力信號在干細胞命運決定過程中的影響

宋成治，孫陽，曹毅，2

（1南京大學物理學院，江蘇 南京 210093；2南京大學固體微結(jié)構(gòu)物理國家重點實驗室，江蘇 南京 210093）

干細胞的研究最早始于20世紀60年代，這一概念一經(jīng)提出便很快得到人們的青睞。1981年Evans和Kaufman［1］成功實現(xiàn)了小鼠胚胎干細胞的分離與離體培養(yǎng)，進一步促進了這一領(lǐng)域研究熱潮的形成。干細胞的備受矚目源于其自身強大的自我更新和分化潛能以及基于此的廣泛應(yīng)用前景：作為細胞療法的重要支柱，各種類型的干細胞為許多遺傳病和退行性疾病的治療提供了新的思路［2］。例如將造血干細胞移植用于骨髓系統(tǒng)重建，至今已使超過100萬的病人從中獲益［3］；干細胞也是組織工程的核心材料，目前通過組織工程人們已經(jīng)可以構(gòu)建出具有一定生理活性的組織器官如肺葉、心臟等［4-5］，而干細胞則為組織工程的實現(xiàn)提供了多樣的材料選擇。除胚胎干細胞外，一些專能干細胞在適當條件下也能夠分化為多種不同的組織類型，具有極高的塑性［6］。另外在胚胎發(fā)育研究方面，干細胞的分化特性更是為人們理解發(fā)育提供了重要的參考模板［7］。但若想將干細胞真正為人們所用，首先必須要理解其干性維持和分化調(diào)控的基本原理。在之前幾十年的研究中，研究的重心多集中于各類生物化學因子本身的作用上［8-10］；一直到近些年，細胞外力學環(huán)境在干細胞命運決定過程中的作用才被逐漸解鎖。隨著合成生物材料的不斷發(fā)展，力學性質(zhì)可控的干細胞培養(yǎng)環(huán)境拓展了人們探究力信號作用的手段，通過設(shè)計凝膠或微柱陣列等體系的模量參數(shù)，可以實現(xiàn)對干細胞生存環(huán)境力學性質(zhì)的定量調(diào)控，在不同的力信號下探究干細胞的行為，從而獲得對干細胞分化調(diào)節(jié)機制更為全面的理解。

1 力信號對干細胞行為的影響

除化學生物因子外，機械力學信號也會對干細胞的干性維持和分化特性產(chǎn)生重要影響（圖1）。首先，靜態(tài)的力學信號可以調(diào)節(jié)干細胞的行為。細胞外基質(zhì)的強度、黏彈性、塑形等力學性能的差異均可導致干細胞的不同響應(yīng)。另外，動態(tài)的力學信號如外界的拉伸、壓縮、扭轉(zhuǎn)等也可影響干細胞行為，且其影響效果與力信號本身的頻率、幅度、持續(xù)時長等多種因素有關(guān)。

圖1 力學信號對干細胞行為造成影響Fig.1 Mechanical signals affect stem cells behavior as traditional biochemical signals

1.1 基底模量大小對干細胞的影響

細胞感受到的環(huán)境力學信號首先便是基底的硬度。在人體中，不同組織的強度有很大的不同，如大腦的彈性模量只有約0.1～1 kPa（模量隨位置不同會有一定變化）［11］，而骨骼的彈性模量可達到20 GPa［12］，生活在不同環(huán)境中的細胞從外界感受到的基底硬度信息差異很大，而這種環(huán)境的差異性自然表現(xiàn)為細胞的不同表型。實驗表明，基底的硬度可以對組織細胞遷移、伸展、增殖等眾多行為造成影響［13-17］，事實上，保持對于基底強度的動態(tài)感知是一般細胞維持存活的必要條件。如果基底過軟或細胞對基底強度信息獲得的途徑中斷，細胞便會很快走向凋亡［18］。對于干細胞而言，基底強度還可以直接影響細胞干性和分化方向：例如神經(jīng)干細胞在模量處于100～500 Pa的基底上形成神經(jīng)元，而在模量處于1000～10 000 Pa的基底上形成膠質(zhì)細胞［19］；間充質(zhì)干細胞在柔軟環(huán)境中（微柱陣列彈性系數(shù)K=1.9 nN/μm）傾向于成脂分化而在較硬環(huán)境中（微柱陣列彈性系數(shù)K=1 556 nN/μm）則傾向于成骨分化［20］。

1.2 基底黏彈性與塑性對干細胞的影響

黏彈性用于刻畫材料在發(fā)生形變時兼具彈性和黏性的特征。不同于一般的彈性物質(zhì)，具備黏彈性的物質(zhì)的應(yīng)力響應(yīng)與時間相關(guān)，在整個形變發(fā)生和恢復(fù)的過程中會同時帶來能量的耗散。黏彈性的時間響應(yīng)特征及其蘊含的塑性成分為細胞對基底的感知和重塑提供了更多機會，能夠獨立于基底強度對干細胞的行為產(chǎn)生影響［21-23］?；姿苄杂脕矸磻?yīng)材料基底在外力影響下的塑性形變成分，它使培養(yǎng)環(huán)境可隨著細胞的生長發(fā)生一定程度的形變，減小對細胞擴展的束縛［24-27］。實驗研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)損耗模量增加所代表的塑性增強可以促進間充質(zhì)干細胞的延展和分化［28-30］，促進有絲分裂和細胞周期的完成［31-32］。同時，在模量較小時塑性強的基底往往也更有利于干細胞的生長和干性的維持［23］。事實上最早的關(guān)于基底硬度對組織再生領(lǐng)域干細胞分化調(diào)控的研究便是在黏彈性材料上完成的［33］，而硬度本身的調(diào)節(jié)作用也需要借助于對環(huán)境的重塑才可實現(xiàn)［34］。利用一種之前已有的抓手模型，可以大致重現(xiàn)細胞對基底硬度和黏彈性響應(yīng)中的動力學過程［35-38］。許多水凝膠材料在軟骨再生、聲帶重構(gòu)、心肌梗塞病例模型的構(gòu)建方面的應(yīng)用便很可能依賴于其黏彈性和塑性特征［39-42］。

1.3 動態(tài)力學拉伸對干細胞的影響

在環(huán)境的靜態(tài)力學特性之外，外界如拉伸或壓縮這樣的動態(tài)力學信號也會對細胞的行為產(chǎn)生重要影響。相比之下，動態(tài)力學信號的可變要素更多因而其作用效果也往往更為復(fù)雜，即使對于同種細胞，不同頻率、振幅、間隔時長的力信號也可能會造成很不相同的結(jié)果［43］。動態(tài)力學信號的作用效果可以在一定程度上代替基底硬度的調(diào)節(jié)功能，對細胞的增殖、遷移、黏附、分化等帶來顯著影響［43-45］。值得說明的是，動態(tài)力學信號往往需要和生化因子相互結(jié)合才能發(fā)揮其對干細胞命運決定過程的影響。但二者結(jié)合作用的效果要比單獨的力信號作用或生化因子作用更為明顯，形成1+1＞2的調(diào)節(jié)特征［46］。例如動態(tài)的力學扭轉(zhuǎn)和壓縮可以顯著促進間充質(zhì)干細胞（MSC）的軟骨發(fā)生［47］，如圖2所示。相比于對照組，在幅度0.4 mm（10%～20%）、1 Hz的動態(tài)壓縮作用下或者在轉(zhuǎn)幅±25°、1 Hz的動態(tài)扭轉(zhuǎn)作用下（兩種作用時長均為每周連續(xù)5天，持續(xù)3周，每天1 h），MSC的成骨指標和成軟骨指標表達量只出現(xiàn)一定程度的上升。但若將兩種作用結(jié)合則可以看到兩種指標在整個區(qū)域內(nèi)均有顯著增長（圖2中最后一列圖像整體顏色相比于第一列均更深）。另外，在與TGF-β3共同作用時，動態(tài)力學信號還可以進一步提高人造軟骨結(jié)構(gòu)的力學性能［48］。扭轉(zhuǎn)和壓縮信號之所以能夠促進軟骨形成，很大一部分原因便在于這種外加的信號更好地模擬了體內(nèi)軟骨形成所需的真實生理環(huán)境，還原了結(jié)構(gòu)形成的必要條件［49］。這種仿生的思想在生物材料設(shè)計的其他許多地方也常有體現(xiàn)。

2 力信號傳導原理和相關(guān)通路分析

力信號傳導主要需要經(jīng)歷3個步驟，首先需要細胞對周圍的力學信號進行識別與感知，接著需要將細胞表面接受到的信號傳導至細胞核，最后由細胞核通過基因表達調(diào)控來對外界的力學信號做出響應(yīng)。在接受信號的第1步，常常需要對來自細胞外基質(zhì)或細胞間的力學信號進行感知，通常借助于整合素、鈣黏素等途徑實現(xiàn)。而后續(xù)的信號傳導則相對較為復(fù)雜，既有借助于信號分子的化學傳導，又有借助于細胞骨架拉伸的機械傳導。下面集中對上述兩個環(huán)節(jié)中的主要原理進行簡單的介紹。

2.1 力信號的感知與傳導

2.1.1 細胞通過整合素和E-鈣黏素來感知環(huán)境和周圍細胞力信號

機體中細胞接收到的力信號主要有細胞外基質(zhì)（ECM）和周圍其他細胞兩個來源［50］。對于ECM中的力學信號，其感知主要依賴于細胞膜上的跨膜蛋白整合素。整合素由α和β兩個亞基構(gòu)成，其胞外部分可同ECM中的配體（如RGD）結(jié)合感知細胞外基質(zhì)的狀態(tài)，而胞內(nèi)部分則通過適配的蛋白與細胞骨架相連［18］（前面提到的分子抓手模型刻畫的正是整合素和細胞骨架肌動蛋白間的偶聯(lián)作用［51-52］）。當胞外結(jié)構(gòu)域與特定蛋白結(jié)合時，其胞內(nèi)部分也將發(fā)生構(gòu)象變化并激活鄰近黏著斑激酶（FAK）的作用，促進黏著斑的聚集?；椎膹姸炔煌?，將會不同程度地激活FAK的活性［53］，進而表現(xiàn)為黏著斑強度和大小的差異［54-58］。事實上，細胞正是通過黏著斑的聚集或降解來達到與周圍環(huán)境的動態(tài)平衡［59］。以細胞由懸浮狀態(tài)變?yōu)轲じ綘顟B(tài)為例，細胞與基底接觸后，整合素聚集成團簇，通過激活Src促進肌動蛋白的組裝［60-61］。另外，在基底強度響應(yīng)過程中，還會發(fā)生踝蛋白的酶解［62］、表皮生長因子受體（EGFR）的激活［63］、α-輔肌動蛋白的招募［64］、整合素αvβ3到α5β1的轉(zhuǎn)變等過程［65］。細胞間依賴于鈣黏蛋白的黏附和力信號感知過程與整合素介導的黏附類似，也需要經(jīng)歷黏著團簇形成、肌動蛋白交聯(lián)等一系列過程來完成［66-73］。

2.1.2 細胞骨架動態(tài)組裝和肌動蛋白收縮在力信號傳導中的重要作用

在力信號的胞內(nèi)傳導過程中細胞骨架可以起到橋梁作用：由肌動蛋白等組成的細胞骨架外側(cè)借助于和細胞膜上的黏著斑相連感受來自外部的力學信號刺激；內(nèi)側(cè)借助于同核骨架蛋白（LMNA）的錨連與細胞核相接，將細胞在表面感知到的物理信息轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎藘?nèi)部基因表達上的差異。當細胞通過拉伸肌動蛋白以感受周圍環(huán)境的強度信息時，細胞骨架所產(chǎn)生的應(yīng)力將帶動內(nèi)側(cè)相連的LMNA一同運動，通過LMNA的拉伸和展開以及其表達水平來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進而對細胞的表型產(chǎn)生影響［74-75］。

2.1.3 細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用

細胞對于基底力學信號的感知往往需要借助于細胞邊緣的標準感應(yīng)模塊的周期性形成與降解來完成［76］。細胞通過多輪的感知過程調(diào)整黏著斑的強度和大小以及自身細胞骨架的結(jié)構(gòu)狀況：較強的黏附會進一步促進更為活躍的偽足活動，加強與基質(zhì)的聯(lián)系［77］，并通過更多肌動蛋白拉力纖維與黏著斑的交聯(lián)來促進整合素和細胞骨架間的連接［78］；而過軟的基質(zhì)則會使已經(jīng)形成的黏附逐漸解聚，并可能通過死亡相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）相關(guān)通路的激活引發(fā)細胞的凋亡［79］。而在黏附強度變化的過程中細胞也會對ECM進行不同程度的重塑，ECM的強度變化將會進一步影響細胞的黏附狀況和力感知過程，二者能夠形成動態(tài)的相互影響。不過，短暫的力學感受過程（約幾分鐘的時間就可以完成一輪感知過程）也可以對細胞命運產(chǎn)生長時程的影響［80］，當力信號持續(xù)時間和強度達到一定閾值，干細胞能夠通過YAP/TAZ的活動對之前的信號刺激產(chǎn)生記憶［81］，力信號傳導如圖3所示。

圖3 力學信號傳導過程（細胞外力學信號可以通過細胞外基質(zhì)-整合素-細胞骨架間的連接或借助YAP/TAZ等信號分子的傳導進入細胞核中產(chǎn)生作用。而細胞間力學信號則通過E-Cadherin進行介導）Fig.3 Schematic diagrams for mechanical signal transduction[External mechanical signal could be passed down to the nucleus either through a direct mechanical connection of ECM(extracellular matrix)-integrin-cytoskeleton or through some signaling molecules such as YAP/TAZ while cellular interaction is mediated through E-Cadherin(LINC:nucleoskeleton and cytoskeleton complex)]

2.2 YAP/TAZ通道在力學信號傳導中的作用

細胞通過整合素等黏附蛋白感受到外界環(huán)境的力學特性后，會通過肌動球蛋白伸縮性的改變和細胞骨架的組織重構(gòu)來與外界達到力學平衡［82］，與此同時力信號向細胞核方向的傳播在很多情境中都需要借助于轉(zhuǎn)錄因子YAP（Yes-associated protein）與TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif）的共同作用來實現(xiàn)［83-85］。YAP和TAZ均為Hippo信號通路中的末端效應(yīng)物，作為Hippo通路的一部分，可以對組織生長的大小進行調(diào)控。除此之外，二者在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細胞自我更新、腫瘤發(fā)育、環(huán)境力信號感知等過程中也起著重要作用［86-88］。另外，YAP和TAZ還可獨立于Hippo通路發(fā)揮作用，例如轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β就可對這兩種蛋白的行為直接進行調(diào)控［43，89-90］。YAP/TAZ常被同時提及，主要是由于在大量試驗條件和生物功能中二者在結(jié)構(gòu)和對應(yīng)基因特征上表達出的高度相似性。但二者在特定基因敲除的小鼠中可以分別導致不同的表型，暗示兩者在信號通路中普遍相似的功能之外也存在各自獨立的功能［91-92］，二者的差異性仍是目前學術(shù)界研究的一個重點。在較硬的基底中，黏著斑的增長和細胞骨架張力傳導會促進YAP/TAZ的表達與核聚集現(xiàn)象；而在較軟的基底中，YAP/TAZ的活動反而會受到抑制［93-94］。

YAP的激活需要黏著斑中黏著斑激酶（FAK）、Src的協(xié)助，其中Src既可以通過磷酸化YAP來實現(xiàn)直接的調(diào)節(jié)［95］，也可通過調(diào)節(jié)細胞骨架的結(jié)構(gòu)來間接影響YAP/TAZ的功能，在不同背景下兩種影響作用的主次關(guān)系尚待進一步探明。另外，整合素介導的YAP/TAZ激活可能也與β-PIX、小G蛋白Rac1、PAK等因素有關(guān)［96］。但對于肌動蛋白細胞骨架如何調(diào)控YAP/TAZ行為目前尚無定論，有研究認為血管生成素（AMOT）可能是二者聯(lián)系的信使［97-98］，但這種觀點目前尚缺少有力的實驗論據(jù)［99］。在黏附蛋白之外，其他的一些膜蛋白也可為YAP/TAZ通路傳導力學信號，如神經(jīng)干細胞中的鈣離子通道Piezo1就可以激活YAP/TAZ的活動［100］。另外，細胞延展等因素也可在不借助于黏著斑的條件下影響YAP/TAZ通路的活動［101］，延展造成的細胞骨架收縮可通過與LINC蛋白復(fù)合物的相互作用來調(diào)節(jié)細胞核的行為。近年來有研究認為，YAP/TAZ的核聚集實際上正是通過細胞骨架調(diào)整核孔通透性而間接實現(xiàn)的，有實驗已經(jīng)觀察到，當F-肌動蛋白與LINC復(fù)合物的錨連被切斷時，YAP/TAZ的作用也被抑制［102］。

2.3 獨立于YAP/TAZ之外的其他力信號傳導通路

雖然許多的力信號傳導途徑均和YAP/TAZ相關(guān)，但部分通路也可獨立于二者完成對外界力信號的感知。黏著斑、細胞骨架激活RHOA（Ras homolog family member A）和MAPK（mitogen-activated protein kinase）蛋白后，除了可以通過YAP/TAZ通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活動，還可借助于MAL蛋白來調(diào)節(jié)基因的表達。例如MAL下游的JUNB基因便可調(diào)節(jié)細胞的分化行為［103-104］。另外有實驗表明，對乳腺癌病人的組織細胞進行體外三維培養(yǎng)的過程中，對基底硬度的感知無需通過YAP的核聚集來完成，提示我們在某些場景中力信號傳導可以獨立于YAP完成［105］。

2.4 Piezo蛋白與力信號感知與傳導

Piezo蛋白家族為一類可將機械力學信號轉(zhuǎn)化為電生理信號的跨膜蛋白［106］。其中Piezo1蛋白為三葉螺旋槳狀的三聚體結(jié)構(gòu)［107］，由于近年來其在力信號傳導中的突出作用被人們所發(fā)現(xiàn)，Piezo蛋白開始受到越來越多的關(guān)注。Piezo可以對細胞膜上的張力進行獨立響應(yīng)，通過膜張力變化帶來的門控通道開啟改變膜兩側(cè)電位差以此完成力學信號的轉(zhuǎn)換。例如在神經(jīng)干細胞中，Piezo1鈣離子通道便可對細胞膜上的張力做出響應(yīng)，進而借助于YAP/TAZ通路來調(diào)節(jié)基因的表達狀況。另外，Piezo蛋白的力學響應(yīng)特征還使其在血紅細胞體積調(diào)節(jié)、上皮細胞穩(wěn)態(tài)維持、器官壓力感受中起到重要作用［108］。

3 合成材料用于構(gòu)建細胞生長環(huán)境

研究細胞外力學信號對干細胞命運決定過程的影響與機理，首先便要求能夠?qū)κ┘拥臋C械信號進行定量調(diào)控。合成生物材料的發(fā)展為人造細胞外環(huán)境的構(gòu)建提供了越來越多的選擇和可能性，大大推動了研究的進程。

3.1 合成材料模擬不同硬度細胞外基質(zhì)

目前對不同硬度基底的模擬主要采用的是水凝膠網(wǎng)絡(luò)和微柱陣列兩套方案。多種水凝膠網(wǎng)絡(luò)體系均可模擬ECM環(huán)境并對干細胞進行培養(yǎng)，如傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺網(wǎng)絡(luò)便可通過調(diào)節(jié)丙烯酰胺單體和交聯(lián)點雙丙烯酰胺的濃度來實現(xiàn)對基底模量的連續(xù)調(diào)控［109］，對于聚乙二醇等體系也有類似的模量控制特征［110-111］。然而過高的聚合物濃度常?？赡軙绊懠毎酿じ教匦?，因而在模量調(diào)節(jié)的過程中常要結(jié)合實驗，需要兼顧基底強度、細胞黏附性等多種要素的平衡。借助于微柱陣列也可實現(xiàn)對不同強度的細胞外基質(zhì)的模擬［20］，通過改變微柱的高度與間距即可定量調(diào)節(jié)基底的模量［112］，同時通過跟蹤微柱的位移還可以測量細胞施加在基底上力的大?。?6，113-114］。另外，微柱陣列的優(yōu)點也體現(xiàn)在解除基底強度和黏性特征偶聯(lián)這一方面，實現(xiàn)對強度或黏性的獨立調(diào)控［20，115］。除上述體系外，聚碳酸酯、靜電紡支架等體系還可以較好地維持間充質(zhì)干細胞干性，其特性或許可以為組織構(gòu)建帶來更多幫助［116-117］。

3.2 合成材料幾何結(jié)構(gòu)特征對干細胞行為的影響

不同形狀的基底可以影響細胞的基因表達狀況［118］、分化方向［119］等。有研究發(fā)現(xiàn)，將胚胎成纖維細胞培養(yǎng)于具有相等面積的三角形或圓形微結(jié)構(gòu)（微結(jié)構(gòu)面積與單細胞的伸展面積相當）以及具有相同形狀不同長寬比的微結(jié)構(gòu)的基板上時，細胞的基因表達狀況出現(xiàn)明顯差異［118］。利用具有不同幾何特征的基底對巨噬細胞的形狀進行約束可使其向不同方向分化（較大的長寬比可誘導巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變）［119］?；仔螤顚毎袨榈挠绊懣赡芘c細胞骨架伸縮性的改變［118］以及信號通路中cAMP濃度、PIP2和PIP3的合成等因素有關(guān)［120-121］。另外，基底的幾何結(jié)構(gòu)特征可以對干細胞分化狀況產(chǎn)生顯著影響，例如通過構(gòu)建不同取向的黏性纖維基底可以促進MSC不同程度的成軟骨分化（當基底纖維延展角度與微流控平臺流液方向垂直時最有利于向軟骨方向的分化）［122］。通過改變羥基磷灰石基底盤片的平整程度可以使YAP/TAZ表達最優(yōu)化進而促進MSC成骨方向的分化。對基底幾何結(jié)構(gòu)特征影響效果的探究首先要求我們能夠制備不同幾何結(jié)構(gòu)的基底材料（如基底的不同形狀、不同延展取向、不同平整度等），這便需要進一步發(fā)展更具針對性的生物材料合成手段。

3.3 塑性形變生物合成材料與干細胞的力學互動

天然細胞外基質(zhì)中的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)以及多糖網(wǎng)絡(luò)被認為是黏彈性和塑性的主要貢獻者［123］。傳統(tǒng)的水凝膠體系可通過在聚丙烯酰胺中加入線性的丙烯酰胺鏈來模仿天然網(wǎng)絡(luò)的這一特性［124］；而對于蛋白質(zhì)水凝膠，可以直接在單體序列中引入基質(zhì)金屬蛋白酶的作用片段來達成網(wǎng)絡(luò)可塑性的目標。此外，諸如p53二聚序列的插入還可在不影響網(wǎng)絡(luò)化學鍵數(shù)目的前提下十分方便地為體系帶來更多物理交聯(lián)，從而實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)耗散模量相較于彈性模量較為獨立的調(diào)控［125］。目前許多在再生醫(yī)學中較為成功的生物材料應(yīng)用案例如膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)、透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)和其他的一些促進骨骼肌、肝臟、神經(jīng)組織再生的培養(yǎng)網(wǎng)絡(luò)普遍都是由物理交聯(lián)構(gòu)成的水凝膠體系，均具有較好的塑性和黏彈性特征［126-130］，提示我們塑性及與其相關(guān)的細胞與基質(zhì)的力學互動在組織培養(yǎng)中的潛在重要性。不過，對于當前的許多材料，動態(tài)性的材料重塑仍是一大難題，通過有效整合更多的合成路徑來更精確地控制凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)、組分和特定官能集團的位置并實現(xiàn)對凝膠網(wǎng)絡(luò)的實時調(diào)控或許將會是未來進一步探索基底黏彈性和塑性影響效果的必經(jīng)之路［131-133］。近年來，借助于Dronpa、CarHc、UVR8等蛋白在特定波長光照下解聚的特點制作出的多種光調(diào)控水凝膠網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在這一領(lǐng)域做出了成功的嘗試［134-136］。

3.4 利用合成材料構(gòu)建三維培養(yǎng)環(huán)境

細胞培養(yǎng)的維數(shù)會對干細胞行為產(chǎn)生很大的影響，一些在二維培養(yǎng)條件下出現(xiàn)的現(xiàn)象，在三維培養(yǎng)時可能迥乎不同：例如三維環(huán)境中，乳腺癌細胞的力信號傳導將不再依賴于二維條件下的YAP通路［105］；二維培養(yǎng)中不會出現(xiàn)的組織形態(tài)特征和分化表型在三維培養(yǎng)時能夠產(chǎn)生［137］；在基底硬度的影響方面，二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)也會有所不同［138］。三維培養(yǎng)環(huán)境因其更接近于細胞生長的自然狀態(tài)，對于細胞的形態(tài)學變化、干性維持等均有重要影響［139］，然而天然的細胞外基質(zhì)如基底膜或Ⅰ型膠原蛋白由于難以調(diào)控其不同組分之間的關(guān)聯(lián)，不便于研究特定力學信號對干細胞行為的影響，這時合成生物學材料在變量控制方面的優(yōu)越性便體現(xiàn)出來：例如在基于SpyCatcher/tag化學的水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，通過基因重組技術(shù)在單體序列中插入更多的成鍵片段（如在兩段ELP序列中間額外增加可用于成鍵的一段Spytag序列），便可實現(xiàn)對體系成鍵密度的調(diào)控，構(gòu)建模量不同的細胞三維培養(yǎng)環(huán)境［125］（圖4）。

圖4 利用Spycatcher/tag化學構(gòu)建成鍵密度不同的水凝膠網(wǎng)絡(luò)［125］Fig.4 Building hydrogel network with different bonding density using Spycatcher/tag chemistry[125]

4 前景展望

隨著研究的不斷深入，力信號對干細胞行為所起的調(diào)節(jié)作用正逐漸為人們所認知。合成生物材料的發(fā)展為這一領(lǐng)域的研究提供了更多的方法與手段。借助于水凝膠系統(tǒng)和微柱陣列，可以對細胞培養(yǎng)環(huán)境的單一力學特征進行半定量調(diào)節(jié)，在有效控制變量的基礎(chǔ)上探明基底強度、黏彈性、塑形等特定力學性能對干細胞行為的具體影響。其中，蛋白質(zhì)水凝膠由于其高度的生物相容性和巨大的設(shè)計空間正逐漸受到越來越多的關(guān)注，通過合理地對單體序列進行設(shè)計，可以方便地實現(xiàn)變量調(diào)控、動態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變等多種功能，為開展定量化的實驗研究提供有利條件。另外，通過新型合成生物材料，還可以在三維環(huán)境下對干細胞進行培養(yǎng)和研究，探明在更接近于體內(nèi)真實情景下力信號對干細胞干性維持和分化特性產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。但同時也應(yīng)當注意到，雖然在現(xiàn)象和機理上的認識不斷深化，但仍有大量的未知內(nèi)容有待進一步研究。一方面，需要從微觀入手，研究力信號傳導每一步的具體實現(xiàn)機理，確立某一節(jié)點調(diào)節(jié)背后的定量關(guān)系；另一方面，還需要從宏觀上更準確地把握力信號影響所依賴的完整圖景，從不同甚至截然相反的實驗結(jié)果中提取出核心信息和調(diào)節(jié)途徑，并在復(fù)雜交錯的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中理清各個節(jié)點間的聯(lián)系。對于前者仍需要更為定量的實驗方案：首先要能對細胞外環(huán)境的各類力學性能進行獨立而精確的調(diào)控，另外還要能對細胞及其外環(huán)境的狀態(tài)進行實時的監(jiān)控與表征。不斷發(fā)展的合成材料在細胞作用力的測量上就為實驗設(shè)計提供了不少選擇，從20世紀的硅類基底的褶皺狀況辨識［140］，到如今的彈性凝膠系統(tǒng)中鑲嵌的熒光小珠的移動分析［17，141］、微柱陣列的位移表征［76，112-114］，合成材料的使用可在已有儀器的基礎(chǔ)上使力信號的施加與讀取更加準確便捷。同時，原子力顯微鏡、結(jié)構(gòu)光顯微鏡、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等儀器和新技術(shù)在力信號測量、核心分子活動特征分析等方面的合理使用也可以為更加精準定量的實驗研究提供方便［142-145］。此外，分子動力學模擬等計算機方法的引入還可以幫助我們對核心分子在信號傳導過程中的動力學行為進行直觀刻畫［146］。對于后者，實驗數(shù)據(jù)的分析和要素提取則顯得尤為重要，傳統(tǒng)系統(tǒng)生物學的計算方法與機器學習結(jié)合，或許可以為完整調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立帶來更多啟示。認清機械力學信號對干細胞命運決定過程的影響意義非凡，無論是深入理解胚胎發(fā)育，還是推進未來組織工程發(fā)展和相關(guān)的靶向藥物設(shè)計，其機制的探明都是無法繞開的核心話題，蘊藏著巨大的科研價值與產(chǎn)業(yè)化潛力，這一領(lǐng)域的研究定會因此而不斷深入下去。