聚羥基脂肪酸酯的低碳生物制造：基于碳轉(zhuǎn)化率的分析與應(yīng)用

王倩，祁慶生

（山東大學(xué)，微生物技術(shù)國家重點實驗室，國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266237）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是由微生物合成的一種細胞內(nèi)高分子聚酯的通稱［1-3］。PHA具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性能，被認為是環(huán)境友好型材料［4］，有助于解決日益嚴重的環(huán)境污染，特別是塑料污染問題。PHA已被廣泛應(yīng)用于包裝材料、電學(xué)材料、生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域，成為生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點。

20世紀(jì)20年代，人們首次在微生物Azotobacter chroococcum細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種親蘇丹染料、可溶于氯仿的類脂肪包涵體，其后在Bacillus megaterium中又發(fā)現(xiàn)了類似的包涵體，其組成被鑒定為PHB（poly-β-3-hydroxybutyrate）［5］。自那以來各種不同單體組成的聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）被發(fā)現(xiàn)和合成。作為微生物產(chǎn)生的天然聚酯，它的材料特性因單體鏈長和組成而異。迄今為止，在已經(jīng)合成的超過150多種PHA中，其性質(zhì)從熱塑性耐用聚酯到黏性樹脂，PHA的材料性能可以與傳統(tǒng)的石化塑料相媲美，滿足不同的需求［6］。

天然PHA通?？煞譃閮纱箢悾▓D1），即短鏈長（short-chain-length）PHA（SCL-PHA）和中鏈長（medium-chain-length）PHA（MCL-PHA）。SCL-PHA由包含3至5個碳原子的單體組成，其代表性實例為PHB和PHBV［poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）］。PHB是由兩分子乙酰輔酶A通過β-酮硫解酶（PhaA）縮合成乙酰乙酰輔酶A，然后通過NADPH依賴性乙酰乙酰輔酶A還原酶（PhaB）還原為（R）-3-HB-CoA，最后通過PHA合酶（PhaC）聚合形成PHB。PHB生物合成操縱子phaCAB最初是在Cupriavidus necator（之前菌名為Ralstonia eutropha）中鑒定的。MCL-PHA通常存在于假單胞菌中，由包含6～14個碳原子的單體組成。（R）-3HA-CoA可以由脂肪酸代謝產(chǎn)生，例如β-氧化和脂肪酸從頭生物合成途徑。當(dāng)脂肪酸通過β-氧化途徑時，會生成不同碳長度的（R）-3HACoA，隨后被PhaC聚合成MCL-PHA。PHA的多樣性主要歸因于PHA合酶（PhaC）的廣泛底物特異性［7］。PhaC是PHA生物合成中使用的最重要的酶，通常，PhaC可以很容易地接受3-羥酰基輔酶A、4-羥?；o酶A、5-羥?；o酶A，并將它們結(jié)合到不斷增長的PHA鏈中。

圖1 PHA的分子式及分類Fig.1 Molecular structure of PHA and its classification

近30年來，PHA的微生物合成跟隨代謝工程以及合成生物學(xué)的腳步得到了迅速發(fā)展。在“碳中和”的大背景下，以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)，PHA的生產(chǎn)傾向于以可再生資源作為原料，符合可持續(xù)發(fā)展的理念，同時縮短產(chǎn)業(yè)鏈長度，從而降低原材料成本占比和產(chǎn)品周期屬性。一些微生物菌種具備獨特代謝通路，可以使用各種廉價原料進行PHA生產(chǎn)［8］，比如蔗糖蜜［9］、向日葵莖水解物［10］、木 薯 和 玉 米 淀 粉［11］、植 物 油［12］、乳清［13-14］、米糠水 解 物［15］、粗甘油［16］、廢 煎炸油（菜籽油和芝麻油）［17］，以及廢棄物中提取的碳源［18］等。如將大腸桿菌乳糖降解基因重組到C.necatorDSM 545的解聚酶基因phaZ1中，使其能夠獲得乳清代謝能力，并除去PHA降解能力。重組菌株利用乳清滲透液可以生產(chǎn)含量達到30%的PHA［19］。

然而，目前合成各種高性能PHA的重要關(guān)鍵因素是合成途徑與方法是否有效，各種PHA單體合成路線是否具備高的碳轉(zhuǎn)化率，及各種PHA的產(chǎn)量、胞內(nèi)含量如何。因此，分析各種PHA單體的代謝途徑，以及各種PHA的理論碳轉(zhuǎn)化率（也就是碳得率，即起始底物中的碳原子轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物中碳原子的比例，不同于糖酸轉(zhuǎn)化率）非常必要。

1 PHA所含不同單體的理論碳轉(zhuǎn)化率及實現(xiàn)策略

目前，PHA的生物制造成本仍然很高，PHA共聚物的成本則更高；其低碳綠色生產(chǎn)仍然是工業(yè)面臨的挑戰(zhàn)。而這其中最重要的一個原因是PHA單體的固有理論碳轉(zhuǎn)化率較低。在分析大部分PHA單體生物合成時我們發(fā)現(xiàn)，某些單體的碳理論轉(zhuǎn)化率比較高。這不僅有利于提高產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的實際轉(zhuǎn)化率，降低成本，也會降低碳排放，實現(xiàn)低碳綠色生物制造。下面，我們將根據(jù)各種不同PHA單體的體內(nèi)合成途徑（圖2）與碳的理論轉(zhuǎn)化率（表1）來探討PHA共聚物低碳合成的原子經(jīng)濟性與提高策略。

表1 各類PHA單體的代表性合成途徑及生產(chǎn)Tab.1 Representative biosynthesis pathways and production of various PHA monomers

圖2 微生物合成PHA的代謝途徑［其中包括天然PHA單體（3HB、4HB、3HV、3HA、3HP單體）和代表性的非天然PHA（LA、GA、2HB單體）；3HP—3-羥基丙酸；3HP-CoA—3-羥基丙酰輔酶A；3HB-CoA—3-羥基丁酰輔酶A；3-HA-CoA—3-羥基酯酰輔酶A；3HV-CoA—3-羥基戊酰輔酶A；SSA—琥珀酸半醛；4HB—4-羥基丁酸；4HB-CoA—4-羥基丁酰輔酶A；2HB—2-羥基丁酸；2HB-CoA—2-羥基丁酰輔酶A］Fig.2 Metabolic pathways of microbial biosynthesis of PHA,including natural PHA monomers(3HB,4HB,3HV,3HA,3HP)and representative non-natural PHA monomers(LA,GA,2HB)

1.1 3-Hydroxybutyrate（3HB）單體

PHB首次在巨大芽孢桿菌中的類脂包裹體中被鑒定，被公認為PHA的第1個成員。PHB的生物合成操縱子phaCAB在C.necator中鑒定之后，一些重組代謝工程菌株顯示了高的生產(chǎn)效價和生產(chǎn)力［20-21］，可與天然產(chǎn)PHB的微生物如C.necator相媲美，分批發(fā)酵時細胞密度可達150 g/L以上，積累的PHB的胞內(nèi)含量可達80%以上。重組大腸桿菌還可以產(chǎn)生超分子量20 MDa形式的PHB［37］。然而，以葡萄糖合成PHB時因需要通過糖酵解丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶A，同時生產(chǎn)CO2，碳轉(zhuǎn)化率僅為0.66，產(chǎn)品的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率則僅有48%，所以合成3HB單體的碳排放高，成本也高，不是低碳生物合成的理想選擇。

1.2 3-Hydroxyvalerate（3HV）單體

以含3HV的聚酯為例，自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)在3HB單體中摻入3HV單體的PHBV共聚物有著更好的力學(xué)性能和加工性能以來，PHA共聚物的研究便受到越來越多的關(guān)注。PHBV最初是通過加入丙酸或戊酸鈉等前體在體內(nèi)生成丙酰輔酶A，即3HV的中間體來生產(chǎn)的［38-39］。為了避免使用此類昂貴前體，研究人員找到幾種不依賴丙酸鹽的體內(nèi)丙酰輔酶A合成途徑，包括蘇氨酸/2-酮丁酸途徑、檸蘋酸/2-酮丁酸途徑和甲基丙二酰CoA途徑，促進了從非相關(guān)碳源生產(chǎn)PHBV［25，40-43］。在不考慮其他因素的情況下，以葡萄糖從蘇氨酸途徑產(chǎn)3HV單體的理論碳轉(zhuǎn)化率為0.83。檸蘋酸途徑因其代謝過程碳損失較多，其理論轉(zhuǎn)化率為0.56。以葡萄糖從甲基丙二酰輔酶A途徑產(chǎn)3HV單體的理論轉(zhuǎn)化率也為0.83。

本實驗室在大腸桿菌中合成PHB時發(fā)現(xiàn)聚合物中有少許3HV組分的存在，通過挖掘大腸桿菌內(nèi)在的代謝途徑，設(shè)計了一條從蘇氨酸代謝途徑以葡萄糖為唯一碳源直接合成PHBV的合成途徑。通過過表達蘇氨酸合成酶的基因thrAC1035TBC并解除其反饋抑制使該菌株積累蘇氨酸，然后經(jīng)脫氨酶IlvA轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸，再經(jīng)丙酮酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A［22，43］，丙酰輔酶A與乙酰輔酶A最終縮合形成3HV-CoA；工程菌以葡萄糖為唯一碳源可以積累占細胞干重11.1%的PHBV，3HV摩爾分數(shù)可達17.5%。另外，通過檸蘋酸途徑，我們將丙酮酸與乙酰輔酶A通過Methanococcus jannaschii檸蘋酸合酶基因（cimA3.7）縮合形成檸蘋酸，然后利用大腸桿菌的leuBCD來產(chǎn)生3HV的前體2-酮丁酸，最終合成PHBV［24］。

另外，Aldor等［25］在重組鼠傷寒沙門氏菌中，克隆來自大腸桿菌的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因sbm和甲基丙二酰輔酶A脫羧酶基因ygfG，將TCA中的琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A，工程菌積累的PHBV中3HV摩爾分數(shù)達到30%。Chen等［44］在工程菌Halomonas bluephagenesisTY194中采用基因組插入等一系列策略提高琥珀酰輔酶A含量，工程菌在葡萄糖和葡萄糖酸鹽中利用甲基丙二酸途徑可以積累大約4 g/L的PHBV以及摩爾分數(shù)高達25%的3HV。近年來，一些蘇氨酸轉(zhuǎn)化3HV代謝通量較高的天然生產(chǎn)菌被開發(fā)出來，如工程巨大芽孢桿菌NRRL B-14308以葡萄糖生產(chǎn)PHBV產(chǎn)量為6.6 g/L，其3HV單體的摩爾分數(shù)高達58%［45］；另外，Saito等［46］將phaCAB操縱子整合至產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌WM001，其通過蘇氨酸途徑生產(chǎn)PHBV的產(chǎn)量為15 g/L，其中最大3HV摩爾分數(shù)可達72.5%。如果以此單體比例計算，該PHBV的最大理論碳轉(zhuǎn)化率為0.78，遠大于PHB均聚物0.66的理論碳轉(zhuǎn)化率。因此，3HV生產(chǎn)優(yōu)選蘇氨酸/甲基丙二酰輔酶A途徑，PHBV共聚物中3HV含量越高，其碳的轉(zhuǎn)化率則越高，生物制造的成本就越低。

1.3 4-Hydroxybutyrate（4HB）單體

在3HB單體中加入4HB可大大提高P（3HBco-4HB）共聚物的柔韌性［46-47］，4HB單體的合成通常需要提供前體γ-丁內(nèi)酯和丁酸［46］。1996年，從Clostridium kluyveri中發(fā)現(xiàn)了4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶基因orfZ，該基因可以將CoA轉(zhuǎn)移到4-羥基丁酸［48］，這使得在工程菌中進行4HB生物合成成為可能。之后Valentin等、Li Zhengjun等［26，49］分別利用TCA循環(huán)中間體琥珀酸通過琥珀酰輔酶A：輔酶A轉(zhuǎn)移酶、琥珀酸半醛脫氫酶（SucD）、4-羥基丁酸脫氫酶（4hbD）和CoA轉(zhuǎn)移酶來合成4HBCoA，實現(xiàn)了在大腸桿菌中從葡萄糖直接合成含4HB的共聚物。理論上以葡萄糖通過TCA循環(huán)還原羧化產(chǎn)琥珀酰輔酶A，可大大提高4HB單體的理論碳轉(zhuǎn)化率至1.33，而通過TCA氧化支路合成琥珀酰輔酶A時，其理論轉(zhuǎn)化率僅為0.66，與PHB相同。因此在選擇合成此類共聚物時，選擇合適的代謝途徑也是非常重要的。

但是目前合成含4HB的共聚物主要以氧化支路進行。大腸桿菌中琥珀酸半醛脫氫酶基因sad和gabD的失活可使共聚物中的4HB含量提高11%［26］；在發(fā)酵罐中，工程菌獲得了占細胞干重62.7%的P（3HB-co-12.5% 4HB）共聚物。Ye等［27］構(gòu)建的工程菌Halomonas bluephagenesis以葡萄糖作為單一碳源可以高產(chǎn)約16 g/L的P（3HB-co-4HB）共聚物，其中4HB摩爾分數(shù)可以通過控制培養(yǎng)物中殘留的葡萄糖濃度提高至25%。4HB的高理論碳轉(zhuǎn)化率是基于CO2的羧化固定，即利用TCA的還原支路來提供琥珀酰輔酶A。目前這方面的研究還比較少，但對于大幅提高4HB的碳轉(zhuǎn)化率具有非常重要的意義。

1.4 3-Hydroxypropionate（3HP）單體

當(dāng)利用3HP、α，ω-鏈烷二醇或丙烯酸酯作為底物碳源時，可以合成含有3HP單體的聚酯［50-51］，該種聚合物被認為具有更高的剛性、延展性和穩(wěn)定性。已經(jīng)開發(fā)了以葡萄糖或甘油為唯一碳源合成含3HP聚合物的體內(nèi)代謝合成途徑：以葡萄糖生成3HP時在乙酰輔酶A處釋放的CO2可以在羧化酶作用下固定回來，整個反應(yīng)過程中沒有碳損失。而甘油作為C3化合物經(jīng)兩步反應(yīng)就可以生成3HPCoA。兩種碳源的理論碳轉(zhuǎn)化率都可達到1，因此，3HP也是低碳合成PHA的理想單體。

2008年，研究者首次通過引入Chloroflexus aurantiacus3HP/4HB循環(huán)的丙二酰輔酶A還原酶（MCR）和三功能丙酰輔酶A合酶（Acs）的3HPCoA合成酶結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)了從葡萄糖合成P（3HPco-3HB）［52］。之后，Wang等［28］利用大腸桿菌克隆乙酰輔酶A羧化酶AccABCD、來自C.aurantiacus的MCR、丙酰輔酶A合成酶PrpE和PhbC，實現(xiàn)了從葡萄糖生產(chǎn)P3HP均聚物，聚合物含量為1.32 g/L。該途徑關(guān)鍵酶MCR的系統(tǒng)優(yōu)化是提高丙二酸單酰輔酶A途徑產(chǎn)量的關(guān)鍵，通過MCR不同功能域的拆分以及MCR-N和MCR-C表達水平的調(diào)節(jié)，可實現(xiàn)該途徑中3HP的高產(chǎn)。另外，工程大腸桿菌引入甘油脫水酶DhaB1、鼠傷寒沙門氏菌LT2的丙醛脫氫酶PduP以及PHA合酶PhbC，重組菌可以甘油積累1.42 g/L的P3HP均聚物［16］。Wang等［53］實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)和單體比例可控的3HB和3HP共聚物的生產(chǎn)，將3HP-CoA和3HB-CoA的合成分別受到兩種調(diào)節(jié)系統(tǒng)順序控制，以甘油為碳源合成了無規(guī)和嵌段共聚物P（3HB-co-3HP），3HP單體的摩爾分數(shù)可以從11.5%調(diào)節(jié)至94.6%。共聚物中3HP含量越高，其理論碳轉(zhuǎn)化率越接近1。Gao等［54］采用染色體整合的方法以及構(gòu)建氨基酸營養(yǎng)缺陷型PAS質(zhì)粒的方法，構(gòu)建了一個遺傳穩(wěn)定的菌株來整合和攜帶P3HP合成基因，通過對甘油途徑關(guān)鍵酶的篩選實現(xiàn)了有氧條件下P3HP的產(chǎn)量顯著提高至25.7 g/L。

1.5 2-Hydroxypropionate（LA）單體

由2-羥基脂肪酸如2-羥基丁酸（2-hydroxybutyrate，2HB）、乳酸（LA）、乙醇酸（glycolate，GA）組成的PHA聚酯可以被認為是具有代表性的非天然PHA，這些聚酯具有低毒性和良好的機械性能，包括高強度和高模量［55］，因此適用于再生醫(yī)學(xué)中使用的藥物遞送載體和組織器官支架［56］。聚乳酸（PLA）的微生物合成也是一個可以實現(xiàn)理論碳轉(zhuǎn)化率為1的聚酯。葡萄糖通過糖酵解直接產(chǎn)生丙酮酸，然后還原產(chǎn)生乳酸LA，其從葡萄糖的理論碳轉(zhuǎn)化率為1。因此也是較理想的單體選擇。

含LA聚酯的合成主要取決于輔酶A轉(zhuǎn)移酶和聚合酶PhaC，研究者對假單胞菌來源底物范圍 寬 泛 的phaCMBEL6-19和phaCPs61-3的Glu130、Ser325、Ser477和Gln481位點進行了雙、三和四突變，獲得了對LA-CoA的活性顯著增加的突變體，使重組大腸桿菌可以產(chǎn)生LA摩爾分數(shù)為19%～49%的P（3HB-co-LA）［57］。另外，來自PseudomonasputidaKT2440、Pseudomonas aeruginosaPAO1、Pseudomonas stutzeri等的PhaC都被設(shè)計為通過這4個氨基酸位點的定點誘變接受LA-CoA［58-59］。另外，很多輔酶A轉(zhuǎn)移酶已通過進化工 程來 合成LA-CoA。Yang等［57］將 來自Clostridium propionicum的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（Pct）基因進行隨機誘變獲得了突變體Pct532（Ala243Thr，A1200G）和Pct540（Val193Ala，T78C、T669C、A1125G和T1158C），可以接受LA單體使聚酯的產(chǎn)量增加。為了使宿主具備從葡萄糖合成LA直接前體的能力，Jung等［29］刪除ackA和ppc提高乙酰輔酶A和丙酮酸的水平，增強ldhA表達以推動代謝流向LA。大腸桿菌可以從葡萄糖生產(chǎn)占細胞干重達46%（質(zhì)量分數(shù)）的P（3HB-co-LA），其中LA的摩爾分數(shù)從30%增加到60%。

1.6 2-Hydroxybutyrate（2HB）單體

為了以葡萄糖為碳源生產(chǎn)含2HB的聚酯，Park等［30］在大腸桿菌中構(gòu)建檸蘋酸途徑生成2-酮丁酸，同時表達Lactococcus lactis的D-2HA脫氫酶基因（panE）以將2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為2HB。從檸蘋酸途徑產(chǎn)2HB需要脫掉兩個碳，因此與3HB的結(jié)果類似，2HB的合成理論碳轉(zhuǎn)化率為0.66。

來自C.propionicum的Pct被發(fā)現(xiàn)也可以激活2HB、GA、3HP、4HB、5-羥基戊酸酯（5HV）和6-羥基己酸酯（6HHx）等各種HA［30-31，60］，用于產(chǎn)生一系列非天然聚酯，包括P（2HB-co-LA）和P（LA-co-GA）等。另外幾種丁酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（Bcts）也被開發(fā)將2HB和LA轉(zhuǎn)化為2HB-CoA和LA-CoA［61］。利用Pct540Cp和聚合酶PhaC1437Ps6-19，大腸桿菌可以以葡萄糖作唯一碳源生產(chǎn)聚合物P（3% 2HB-co-96% 3HB-co-1% LA）（摩爾分數(shù)），其含量占細胞干重的74%（質(zhì)量分數(shù)），但是2HB含量較低［30］。因此從目前的代謝途徑和理論轉(zhuǎn)化率來看，2HB單體的合成并不具有明顯優(yōu)勢。

1.7 Glycolate/2-hydroxyacetate（GA）單體

為了從非相關(guān)碳源生產(chǎn)含GA的聚酯，在大腸桿菌中開發(fā)了兩種不同的代謝途徑。第1個是異源Caulobacter crescentus的木糖分解代謝途徑——Dahms途徑，通過木糖的5次直接酶促轉(zhuǎn)化合成GA，此時碳轉(zhuǎn)化率為0.4；生成的另一分子丙酮酸可以用于產(chǎn)生另一種單體如LA，這時木糖生產(chǎn)PLGA共聚物的理論碳轉(zhuǎn)化率為1。Choi等［31］將木糖脫氫酶基因xylBccs和木糖內(nèi)酯酶基因xylCccs引入大腸桿菌產(chǎn)生GA；另外發(fā)現(xiàn)編碼蘋果酸合酶和GA氧化酶的aceB、glcB和glcDEFG的缺失有助于增加GA產(chǎn)量；通過進一步提高LA的供應(yīng)和減少2HB產(chǎn)生，最終在分批補料發(fā)酵中，從葡萄糖和木糖可以產(chǎn)生含有摩爾分數(shù)29.51%GA的PLGA，產(chǎn)量高達細胞干重的36.2%（質(zhì)量分數(shù)）［31］。該PLGA重組大腸桿菌可以生產(chǎn)各種基于PLGA的共聚物，分別含有3HB、4HB、5HV、6HHx等單體。Choi等［62］通過精細調(diào)節(jié)降低Dahms通路通量，以木糖作為唯一碳源，經(jīng)分批補料培養(yǎng)可增強PLGA的產(chǎn)量達到6.93 g/L，其中GA摩爾分數(shù)達到14.6%。

用于合成含GA聚酯的第2種代謝途徑是乙醛酸分流途徑［32，64］。核心策略是增強乙醛酸還原酶ycdW基因表達以有效地將乙醛酸轉(zhuǎn)化為GA，同時增強異檸檬酸裂解酶和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶aceAK基因表達以增加乙醛酸庫，同時刪除glcD防止GA轉(zhuǎn)化為乙醛酸。理論上，從葡萄糖通過乙醛酸分流生成GA的理論轉(zhuǎn)化率為0.66。工程大腸桿菌從葡萄糖以phaC1Ps61-3（Ser325Thr、Gln481Lys）、M.elsdenii的pct和C.necator的phaAB來生產(chǎn)P（LA-co-GA-co-3HB）時，GA摩爾分數(shù)達1.5%～39.0%，聚酯質(zhì)量分數(shù)達到55.9%［32］。此外，含有SucD和4HbD組成4HB合成途徑的菌株可以從葡萄糖生產(chǎn)四聚體P（LA-co-GA-co-3HBco-4HB），聚合物質(zhì)量分數(shù)高達52.6%［63］。因此，GA單體需結(jié)合另一種單體的合成來形成共聚物才能實現(xiàn)較高理論碳轉(zhuǎn)化率，對于GA單體的合成還需進一步的深入研究。

1.8 MCL-3HA單體

MCL-PHA，由于其在柔韌性、韌性和加工性方面的優(yōu)異性能而引起了相當(dāng)大的關(guān)注。

由3-hydroxyhexanoate（3HHx）構(gòu)成的聚酯具有較低的熔點、較低的楊氏模量和較高的斷裂伸長率（高達850%），這使其成為一種更堅韌、更柔韌的塑料［64］。因此共聚物P（3HB-co-HHx）廣泛應(yīng)用于各種組織工程材料［65］。使得利用工程菌生產(chǎn)只含3HHx單體的SCL-co-MCL PHA共聚物成為可能。與3HB單體類似，從葡萄糖經(jīng)過丁酰輔酶A的人工途徑合成3HHx的碳轉(zhuǎn)化率為0.66。以葡萄糖等廉價非相關(guān)碳源生產(chǎn)P（3HB-co-HHx）需構(gòu)建人工途徑［33，66］，從3個乙酰輔酶A分子構(gòu)建C6單體，即通過巴豆酰輔酶A還原酶形成丁酰輔酶A，然后乙酰輔酶A與丁酰輔酶A縮合提供3HHx-CoA中間體。來自Aeromonas caviae等菌的聚合酶PhaC和烯酰CoA水合酶PhaJ對3HB-CoA和3HHx-CoA具有高度底物特異性［67］。工程菌可以合成占細胞干重75.3%（質(zhì)量分數(shù)）的P（3HBco-HHx），其中含有摩爾分數(shù)12%的3HHx［34］。以脂肪酸或者油脂作為碳源生產(chǎn)P（3HB-co-HHx）的天然生產(chǎn)菌也較多［68］，這里不再過多討論。

利用非相關(guān)碳源，MCL-PHA可以通過脂肪酸從頭生物合成途徑或反向脂肪酸β-氧化途徑天然合成［69］。以葡萄糖合成關(guān)鍵前體乙酰輔酶A然后進行從頭合成，因此3HA單體的碳理論轉(zhuǎn)化率為0.66，與3HB的轉(zhuǎn)化率相當(dāng)。但實際上由于MCLPHA的合成路線很長，需要經(jīng)過多輪循環(huán)，其實際的底物轉(zhuǎn)化率會比0.66低很多。

通過引入來自惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)?；富騪haG，大腸桿菌可以通過從葡萄糖從頭生物合成占2%～3%細胞干重的MCL-PHA［35，70］。不同類別PHA聚合酶PhaC通常只接受SCL或者MCL單體，為擴展微生物合成SCL-co-MCL PHA共聚物的能力，研究者將Pseudomonas sp.MBEL 6-19的PhaC和Pseudomonassp.61-3的PhaC經(jīng)過酶分子改造之后能夠接收SCL-HA-CoA作為底物，然后利用脂肪酸從頭合成途徑促進了使用葡萄糖生產(chǎn)SCLMCL-PHA［71-72］。類似地，表達fabH和phaC Ps.61-3的重組大腸桿菌可以在脂肪酸生物合成途徑中將丙二酰-ACP與乙酰輔酶A縮合［73］從葡萄糖產(chǎn)生包含3HB、3HHx和3HO的PHA［74］。在重組大腸桿菌LS5218中表達PhaC161-3、PhaG、PhaAB和來自P.aeruginosaPAO的CoA連接酶PA3924，可以從葡萄糖生產(chǎn)P（94.6% 3HB-co-5.4% MCL-3HA）（摩爾分數(shù)）［72］。2014年，本實驗室［36］首次實現(xiàn)在大腸桿菌中從葡萄糖通過反向脂肪酸β-氧化循環(huán)合成MCL-PHA。該反向途徑直接利用乙酰輔酶A及輔酶A硫酯中間體進行酰基鏈延長（而不是?；鵄CP），通過刪除主要硫酯酶，過表達fadBA、齒垢螺旋體的ter、烯酰輔酶A水合酶PhaJ1Pa，重組大腸桿菌能夠?qū)⒎聪蛑舅幡?氧化循環(huán)產(chǎn)生的烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-HA-CoA，從而產(chǎn)生質(zhì)量分數(shù)6.62%的MCL-PHA，使用P.stutzeri1317的PhaC，重組菌合成了12.10%（質(zhì)量分數(shù)）細胞干重的P（21.18%3HB-co-78.82%3HA）共聚物（摩爾分數(shù)）。另外，在生物合成中，微生物利用葡萄糖等非相關(guān)碳源合成MCL-PHA的能力比較弱，聚酯的細胞內(nèi)含量較少。

因此，我們認為MCL-PHA是目前最不適合用葡萄糖實現(xiàn)低碳生物合成的可降解塑料。然而從不同碳源的角度講，由于MCL-PHA中的單體主要是中長鏈脂肪酸，以廉價的脂肪酸或者油脂作為碳源生產(chǎn)MCL-PHA是比較合適的選擇，碳損失少，碳的理論轉(zhuǎn)化率高。

2 人工低碳合成途徑提高PHA生物制造的碳轉(zhuǎn)化率

通過以上分析可以看出，影響PHA生物制造成本的因素除了發(fā)酵液中PHA的濃度，細胞內(nèi)PHA的含量之外，PHA的單體種類也決定著PHA合成的底物碳轉(zhuǎn)化率，進而影響PHA的制造成本。然而PHA單體及其合成途徑繁多，能否設(shè)計合理的策略和人工生物合成途徑，從根本上提高所有PHA的碳理論轉(zhuǎn)化率呢？

答案是肯定的。糖酵解或Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途徑是大多數(shù)生命系統(tǒng)中的基本代謝途徑，可將糖分解為丙酮酸，并提供ATP和還原力NADH。為了合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物包括PHA，丙酮酸必須脫羧為乙酰輔酶A，該脫羧步驟會在環(huán)境中釋放大量CO2，導(dǎo)致碳產(chǎn)率損失33%。這種浪費的CO2會大大降低生物基產(chǎn)品的整體經(jīng)濟性。糖酵解的這種天然限制受到了Liao研究組的挑戰(zhàn)，Bogorad等［75］構(gòu)建了一個“非氧化-糖酵解”途徑（NOG），該途徑依賴于磷酸酮醇酶（Fxpk）對糖磷酸的磷酸化裂解，不可逆地將F6P裂解為乙酰磷酸（AcP）和E4P，將Xu5P裂解為甘油醛-3-磷酸（GAP）和AcP，結(jié)合碳重排循環(huán)的轉(zhuǎn)醛醇酶（Tal）和轉(zhuǎn)酮醇酶（Tkt），最終經(jīng)過果糖-1，6-二磷酸酶（Fbp）從FBP中回收F6P。創(chuàng)建了1個以F6P作為輸入分子的循環(huán)途徑，從1個F6P不可逆地形成3個AcP，最終轉(zhuǎn)化為3個AcCoA，碳理論轉(zhuǎn)化率為1。然而，從生物技術(shù)的角度來看，NOG的潛力非常有限，無法制造除乙酸鹽以外的化合物。

本實驗室［76］針對上述問題提出了一種解決NOG途徑無法產(chǎn)生還原力的策略（圖3）。通過結(jié)合了EMP途徑、磷酸戊糖途徑（PPP）以及引入“bifid shunt”途徑，在體內(nèi)構(gòu)建了一個“EPBifido”途徑，該途徑以PPP的氧化分支產(chǎn)生NADPH，同時F6P和Xu5P被磷酸酮醇酶Fxpk分解 為AcP和E4P/GAP。E4P進入碳重排，GAP通過醛縮酶Fba將GAP和DHAP縮合為FBP被再循環(huán)為F6P。理論上，該途徑中如果66%的G6P通過PPP，1個葡萄糖可以產(chǎn)生2.66個AcCoA，碳的理論轉(zhuǎn)化率可達到0.88，比天然EMP途徑轉(zhuǎn)化率提高了33%。該EP-Bifido途徑的工程大腸桿菌不產(chǎn)生乙酸，并且釋放的CO2減少了50%～70%。當(dāng)EP-Bifido途徑用于生產(chǎn)PHB時，PHB的產(chǎn)率提高了145%，碳的實際轉(zhuǎn)化率從0.26提高至0.64。采用這種策略不僅可以降低制造成本，還可以降低碳排放，是未來PHA生物制造的方向。

另外，一個稱為“戊糖-雙歧-糖酵解”循環(huán)（PBG）的合成途徑在體外成功實現(xiàn)了通過乙酰輔酶A將葡萄糖轉(zhuǎn)化為PHB。Opgenorth等［77］設(shè)計了該PBG循環(huán)，該循環(huán)同樣利用磷酸酮醇酶Fxpk分解F6P和Xu5P以及通過PPP的氧化分支產(chǎn)生NADPH。不同的是利用磷酸果糖激酶PfkB可逆地催化FBP形成F6P，同時再生ATP。另外，作者補充了轉(zhuǎn)酮醇酶（Tkt）、轉(zhuǎn)醛醇酶（Tal）和核糖-5-磷酸異構(gòu)酶（Rpi），以及通過引入“NAD（P）H凈化閥”來調(diào)節(jié)NADPH的積累，實現(xiàn)NADPH的非化學(xué)計量途徑生產(chǎn)。利用該PBG循環(huán)，PHB的最大生產(chǎn)速率為0.7 g/（L·h），理論產(chǎn)率為90%。無細胞系統(tǒng)可以克服例如有毒中間體、由于競爭途徑和不良副產(chǎn)品而導(dǎo)致的低生產(chǎn)力，因此在工業(yè)規(guī)模上開發(fā)這樣的過程有很大的希望［78］。

3 利用一碳化合物直接進行PHA生產(chǎn)制造

從碳排放的角度去分析，直接利用一碳化合物生產(chǎn)制造PHA是解決低碳合成的終極策略。近年來也有很多利用氣體碳源如一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）以及甲醇（CH3OH）來生產(chǎn)PHA的研究（圖3）［79］。一些天然PHA生產(chǎn)菌，包括氫氧化細菌如C.necator、藍藻如集胞藻PCC6803和甲烷氧化菌如Methylocystis parvus和Methylocystis sp.GB25等，能夠通過發(fā)酵C1碳源產(chǎn)生PHA。

圖3 PHA生產(chǎn)的低碳及固碳生物合成途徑（低碳生物合成途徑包括如NOG途徑、EP-Bifido途徑等；固碳生物合成途徑包括卡爾文循環(huán)、絲氨酸途徑、5-磷酸核酮糖單磷酸途徑等。酶：Fxpk—F6P/Xu5P磷酸解酮酶；Tal—轉(zhuǎn)醛醇酶；Tkt—轉(zhuǎn)酮醇酶；Fbp—果糖-1，6-二磷酸；Fba—果糖-1，6-二磷酸醛縮酶；tpi—丙糖磷酸異構(gòu)酶；Rpe—核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶；Rpi—核糖-5-磷酸異構(gòu)酶；CODH—一氧化碳脫氫酶；FDH—甲酸脫氫酶；FTS—甲?；?四氫葉酸合酶；FTC—甲?；?四氫葉酸環(huán)化水解酶；MTD—亞甲基-四氫葉酸脫氫酶；MTR—亞甲基-四氫葉酸還原酶；MTF—甲基轉(zhuǎn)移酶；ACS—乙酰輔酶A合成酶；PRK—磷酸核酮糖激酶；GAPDH—3-磷酸甘油醛脫氫酶；PGK—磷酸甘油酸激酶；RuBisCO—核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶；MMO—甲烷單氧化酶；MDH—甲醇脫氫酶；H4MPTP—四氫甲烷蝶呤途徑；GlyA—絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶；MtkAB—蘋果酸硫激酶；Sga—絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶；Mcl—蘋果酰輔酶A裂合酶；6PGDH—6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；H6PS—己酮糖-6-磷酸合酶；H6PI—己酮糖-6-磷酸異構(gòu)酶；PGI—磷酸葡萄糖異構(gòu)酶；G6PDH—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。代謝物：F6P—果糖-6-磷酸；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr—丙酮酸；E4P—赤蘚糖-4-磷酸；S7P—景天庚酮糖-7-磷酸；R5P—核糖-5-磷酸；Ru5P—核酮糖-5-磷酸；X5P—木酮糖-5-磷酸；GAP—3-磷酸甘油醛；DHAP—磷酸二羥丙酮；FBP—果糖-1，6-二磷酸；Ribulose 1，5-BP—核酮糖-1，5-二磷酸；1，3-BP-glycerate—1，3-二磷酸甘油酸；6P-Gluconate—6-磷酸葡萄糖酸；Hexulose-6P—己酮糖-6-磷酸；AcP—乙酰磷酸；Ac-CoA—乙酰輔酶A；Formyl-THF—甲?；?四氫葉酸；Methenyl-THF—亞甲基四氫葉酸；Methylene-THF—亞甲基四氫葉酸；Methyl-THF—甲基-四氫葉酸；Methyl-CoFeS-P—甲基類咕啉鐵硫蛋白）Fig.3 Low carbon and carbon sequestration biosynthetic pathways for PHA production(Low carbon biosynthesis pathways include NOG pathway,EP-bifido pathway,etc.Carbon sequestration biosynthesis pathways include Calvin cycle,serine pathway,ribulose 5-phosphate monophosphate pathway,etc)

C.necator可以利用H2作為電子供體和O2作為電子受體，將CO2還原為二磷酸核酮糖的中間體或反向三羧酸循環(huán)中的分子［80］。在自養(yǎng)和限氧生長條件下的補料分批發(fā)酵中，C.necator能累積61.9 g/L的PHB，生產(chǎn)率為1.55 g/（L·h）［81］。此外，當(dāng)使用CO2作為唯一碳源時，C.necatorH16可生產(chǎn)含量高達細胞干重63%的共聚物P（3HB-co-3HV-co-3HHx），產(chǎn)量為5.8 g/L［82］。最近，一株自產(chǎn)乙醇梭菌菌株Clostridium autoethanogenum引入PHB合成基因后可將合成氣CO/CO2（含H2）轉(zhuǎn)化為PHB［83］。許多藍藻細胞可以以CO2作為唯一碳源自身生物合成PHB：集胞藻Synechocystissp.PCC6803可以在光驅(qū)動的Calvin-Benson-Bassham（CBB）循 環(huán) 下 利 用CO2自 然 地 積 累PHB［84］，Carpine等［85］通過工程化引入磷酸酮醇酶基因fxpk，同時缺失pta和ach，在光生物反應(yīng)器中直接從CO2發(fā)酵生產(chǎn)PHB，fxpk的引入使PHB產(chǎn)量增加6倍，最終產(chǎn)量達到232 mg/L，占細胞干重的12%。

甲烷營養(yǎng)菌株Methylocystissp.GB 25 DSMZ 7674通過雙階段發(fā)酵能夠在短暫的非無菌過程中積累PHB。在70 L生物反應(yīng)器中，經(jīng)過連續(xù)生長期（稀釋率0.17 h-1）和分批培養(yǎng)中必需營養(yǎng)素缺乏條件下的PHB積累階段，可以生產(chǎn)占細胞干重51%的PHB［86］。另外，甲基營養(yǎng)菌可以利用甲醇通過絲氨酸途徑生產(chǎn)PHA，如M.extorquensATCC 55366以甲醇作為唯一碳源在115 g/L的高細胞密度下，生產(chǎn)含量高達細胞干重46%的PHB［87］。重組M.extorquensAM1以甲醇為唯一碳源可以積累由3HB、3HV和3HHx組成的共聚物［88］。研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中鈷離子（Co2+）的濃度會影響聚合物的生長速度和積累，在低鈷濃度下，3HV被摻入到所產(chǎn)生的共聚物中，從而產(chǎn)生含有6%3HV的P（3HB-co-3HV）。通過引入A.caviae的phaC基因，該基因可以接受SCL-HA-CoA和MCL-HA-CoA，發(fā)現(xiàn)可以從甲醇合成P（3HB-co-3HV-co-3HHx）。Yin等［89］從 油 田 中 分 離 出 一 株 甲 基 桿 菌Methylobacteriumsp.1805，該細菌可以以甲醇為唯一碳源生產(chǎn)獲得0.55 g/L的PHB。雖然目前這些研究還不能實現(xiàn)規(guī)?；珵閷淼腜HA的工業(yè)化發(fā)展打下了基礎(chǔ)。

4 總結(jié)與展望

在“雙碳”目標(biāo)的指引下，低碳生物合成成為綠色制造的關(guān)鍵。以生物基塑料PHA為例，與傳統(tǒng)合成塑料相比，PHA能夠把生命周期碳排放降低90%，1根PHA吸管比PP吸管的碳排放低180 g。近年來全球推行的禁/限塑令也成為生物基塑料啟動的催化劑。PHA的微生物綠色制造，其原料豐富且可再生，過程綠色智能可控且條件溫和，產(chǎn)品種類也越來越豐富。以PHA作為新產(chǎn)品驗證正是開啟工業(yè)化脫碳、替代傳統(tǒng)石化塑料的大好時機，市場潛力無可估量。

降低成本仍然是生物可降解塑料發(fā)展的動力。分析各種PHA的理論碳轉(zhuǎn)化率有助于篩選適合的PHA單體類型、提高底物利用，降低成本，還可以減少生產(chǎn)過程的碳排放，助力“雙碳”目標(biāo)的實現(xiàn)。當(dāng)然，文中PHA單體的理論轉(zhuǎn)化率計算是基于不考慮細胞還原力等因素的碳的最大轉(zhuǎn)化率，實際的底物轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)目前在文獻報道中列出的較少，大部分的數(shù)據(jù)體現(xiàn)的是PHA中各種單體的組成以及PHA的細胞內(nèi)含量。實際轉(zhuǎn)化效率跟各種PHA合成過程中實際采用的途徑以及該途徑PHA合成的效率有關(guān)，隨著PHA產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展和PHA產(chǎn)量的不斷提高，今后人們也會越來越多地關(guān)注PHA的實際轉(zhuǎn)化效率。

PHA的生物合成的前體是以乙酰輔酶A為主。而從葡萄糖合成乙酰輔酶A的脫羧過程會涉及碳損失。因此，設(shè)計開發(fā)新型的人工低碳途徑，減少CO2的排放并提高前體的碳轉(zhuǎn)化率；同時提高一碳化合物的有效利用和轉(zhuǎn)化，仍然是未來需突破的關(guān)鍵技術(shù)。利用代謝工程與合成生物學(xué)方法對產(chǎn)PHA底盤細胞改造［90］，通過從細胞的整體代謝網(wǎng)絡(luò)著手，調(diào)控和優(yōu)化代謝途徑，提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。

另外，PHA的價格控制可從多方面降低成本，如選擇廉價糖類或者廢棄物為底物；選用特殊底盤菌如嗜鹽菌來生產(chǎn)，可節(jié)省高溫高壓蒸汽滅菌的設(shè)備與能量消耗，降低發(fā)酵生產(chǎn)過程中的耗能?？傊陨螾HA合成的方法策略分析與技術(shù)開發(fā)對于開啟PHA的低碳綠色生物制造的工業(yè)化進程具有深遠意義。