤組織附近，表現(xiàn)出明顯優(yōu)于DOX的抗腫瘤功效。

圖3 ELP用于延長藥物體內(nèi)循環(huán)半衰期（a）ELP與小分子藥物共價(jià)偶聯(lián)，并可由連接子處斷裂釋放出游離藥物；（b）小分子藥物與帶有靶向序列的ELP偶聯(lián)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取；（c）通過基因工程合成ELP融合蛋白的示意圖；（d）NtTNF-VHHELP靜脈注射到小鼠后物的藥代謝動(dòng)力學(xué)圖［43］；（e，f）靜脈注射IFN-ELP與IFN的藥代謝動(dòng)力學(xué)（e）和腫瘤抑制情況（f）［44］Fig.3 ELPs applications in extending half-life of drugs(a)Chemically conjugated ELP to small molecule drugs by inclusion of an intervening cleavable linker which releases the free drug intracellularly after endocytic uptake and accumulation in the acidic,enzyme-rich environment of endosomes and lysosomes;(b)Enhanced cellular uptake of ELP conjugates by functionalization of ELP with cell-penetrating peptides;(c)Schematic of ELP genetically fused to peptide and protein drugs;(d)Pharmacokinetics of NtTNF-VHHELP[43];(e,f)Pharmacometabolic kinetics(e)and in vivo antitumor effificacy(f)after intravenous injections with IFNα-ELP and IFNα[44]

4.1.2 ELP分子延長蛋白藥物體內(nèi)半衰期

ELP融合蛋白可以通過基因工程技術(shù)直接獲得，無需其他額外的反應(yīng)步驟，運(yùn)用這種方法來改善蛋白藥物特性非常簡單方便，并且已在多種蛋白類藥物上獲得了成功。腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）是一種促炎癥細(xì)胞因子，參與多種慢性和急性炎癥疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、克羅恩病［34-36］。TNF由活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞表達(dá)［37-39］。人源化TNF可以與細(xì)胞表面TNF受體1（TNFR1，p55）或TNF受體2（TNFR2，p75）結(jié)合，從而介導(dǎo)下游細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［40］。TNF抗體可以中和人源和鼠源TNF，從而抑制TNF與受體的結(jié)合［41-42］。TNF抗體的血清半衰期較短（約為28 min）［43］，為了延長TNF抗體在體內(nèi)作用時(shí)間，Conrad等［43］將腫瘤壞死因子的抗體重鏈與ELP融合，合成融合蛋白NtTNF-VHHELP。研究人員發(fā)現(xiàn)，由于融合蛋白的分子量較大，不會(huì)被腎小球?yàn)V出，因此，NtTNF-VHHELP的體內(nèi)循環(huán)半衰期比未融合ELP的TNF的抗體顯著延長［圖3（d）］，并且可以在小鼠體內(nèi)有效預(yù)防人源化TNF引起的敗血性休克。

干擾素（IFN）是一種可廣譜性抗病毒、抗細(xì)胞增殖并具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，在臨床上被廣泛用來治療病毒性疾病和癌癥，但I(xiàn)FN半衰期短，穩(wěn)定性差，頻繁給藥會(huì)造成嚴(yán)重的副作用，給病人帶來很大的痛苦。Gao實(shí)驗(yàn)室［44］通過基因工程技術(shù)將IFN與ELP融合，精準(zhǔn)合成了IFN-ELP偶聯(lián)物，并將此方法命名為ELP fusion［圖3（c）］。ELP fusion方法的合成率高，且所合成的IFN-ELP結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)可控。IFN-ELP不僅可以很好地保留IFN的生物活性（41%），而且顯著提高了IFN的體內(nèi)循 環(huán) 半 衰 期（8.6 h），IFN-ELP是IFN半 衰 期（0.3 h）的27.7倍［圖3（e）］，并表現(xiàn)出明顯優(yōu)于IFN的抗腫瘤功效［圖3（f）］。此外，還有許多其他蛋白類藥物同樣存在穩(wěn)定性差與半衰期短的問題，基于Gao建立的方法，研究者們可以很方便地運(yùn)用ELP來改善其藥物特性。

ELP具有特殊的溫度響應(yīng)性，并且可通過對(duì)ELP序列和長度的設(shè)計(jì)精準(zhǔn)調(diào)控其相變溫度。構(gòu)建藥物-ELP偶聯(lián)物，并將其相轉(zhuǎn)變溫度調(diào)控到生理溫度以下，使之經(jīng)注射后在注射部位發(fā)生相變，形成聚集體藥物儲(chǔ)庫，緩慢溶解并逐步釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)［圖4（a）、（b）］?？梢栽O(shè)計(jì)能形成儲(chǔ)庫型的藥物以緩釋的方式實(shí)現(xiàn)藥物的長效化或是用于藥物的局部遞送。

4.2.1 ELP儲(chǔ)庫應(yīng)用于藥物緩釋

胰高血糖素樣肽1（GLP-1）等肽類藥物已顯示出治療2型糖尿病的前景，但是它會(huì)被體內(nèi)的二肽基肽酶（DPPIV）降解而失去生物活性，藥物半衰期約2 min，需要頻繁給藥來維持治療效果，嚴(yán)重影響患者的依從性［45-46］。為了解決GLP-1藥物的這一缺點(diǎn)，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［47］將相變溫度低于體溫的ELP與胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）融合，構(gòu)建出經(jīng)皮下注射即可在原位形成儲(chǔ)庫的（GLP-1）-ELP偶聯(lián)物，并突變GLP-1中可被二肽基肽酶識(shí)別的氨基酸序列使其免于降解失活。雖然GLP-1仍可被中性內(nèi)肽酶識(shí)別降解［48］，但大分子量的ELP影響了酶對(duì)GLP-1切割位點(diǎn)的識(shí)別，使（GLP-1）-ELP有抵抗中性內(nèi)肽酶水解的效果，（GLP-1）-ELP在體內(nèi)的穩(wěn)定性優(yōu)于GLP-1，并且經(jīng)單次皮下注射后可持續(xù)5 d緩慢釋放GLP-1，延長了用藥周期，增加降血糖作用治療效果，減輕患者痛苦。

用于治療病毒性疾病和癌癥的干擾素也存在作用周期短的問題，為此Gao實(shí)驗(yàn)室［49］構(gòu)建了干擾素ELP融合蛋白IFN-ELP(V)，IFN-ELP(V)可在注射部位形成儲(chǔ)庫并緩釋進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，經(jīng)單次皮下給藥后，IFN-ELP(V)緩釋時(shí)間可達(dá)1個(gè)月之久［圖4（c）］。并且將IFN-ELP(V)應(yīng)用于腦腫瘤中最惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫化學(xué)治療時(shí)，治療效果良好［50］。雖然融合ELP標(biāo)簽后大幅延長了IFN在體內(nèi)的作用時(shí)間，但是同時(shí)也降低了IFN的活性。為此，Gao等對(duì)構(gòu)建的IFN-ELP(V)進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過基因工程技術(shù)在IFN與ELP中插入基質(zhì)金屬蛋白酶底物（matrix metalloproteinase substrate，MMPS），構(gòu)建了一種體溫和基質(zhì)金屬蛋白酶雙重響應(yīng)的IFN-ELP偶聯(lián)物［圖4（c）］［51］。高濃度IFN-MMPS-ELP(V)注入皮下后，展現(xiàn)出持續(xù)1個(gè)月的零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)［圖4（d）、（e）］，同時(shí)瘤內(nèi)高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶可以將IFN從ELP(V)上切割下來，在還原IFN活性的基礎(chǔ)上提高了其腫瘤組織滲透性，皮下一次給藥可消除37.5%小鼠的腫瘤［圖4（f）］，且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。

圖4 溫度響應(yīng)性ELP的局部緩釋（a，b）溫度響應(yīng)性藥物-ELP融合蛋白、藥物-ELP偶聯(lián)物在高于相變溫度后會(huì)發(fā)生相變，形成聚集體，經(jīng)皮下注射原位形成儲(chǔ)庫，并以單分子形式緩釋入血液循環(huán)系統(tǒng)；（c）藥物ELP偶聯(lián)物可以通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤，然后被MMP-2在腫瘤中分裂成游離的IFNα和ELP（V），從而增強(qiáng)腫瘤的穿透性和抗腫瘤療效［51］；（d）以MTD皮下注射Cy5標(biāo)記的IFNα-MMPS-ELP（V）、IFNα-MMPS-ELP（A）、IFNα-ELP（V）和IFNα后的小鼠活體熒光成像；（e，f）以MTD皮下注射IFNα-MMPS-ELP（V）、IFNα-MMPS-ELP（A）、IFNα-ELP（V）和IFNα的藥物代謝動(dòng)力學(xué)（e）和抗腫瘤治療效果（f）Fig.4 Depot-forming ELP for drug delivery(a,b)Drugs form a subcutaneous insoluble coacervate upon injection and slowly dissolve from their surface to their core,steadily releasing the therapeutic into circulation;(c)The drug ELP conjugates can get into a tumor through the EPR effect and then be cleaved into free IFNα and ELP(V)by MMP-2 in the tumor,resulting in enhanced tumor penetration and antitumor efficacy[51];(d)Fluorescence imaging of mice following MTD subcutaneous injection of Cy5-labeled IFNα-MMPS-ELP(V),IFN-MMPS-ELP(A),IFN-ELP(V),and IFNα;(e,f)pharmacokinetics(e)and antitumor efficacy(f)of mice after subcutaneous injections of IFNα-MMPS-ELP(V)、IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(V)and IFNα at their MTDs.

除了通過基因工程將藥用蛋白與ELP構(gòu)成融合蛋白外，還可以直接將藥用蛋白封裝進(jìn)ELP儲(chǔ)庫中，來實(shí)現(xiàn)藥用蛋白在儲(chǔ)庫中的緩慢釋放。白介素受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，它通過與白介素受體競爭性結(jié)合白介素，抑制白介素發(fā)揮促炎作用。但是由于IL-1Ra分子量較小，容易從關(guān)節(jié)間隙被清除，其半衰期僅為2～6 h［52］，需要頻繁給藥才能達(dá)到治療效果，這樣會(huì)增加病人的疼痛感，降低病人的依從性。為此，Kimmerling等［53］將IL-1Ra封裝進(jìn)交聯(lián)的ELP中，在低于相轉(zhuǎn)變溫度Tt時(shí)，ELP以可溶形式存在，而當(dāng)溫度升高至Tt以上后，ELP可以自發(fā)包裹小分子藥物［54-55］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在交聯(lián)ELP的作用下，IL-1Ra實(shí)現(xiàn)了5 d的持續(xù)釋放，并有效減少了關(guān)節(jié)軟骨變性和滑膜炎。

無論是直接構(gòu)建ELP融合蛋白，還是將蛋白封裝到ELP儲(chǔ)庫中均可以很好地實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋，本策略設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是要同時(shí)保留ELP的相變特性和蛋白的生物學(xué)活性。還可以進(jìn)行更加靈活的設(shè)計(jì)來進(jìn)一步優(yōu)化藥物的作用，比如，Gao實(shí)驗(yàn)室［51］在藥物與ELP間插入MMPS序列，在腫瘤中MMPS被切割并釋放出游離的藥物，進(jìn)一步提高了藥物活性。未來可以在已有工作基礎(chǔ)上加入更多的設(shè)計(jì)，賦予藥物更多的功能。

ELP還可以用于緩釋小分子藥物，如姜黃素。姜黃素來源于草藥姜黃根莖，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌活性［56-58］，但是姜黃素的水溶性差、體內(nèi)生物利用度低，導(dǎo)致它尚未被批準(zhǔn)為治療劑［56］。Sinclair等［59］通過化學(xué)修飾姜黃素，合成水溶性好的單官能的氨基甲酸酯，使其可以與ELP偶聯(lián)，最終合成了熱響應(yīng)性的ELP-curcumin偶聯(lián)物。在小鼠坐骨神經(jīng)近端肌肉注射該偶聯(lián)物，在小鼠體內(nèi)形成了儲(chǔ)庫，注射后4 d內(nèi)持續(xù)釋放姜黃素。Sinclair利用ELP不僅成功解決了小分子藥物姜黃素水溶性差的問題，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了藥物的緩釋。

4.2.2 ELP儲(chǔ)庫應(yīng)用藥物的局部遞送

還有一些藥物不適合全身用藥，因?yàn)槠渥饔玫椒前邢蚪M織器官時(shí)，會(huì)引起嚴(yán)重的副作用，例如 重 組 人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2），它屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），具有包括成骨作用在內(nèi)的多種功能，可用來治療骨損傷［60］。但rhBMP-2擴(kuò)散到其他部位會(huì)導(dǎo)致異位骨的形成及嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［61］，極大限制了rhBMP-2的應(yīng)用。針對(duì)這一問題，McCarthy等［62］利用ELP設(shè)計(jì)了一種儲(chǔ)庫型rhBMP-2融合蛋白：rhBMP-2-ELP（V40C2），實(shí) 現(xiàn) 了rhBMP-2的 局 部 遞 送。rhBMP-2-ELP（V40C2）同時(shí)保留了BMP-2的成骨潛能和ELP的相變特性，藥物經(jīng)注射后可在注射部位發(fā)生相變形成聚集體儲(chǔ)庫，從而限制其向非靶向組織部位的擴(kuò)散，能有效防止異位骨形成（圖5）。雖然rhBMP-2-ELP（V40C2）的生物活性僅在C2C12細(xì)胞中進(jìn)行了檢測，還需要進(jìn)一步建立動(dòng)物模型來驗(yàn)證其具體的治療效果和對(duì)副作用的降低程度，但這確實(shí)提供了一種利用ELP來進(jìn)行藥物局部遞送的思路，對(duì)于不適合全身給藥的藥物可以通過ELP的修飾進(jìn)行局部遞送，降低藥物副作用。

圖5 溫度響應(yīng)性ELP用于局部遞送（藥物注射后在原位形成儲(chǔ)庫，限制了向非靶向組織的擴(kuò)散）Fig.5 ELP applied to local delivery(Reservoirs were formed in situ after drug injection,reducing diffusion to non-targeted tissues.)

4.3 ELP用于腫瘤熱靶向治療

相轉(zhuǎn)變溫度略高于體溫的ELP（41℃左右）與藥用蛋白融合后，可以通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行局部加熱（41～45℃），利用ELP的相轉(zhuǎn)變過程實(shí)現(xiàn)藥用蛋白-ELP偶聯(lián)物在腫瘤處的富集（圖6）。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行局部加熱，這種方法也叫做高熱療法，可以增加腫瘤處的血管通透性，從而增強(qiáng)藥物向?qū)嶓w瘤的遞送［63］。有研究表明，當(dāng)高熱療法與化學(xué)療法或放療療法結(jié)合使用時(shí)，可以增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［64-65］。因此，將藥用蛋白-ELP偶聯(lián)物的熱靶向性質(zhì)和高熱療法結(jié)合，產(chǎn)生協(xié)同作用進(jìn)一步增強(qiáng)藥用蛋白的治療效果。

圖6 ELP用于腫瘤熱靶向治療示意圖（對(duì)腫瘤組織局部加熱，蛋白-ELP偶聯(lián)物在加熱部位相變、富集）Fig.6 Schematic of ELPs in thermal targeting(The tumor tissue was locally heated,and the protein-ELP conjugates were phase transformed and enriched at the heating site.)

Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［66］將熒光分子羅丹明標(biāo)記的ELP（V5G3A2）與42℃處理的人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人源咽鱗癌細(xì)胞FaDu分別孵育測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELP（V5G3A2）在Tt附近時(shí)入胞效率明顯增強(qiáng)。此外，他們還將羅丹明標(biāo)記的ELP（V5G3A2）經(jīng)靜脈注射進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)具有熱靶向效應(yīng)的ELP（V5G3A2）在加熱腫瘤處的富集提高了2倍［67］。通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱處理后ELP偶聯(lián)物確實(shí)會(huì)在靶向部位富集（如圖6所示），并有更好的入胞效率，理論上應(yīng)該會(huì)有更好的療效。在以上工作基礎(chǔ)上，Moktan等［30］構(gòu)建了DOX與ELP的偶聯(lián)物：ELP-DOX，在小鼠體內(nèi)注射ELP-DOX的同時(shí)進(jìn)行熱靶向治療，發(fā)現(xiàn)熱療增強(qiáng)了ELP-DOX的腫瘤抑制效果。這項(xiàng)工作進(jìn)一步在體內(nèi)模型中證明了熱靶向策略的治療效果，該策略特別適合于進(jìn)行局部腫瘤的治療，未來可以將本策略應(yīng)用于其他的小分子或蛋白類藥物中，強(qiáng)化藥物的療效和特異性。

4.4 ELP用于構(gòu)建納米顆粒

4.4.1 二嵌段ELP構(gòu)建納米顆粒

分子自組裝是指分子在非共價(jià)鍵的相互作用下自發(fā)形成一個(gè)穩(wěn)定的、具有一定規(guī)則幾何外觀的聚集體，其中，最簡單的是線性二嵌段共聚物。對(duì)于兩親性二嵌段共聚物，通常會(huì)自組裝形成球形膠束，該膠束由疏水嵌段構(gòu)成的內(nèi)核以及親水嵌段構(gòu)成的外表面組成［68-71］。ELP自組裝體是指由具有不同Tt的二嵌段ELP（ELPdiblock）融合，當(dāng)溶液溫度高于含有最低Tt的ELP嵌段時(shí)，此嵌段變?yōu)槭杷?，脫水坍塌并聚集形成膠束核，開始進(jìn)行自組裝，而另一ELP嵌段保持溶劑化并分散在溶劑中，形成膠束［圖7（a）］［72］。自組裝過程是可逆的，通過改變?nèi)芤簻囟?，可以控制聚合物的聚集。利用這種兩親性ELP自組裝體可以將藥物裝載到膠束核心中，通過組裝體遞送藥物可以很好地規(guī)避有些藥物血溶性不好的問題，更易達(dá)到治療所需劑量，藥物被包裹在組裝體內(nèi)，減少了藥物在體內(nèi)的清除和代謝，有利于提高藥物利用率，改善藥物的藥代。同時(shí)，組裝體還有更強(qiáng)的入胞能力，更有利于藥物進(jìn)入細(xì)胞充分快速地發(fā)揮藥物藥效。為了提高藥物的特異性可以進(jìn)一步在膠束表面偶聯(lián)配體或有靶向作用的蛋白，直接將藥物遞送到發(fā)揮作用的組織或器官，可進(jìn)一步減少藥物引起的副作用。

圖7 （a）二嵌段ELP的組裝示意圖，低于兩段ELP的Tt的溫度下，兩親性ELP是可溶的；在相對(duì)疏水的ELP（綠色，Tt 2）和相對(duì)親水的ELP（藍(lán)色，Tt 1）之間的溫度（T）下，疏水性ELP選擇性脫水，從而聚集形成致密的疏水核心；（b）親水和疏水比不同的二嵌段ELP形成組裝體的冷凍電鏡圖［70］；（c，d）靜脈注射IFNα-ELPdiblock，IFNα-ELP（A），PEGASYS和IFNα的藥物代謝動(dòng)力學(xué)圖（c），腫瘤生長抑制圖（d）［73］Fig.7(a)ELP micelles formed by diblock ELP,at a temperature between the Tt of the more hydrophobic ELP block(green,Tt 2)and the more hydrophilic ELP(blue,Tt1),the more hydrophobic block transitions and aggregates while the more hydrophilic block remains soluble,leading to self-assembly into micelles;(b)Cryo-TEM micrograph of ELP micelles[70];(c,d)Pharmacokinetics(c)and antitumor efficacy(d)after intravenous injections with IFNα-ELPdiblock,IFNα-ELP(A),PEGASYS and IFNα[73]

Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［70］構(gòu)建了一系列局部微高熱響應(yīng)的ELP嵌段自組裝體，其中，一段為相變溫度大于90℃的ELP，一段為相變溫度約為40℃的ELP，該段ELP可在微高熱的環(huán)境下疏水聚集形成疏水內(nèi)核，從而發(fā)生自組裝形成納米膠束［圖7（b）］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種NGR小肽功能化的納米膠束可以更多地被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，并且有望將單價(jià)藥物轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄡r(jià)納米顆粒，從而提高藥物與受體的親和力。Gao實(shí)驗(yàn)室［73］在IFN的C末端融合了ELP（A）48-ELP（V）48組成的嵌段物，該偶聯(lián)物可在體溫條件下自組裝成納米膠束，IFNα-ELPdiblock顯著提高了IFNα的體內(nèi)循環(huán)半衰期（54.7 h），是IFNα的124.3倍［圖7（c）］，并且通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出它比IFNα、可溶性IFNα-ELP以及PEG化的IFNα都有更強(qiáng)的抗腫瘤功效［圖7（d）］。

ELP自組裝體也可以用于遞送小分子藥物，如雷帕霉素（Rapamycin）。雷帕霉素是一種免疫抑制劑，可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，但其分子量小，在腎臟中會(huì)被快速清除，且其水溶性差，生物利用度低，頻繁用藥毒副作用強(qiáng)［74］。為此，Shi等［75］構(gòu)建了ELP兩親性共聚物Gs（Val-Pro-Gly-Ile-Gly）48（Val-Pro-Gly-Ser-Gly）48，并在ELP的N端融合了一個(gè)可以與雷帕霉素特異性結(jié)合的蛋白FK506 binding protein 12（FKBP），該ELP自組裝體可以裝載雷帕霉素，形成納米粒子FSI（圖8）。70%的雷帕霉素通過疏水相互作用包裹在ELP的疏水核，以半衰期為1.9 h快速釋放，剩余30%的雷帕霉素與納米粒子表面的FKBP以高親和力結(jié)合，以半衰期為57.8 h慢速釋放，F(xiàn)SI納米粒子的流體力學(xué)半徑小于30 nm，因此不會(huì)被腎臟清除。雷帕霉素與FKBP結(jié)合后，抑制mTOR通路，從而抑制癌細(xì)胞的增殖［76］。與游離的雷帕霉素相比，F(xiàn)SI對(duì)于治療mTOR依賴性乳腺癌異種移植小鼠模型時(shí)顯示出更好的抗腫瘤功效和更低的明顯毒性。

圖8 二嵌段ELP裝載小分子藥物雷帕霉素示意圖Fig.8 Schematic of diblock ELP micelles loading Rapamycin

4.4.2 ELP與其他聚合物構(gòu)建納米顆粒

與兩親性ELP自組裝體形成原理相似，將其他種類的聚合物、蛋白和小分子與ELP融合也可以在疏水作用的驅(qū)動(dòng)下組裝成納米顆粒，用于藥物的遞送。

Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［77］構(gòu)建了嵌合多肽，由親水的ELP和富含半胱氨酸的一段多肽組成，該多肽含有硫醇基團(tuán)與疏水藥物的馬來酰亞胺基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)，lgD>1.5的分子驅(qū)動(dòng)偶聯(lián)物自組裝形成納米顆粒［圖9（a）］，本策略可用于疏水類藥物的遞送。此外，ELP另一端還可以融合靶向序列，賦予藥物靶向性和特異性，進(jìn)一步提高藥物利用率，降低對(duì)非靶細(xì)胞的毒性作用。Gao實(shí)驗(yàn)室［78］通過基因工程技術(shù)合成多肽LHRH-ELP2-C8并與DOX偶聯(lián)，合成了具有靶向性的ELP-藥物偶聯(lián)物：LHRHELP2-DOX［圖9（b）］。其中，LHRH是黃體生成素釋放激素，LHRH的受體在多種腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)，而在健康組織中很少表達(dá)［79］，可以作為腫瘤靶向序列。由冷凍電鏡可以看出，LHRH-ELP2-DOX確實(shí)會(huì)組裝成納米顆粒［圖9（c）］，并在小鼠體內(nèi)有明顯延長的循環(huán)半衰期［圖9（d）］。LHRHELP2-DOX具有靶向能力，相較于ELP2-DOX能更有效地抑制腫瘤生長［圖9（e）］。同時(shí)，作者還結(jié)合了高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）治療，超聲的空化作用有利于酸敏性的腙鍵斷裂釋放出更多的DOX，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)LHRH-ELP2-DOX的腫瘤靶向性、腫瘤滲透性、腫瘤細(xì)胞吞噬能力和藥物釋放率，HIFU處理可以進(jìn)一步提高LHRH-ELP2-DOX的腫瘤抑制率［圖9（e）］。

圖9 （a）ELP混合組裝體裝載疏水藥物分子示意圖，疏水藥物在組裝時(shí)作為組裝體的核心被裝載在核心內(nèi)；（b）LHRHELP2-DOX納米顆粒的合成示意圖；（c）LHRH-ELP2-DOX和ELP2-DOX的冷凍電鏡分析圖像；（d）LHRH-ELP2-DOX在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)；（e）LHRH-ELP2-DOX加HIFU治療后24 d內(nèi)腫瘤體積變化［78］Fig.9(a)Schematic of ELP hybrid nanoparticles loading hydrophobic drug molecules.Hydrophobic drugs are loaded in the core;(b)Synthetic route of LHRH-ELP-DOX nanoconjugates;(c)Cryo-TEM images of LHRH-ELP2-DOX and ELP2-DOX;(d)Pharmacokinetics of LHRH-ELP2-DOX in a DOX-resistant breast tumor mouse model;(e)Tumor volume changes after LHRHELP-DOX plus HIFU treatment[78]

親水類的小分子藥物因?yàn)槠溆H水特性，無法像疏水藥物那樣被直接裝載到疏水核心中，為了利用ELP組裝體來進(jìn)行親水類小分子藥物的遞送，Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［80］構(gòu)建了一種重組不對(duì)稱三嵌段多肽（ATBP）并成功裝載了小分子藥物吉西他濱（GEM）。ATBP由親水的類彈性蛋白、一段含有疏水的酪氨酸多肽、一段富含半胱氨酸的多肽三部分組成，可以自組裝形成棒狀膠束。其中，疏水的酪氨酸多肽在組裝時(shí)是組裝體的核心，GEM的馬來酰亞胺衍生物通過與半胱氨酸共價(jià)結(jié)合，被封裝到組裝體內(nèi)部［圖10（a）］。作者分別通過冷凍電鏡［圖10（b）］和原子力顯微鏡［圖10（c）］觀察到了ATBP-GEM確實(shí)會(huì)形成組裝體，并且ATBP-GEM相較游離GEM有更強(qiáng)的入胞能力，因而會(huì)有更好的抗腫瘤的效果［圖10（d）］，并明顯提高了疾病動(dòng)物的存活率［圖10（e）］。

圖10 （a）ELP混合組裝體裝載親水藥物分子示意圖，其中的疏水序列在組裝時(shí)作為組裝體的核心，親水藥物被裝載在疏水核心內(nèi)；（b）冷凍透射電鏡圖像拍攝到的ATBP-GEM納米顆粒；（c）原子力顯微鏡拍攝到的ATBP-GEM組裝體；（d）ATBP-GEM與游離GEM相比，延遲了腫瘤的生長；（e）ATBP-GEM與游離GEM相比，提高了生存率［80］Fig.10(a)Schematic of ELP hybrid nanoparticles loading hydrophilic drug molecules where hydrophobic sequences act as the core of the assembly when assembled and hydrophilic drugs are loaded within the hydrophobic core;(b)Cryo-TEM micrograph of ATBP-GEM conjugate;(c)AFM image of ATBP-GEM nanoparticles;(d,e)ATBP-GEM delayed the tumor growth(d)and improved the cumulative survival(e)of mice[80]

許多其他種類的疏水性聚合物也可以ELP偶聯(lián)，驅(qū)動(dòng)形成組裝體。Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［81］合成了豆蔻?；cELP的組裝體，在親水性ELP的N端融合一段可以被N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶識(shí)別的肽序列，在N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶（NMT）作用下，最終合成豆蔻酰化的ELP（M-ELP90A，120），豆蔻?；鞘杷模梢宰越M裝成為納米顆粒。阿霉素是疏水性藥物，將阿霉素封裝在納米顆粒中，相比于游離的藥物，封裝在納米顆粒的藥物半衰期增加了6.5倍，降低了非特異性器官毒性。Gao實(shí)驗(yàn)室［82］用聚吡咯（PPy）為疏水內(nèi)核合成了PPy與ELP的組裝體，并將腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)的核仁素的小肽F3融合到ELP的N端，形成能靶向腫瘤細(xì)胞的組裝體（PPy-ELP-F3），疏水藥物阿霉素通過π-π堆積被包裹在組裝體中。聚吡咯（PPy）還可以吸收近紅外光，將光轉(zhuǎn)化為熱，消融癌細(xì)胞［83］。與沒有腫瘤靶向功能的DOX/PPy-ELP納米顆粒和游離DOX相比，DOX/PPy-ELP-F3的協(xié)同光熱和化學(xué)作用對(duì)腫瘤抑制明顯。Gao在賦予組裝體靶向性的基礎(chǔ)上，又結(jié)合了光熱和化學(xué)作用來抑制腫瘤，為研究者們打開了一個(gè)新的思路，通過ELP可以同時(shí)融合更多元化的治療策略來提高治療效率。

ELP除了用作化藥與生物藥的遞送外，還可以遞送納米材料來進(jìn)行腫瘤的治療。金納米顆粒是一類近紅外光熱轉(zhuǎn)化器，已被廣泛應(yīng)用到癌癥光熱治療和成像，金納米粒子（AuNPs）通常在可見光區(qū)域具有局域表面等離子體共振（LSPR）峰，但是可見光的組織穿透能力低不適用于光熱治療［84-86］。然而，其合成比較困難，可能受到有毒的表面活性劑（十六烷基三甲基溴化銨，CTAB）和聚合物（聚乙烯亞胺，PEI）的污染［87-88］。Gao實(shí)驗(yàn)室［89］構(gòu)建了ELP-AuNP，通過金-硫醇的共價(jià)結(jié)合將ELP N端的半胱氨酸與金納米顆粒偶聯(lián)。在小鼠腫瘤內(nèi)單次注射ELP-AuNP，由于腫瘤內(nèi)溫度（32℃）高于ELP-AuNP的相轉(zhuǎn)變溫度（23℃），ELP-AuNP會(huì)自組裝成為金納米顆粒組裝體（AuNP），形成儲(chǔ)庫聚集在腫瘤部位，由于相鄰AuNP之間的等離子體耦合效應(yīng)，可以有效吸收NIR光并將其轉(zhuǎn)化為熱量，展現(xiàn)出強(qiáng)烈的近紅外光吸收，因此用于多種癌癥的光熱治療比如黑色素瘤、頸癌、膀胱癌。這項(xiàng)工作再次展示了ELP在組織遞送中的巨大潛力，拓寬了研究視野，未來可以借助ELP完善更多材料在腫瘤治療中的應(yīng)用。

4.5 ELP水凝膠用于組織工程與藥物遞送的聯(lián)合

Chilkoti實(shí)驗(yàn)室［90］發(fā)現(xiàn)，一種非交聯(lián)的ELP在35℃時(shí)會(huì)凝聚，變成類似膠原蛋白和透明質(zhì)酸的凝膠態(tài)，這種ELP水凝膠可用于支持軟骨細(xì)胞生長和軟骨基質(zhì)合成。然而，非交聯(lián)的ELP水凝膠剛性較差，能提供的支撐力有限，研究者們通過制作交聯(lián)的ELP來提高ELP水凝膠的剛性［91-93］，以便于其在骨組織支撐及其他組織工程領(lǐng)域更好地發(fā)揮作用。Sun等［94］提出了一種利用蛋白質(zhì)反應(yīng)對(duì)SpyTag-SpyCatchr生物合成ELP水凝膠的策略。該策略可合成具有三維結(jié)構(gòu)的ELP水凝膠，SpyTag與SpyCatchr在生理?xiàng)l件下可自發(fā)形成共價(jià)異肽鍵，進(jìn)而使ELP組裝成三維分子網(wǎng)絡(luò)并起到更好的組織支撐功能。此外，在每個(gè)構(gòu)成ELP水凝膠的單元中還可以融入一個(gè)蛋白分子，賦予蛋白ELP水凝膠更多的功能。Sun提出的這種合成策略為ELP水凝膠同時(shí)實(shí)現(xiàn)組織工程與藥物遞送功能提供了可能和便利。Pal等［95］將游離的藥物rhBMP-2和多西環(huán)素（doxycycline）裝載到膠原-ELP水凝膠上，藥物的裝載不僅賦予了ELP水凝膠多西環(huán)素的抗菌功能以及rhBMP-2的誘導(dǎo)骨生長作用，還進(jìn)一步增強(qiáng)了水凝膠的力學(xué)性能，為骨生長提供更佳的力學(xué)支持作用，從而表現(xiàn)出更好的骨再生效果。通過以上方法，藥物可以被固定［94］或是游離［95］地裝載到ELP水凝膠上，未來可以更多地將ELP的藥物遞送功能與其在組織工程中的運(yùn)用結(jié)合起來，更好地輔助組織修復(fù)和疾病治療。

表1中總結(jié)了一些較有代表性的ELP用于藥物遞送的實(shí)例。

表1 ELP用于藥物遞送的實(shí)例Tab.1 Applications of ELP in drug delivery

5 總結(jié)

近年來，ELP作為一種新型生物材料，在藥物遞送的應(yīng)用上已取得了顯著進(jìn)展，這主要源于其獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的開發(fā)潛力。

（1）ELP可塑性強(qiáng)且易于調(diào)控：ELP的組成、分子量、分散性均可通過序列設(shè)計(jì)和基因編輯來精確控制。

（2）ELP的生產(chǎn)制備經(jīng)濟(jì)簡便：ELP融合蛋白表達(dá)量高，蛋白純化方法簡單且無需借助復(fù)雜昂貴的色譜純化設(shè)備，生產(chǎn)工藝簡單且成本能耗低。

（3）ELP的生物安全性高：ELP無毒性、可生物降解、具有良好的生物相容性，作為藥物遞送材料使用非常安全可靠。

（4）ELP具有刺激響應(yīng)性：ELP具有特殊的溫度響應(yīng)性，可根據(jù)不同藥物的特點(diǎn)及治療需求，在時(shí)間或空間上對(duì)藥物的釋放及靶向性進(jìn)行控制，定制出更多響應(yīng)性的ELP偶聯(lián)藥物。

（5）ELP的挖掘潛力大：基于DNA重組技術(shù)，ELP序列中可自由添加其他反應(yīng)性氨基酸或者活性蛋白，賦予ELP新的結(jié)構(gòu)和功能。例如，有研究已利用基因編碼的蛋白質(zhì)反應(yīng)對(duì)SpyTag-SpyCatchr生物合成了具有環(huán)狀、支化、索烴等特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的ELP［96-99］，此類ELP可以賦予蛋白質(zhì)更好的抗蛋白質(zhì)水解、加熱和凍融能力，這些特性更有利于蛋白的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，將此類ELP應(yīng)用于藥物制劑中潛力巨大。ELP還可以與其他種類的聚合物分子進(jìn)行協(xié)同應(yīng)用，補(bǔ)充其功能，拓寬ELP的應(yīng)用范圍。

盡管ELP在藥物遞送上展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢和巨大潛力，它也存在著一些局限性和亟待解決的問題。通過基因工程方法只能在蛋白質(zhì)的C末端或N末端進(jìn)行ELP的融合，對(duì)蛋白的修飾方式比較有限，不如化學(xué)修飾方法多樣化。藥物與ELP融合后可能會(huì)影響藥物的生物學(xué)活性［51］，未來在制作ELP藥物融合物時(shí)還需要優(yōu)化設(shè)計(jì)，最大程度保留蛋白質(zhì)藥物的活性。目前為止，那些已報(bào)道的運(yùn)用ELP進(jìn)行藥物遞送的工作基本都使用大腸桿菌作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)，盡管大腸桿菌表達(dá)體系有著高產(chǎn)量低成本的生產(chǎn)優(yōu)勢，但大腸桿菌并不具備真核表達(dá)系統(tǒng)的包括糖基化修飾在內(nèi)的翻譯后修飾功能，不適用于表達(dá)那些需要翻譯后修飾才能發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)藥物［100］。現(xiàn)生物制藥領(lǐng)域常用來制備藥物的中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞和人胚腎（HEK293）細(xì)胞等真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)多是通過分泌型表達(dá)來制備蛋白質(zhì)藥物的，而由于ELP本身的疏水特性，ELP融合蛋白很難在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，而胞內(nèi)表達(dá)方式又會(huì)帶來巨大的生產(chǎn)成本，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。未來研究需要進(jìn)一步拓展ELP融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和提取方法，解決ELP融合蛋白質(zhì)無翻譯后修飾這一不足，擴(kuò)大ELP適用的藥物種類。雖然ELP是由天然氨基酸序列構(gòu)成的，理論上來說是可安全降解的，但人工合成的ELP融合蛋白在體內(nèi)具體的降解機(jī)理還未有清晰闡述。此外，雖然部分ELP類藥物已成功推進(jìn)到臨床階段，但尚未有臨床獲批的ELP類藥物，ELP在藥物遞送的應(yīng)用上是否還存在其他的問題需要更多的臨床數(shù)據(jù)來提供支持，需要研究者們將更多的研究推進(jìn)到臨床階段，一方面可根據(jù)臨床數(shù)據(jù)來不斷完善ELP的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，另一方面臨床試驗(yàn)的成功必將打出響亮一炮，加速ELP在藥物遞送中的應(yīng)用轉(zhuǎn)化及發(fā)展。