基于表面涂層益生菌的腫瘤抗原口服遞送系統(tǒng)

林思思，潘超，張一帆，劉盡堯，

（1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海市腫瘤研究所，上海 200011；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，分子醫(yī)學(xué)研究院，上海 200127）

腫瘤疫苗是一種新興腫瘤免疫療法，被視為是腫瘤防治的重要手段之一［1-2］。盡管轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、計(jì)算建模和材料工程等新技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了腫瘤疫苗的發(fā)展，但是許多基礎(chǔ)研究顯示有效的腫瘤疫苗其臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想［3-4］。一個(gè)重要的原因是盡管皮下或靜脈注射是遞送腫瘤抗原的常用手段，但由于淋巴組織對(duì)腫瘤抗原的攝取有限，皮下或靜脈注射方式難以誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)［5］。胃腸道具有人體最大的黏膜表面，并且涵蓋了人體70%的免疫細(xì)胞，因此胃腸道不僅是重要的消化吸收器官，也被認(rèn)為是人體最大的免疫器官［6-7］?？诜T導(dǎo)的黏膜免疫反應(yīng)具有劑量小、高效、維持時(shí)間長(zhǎng)、操作方便、患者依從性好等優(yōu)勢(shì)［8］。然而現(xiàn)有的口服疫苗主要局限于病原體感染及其相關(guān)性疾病的預(yù)防，如新冠病毒口服疫苗［9-14］。此外，現(xiàn)有口服腫瘤疫苗的研究主要以胃腸道腫瘤的防治為主，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道外其他腫瘤的防治［15-17］。這主要?dú)w因于，一方面腫瘤疫苗成分難以克服胃腸道的特殊環(huán)境（胃部酸性、胃腸道富含酶類和膽汁酸）而發(fā)生降解；另一方面抗原難以在腸道淋巴系統(tǒng)富集或跨越腸屏障進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)。這兩方面的因素是制約口服腫瘤疫苗發(fā)展的重要因素［17-19］，因此迫切需要發(fā)展新的藥物遞送系統(tǒng)以克服上述口服腫瘤疫苗所面臨的難題。為了實(shí)現(xiàn)有效的腫瘤抗原遞送并誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，該系統(tǒng)需滿足在保護(hù)抗原不被降解的同時(shí)能夠在腸道淋巴系統(tǒng)富集或跨越腸屏障，并且所裝載的抗原能夠有效被免疫細(xì)胞攝取和遞呈。

微皺褶細(xì)胞，又稱M細(xì)胞，是位于派氏結(jié)上端的吞噬性腸上皮細(xì)胞［20］。派氏結(jié)內(nèi)含有豐富的樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，并且派氏結(jié)進(jìn)一步與腸系膜淋巴結(jié)相連，因此抗原通過M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入派氏結(jié)后，被樹突狀細(xì)胞攝取，樹突狀細(xì)胞一方面可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化，產(chǎn)生大量分泌型免疫球蛋白［21-22］，另一方面派氏結(jié)中的樹突狀細(xì)胞可進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至腸系膜淋巴結(jié)，在腸系膜淋巴結(jié)中將抗原遞呈給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。與其他腸上皮細(xì)胞不同，M細(xì)胞表面缺乏黏液，因此相比于其他腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，M細(xì)胞吞噬能夠更加高效地實(shí)現(xiàn)抗原在淋巴系統(tǒng)的富集［23-24］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞膜因其表面含有與M細(xì)胞表面Dectin-1受體結(jié)合的β-葡聚糖，能夠在保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境刺激的同時(shí)進(jìn)一步靶向M細(xì)胞，將益生菌遞送至派氏結(jié)，并誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群的作用［25］。由此可見，該載藥體系有望為腫瘤抗原的口服遞送提供新機(jī)遇。在本文中，我們通過化學(xué)修飾將模式抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）搭載于細(xì)菌表面，并將細(xì)菌進(jìn)一步包裹于酵母細(xì)胞膜中。所制備的抗原口服遞送系統(tǒng)命名為YM-EcN@OVA。OVA是雞蛋蛋白中的主要成分，具有免疫原性、較好的穩(wěn)定性以及成熟的提取工藝等特征，因此作為一種腫瘤模式抗原，被廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫研究［26-28］。我們前期研究中通過化學(xué)共價(jià)鍵合、靜電作用、物理擠出等方式已實(shí)現(xiàn)細(xì)菌表面的多樣化官能團(tuán)修飾［29-32］。本研究采用兩步法，先通過靜電作用將OVA搭載于益生菌表面，然后采用物理擠出方法使細(xì)菌包裹上酵母細(xì)胞膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與EcN相比，YM-EcN@OVA對(duì)體外模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸具有更高的耐受性，并且能夠更有效地在派氏結(jié)中富集。此外，YM-EcN@OVA能夠有效促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原遞呈。與給予OVA和EcN灌胃的小鼠相比，YM-EcN@OVA干預(yù)的小鼠血漿卵清蛋白特異性免疫球蛋白抗體（Ovalbumin specific immunoglobulin G，OVA-IgG）水平顯著性提高。這些結(jié)果表明，該遞送系統(tǒng)能夠有效保護(hù)益生菌和抗原免受胃腸道環(huán)境刺激而失活的同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗原的腸道淋巴系統(tǒng)富集，并進(jìn)一步誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

釀酒酵母、大腸桿菌屬Nissle 1917（E.coliNissle 1917，EcN）、異丙醇、丙酮、鹽酸、磷酸二氫鉀、胃蛋白酶、NaOH、胰蛋白酶、LB培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清、FITC標(biāo)記的OVA、APC-OVA流式抗體、PE-MHCⅡ流式抗體。

1.2 酵母細(xì)胞膜的制備

將20 g釀酒酵母懸浮在300 mL的1 mol/L NaOH溶液中。將懸浮液80℃加熱2 h后，4000 r/min離心5 min。沉淀物用去離子水洗滌2次后，用pH 4的鹽酸重懸沉淀物，并于60℃攪拌孵育2 h。3000 r/min離心5 min后，用去離子水沖洗沉淀物2次，進(jìn)一步用異丙醇漂洗沉淀物4次，最后用丙酮潤(rùn)洗2次。樣本離心棄上清后，將沉淀物置于通風(fēng)櫥過夜干燥。所收集的酵母微囊（10 mg/mL）進(jìn)一步在室溫下用直徑為300～500 μm的玻璃珠連續(xù)振蕩2 h以制備酵母細(xì)胞膜。

1.3 YM-EcN@OVA的制備

將接種于含有卡那霉素抗生素LB培養(yǎng)基中的EcN置于37℃、200 r/min的環(huán)境中培養(yǎng)。4 h后，細(xì)菌樣本7000 r/min離心5 min，用200 μL 0.2 mol/L的氯化鈉溶液重懸細(xì)菌。向菌液中加入100 μL 10 mg/mL的氧化透明質(zhì)酸于室溫混勻20 min后，10 000 r/min離心10 min。進(jìn)一步用去離子水重懸細(xì)菌后，向菌液中加入1 mL 0.5 mg/mL的聚乙烯亞胺，于室溫混勻10 min。14 000 r/min離心30 min后，用去離子水重懸細(xì)菌沉淀并加入20 μL濃度為5 mg/mL的卵清蛋白，于室溫混勻30 min。樣本10 000 r/min離心5 min后用PBS重懸EcN@OVA。將酵母細(xì)胞膜與搭載卵清蛋白的益生菌按體積比3∶7的比例混合，并于室溫混勻1 h。然后使用脂質(zhì)體擠出儀（Avanti Polar Lipids，USA）將混合物通過孔徑為1 μm的聚碳酸酯多孔膜連續(xù)擠出21次，隨后7000 r/min離心5 min，棄上清并用PBS重懸完成YM-EcN@OVA的制備。

1.4 材料表征

卡爾科弗盧爾熒光增白劑標(biāo)記的酵母細(xì)胞膜呈藍(lán)色熒光。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的卵清蛋白呈綠色熒光。轉(zhuǎn)染pBBR1MCS2-Tac-mCherry質(zhì)粒的EcN呈紅色熒光。通過激光共聚焦顯微鏡（TCS-SP8 SR，Leica，Japan）和流式細(xì)胞儀（BD Bioscience，BD，USA）分別對(duì)卵清蛋白的細(xì)菌搭載和酵母細(xì)胞膜的包覆進(jìn)行定性和定量分析。在48 μm孔徑銅網(wǎng)上分別滴加10 μL EcN、EcN@OVA和YM-EcN@OVA樣本。樣本室溫靜置30 min后，用濾紙吸取剩余的液體并用去離子水潤(rùn)洗2次。最后將銅網(wǎng)置于透射 電 鏡（Tecnai G2，Thermo Fisher Scientific，USA）。通過觀察細(xì)菌外貌形態(tài)的改變以分析抗原的搭載和酵母細(xì)胞膜的包覆情況。將樣本加入比色皿并通過使用動(dòng)態(tài)光散射儀（Zetasizer Nano ZS，Malvern，USA）測(cè)量樣本的粒徑和Zeta電位。

1.5 益生菌對(duì)模擬性腸胃液和膽汁酸的抵抗力

參考Pan等［30］和Li等［31］的方法配制模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸。將32.0 g NaCl和2 g胃蛋白酶溶解于1 L去離子水中，然后用稀鹽酸將溶液pH調(diào)節(jié)至2.0以配制模擬胃液。6.8 g KH2PO4溶解于250 mL去離子水中，然后向溶液中加入77 mL 0.2 mol/L濃度的NaOH溶液、10 g胰蛋白酶以及200 mL去離子水。上述溶液用稀釋的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8，從而配制模擬腸液。模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸（0.3 mg/mL）在使用前通過0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾。將含有等量細(xì)菌數(shù)量的EcN、EcN@OVA和YM-EcN@OVA樣本分別加入1 mL的模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸溶液中，在200 r/min、37℃環(huán)境下培養(yǎng)一定時(shí)間后以7000 r/min的速度離心5 min，并將沉淀物重懸在100 μL PBS中進(jìn)行涂板。LB瓊脂平板培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.6 腸腔注射

6～8周雄性C57/BL6J小鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物在溫度為25℃±2℃和濕度為55%±5%的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)至少1周后開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得上海交通大學(xué)動(dòng)物倫理的審批。參考Lin等［33］的方法，小鼠恩氟烷麻醉后，用小鼠剃毛刀剔除腹部毛發(fā)并用酒精棉球消毒。然后縱行剪開約1 cm切口并繼續(xù)沿腹白線縱行剪開以打開腹腔。在小鼠腹部放置1塊無菌生理鹽水潤(rùn)濕的紗布，然后用2根潤(rùn)濕的棉棒將小腸腸段從腹腔中取出置于紗布上。在距離派氏結(jié)兩側(cè)各約1 cm處各放置一段手術(shù)縫線，先結(jié)扎一側(cè)，另一側(cè)不結(jié)扎。用1 mL注射器以30°進(jìn)針后水平推進(jìn)針頭，進(jìn)針約占針頭2/3時(shí)，往腸腔中分別注射PBS、EcN@OVA和YM-EcN@OVA，其中EcN轉(zhuǎn)染了pBBR1MCS2-Tac-mCherry質(zhì)粒。注射1.5 h后，剪取腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行活體組織成像和細(xì)菌涂板，同時(shí)收集派氏結(jié)進(jìn)行細(xì)菌涂板。

1.7 小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)與刺激

小鼠脫臼處死后在75%乙醇中浸泡20 min。剪取小鼠后腿并分離出股骨和肱骨后，用剪刀和鑷子剔除骨頭周圍的肌肉組織。然后用1 mL注射器反復(fù)沖洗骨髓腔。用75 μm孔徑尼龍網(wǎng)過濾去除多余的組織后，將收集的骨髓液以1200 r/min離心5 min。用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞并室溫孵育5 min。細(xì)胞1200 r/min離心5 min后，用PBS洗滌細(xì)胞1次，并用含有1%雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于24孔板（1×106）并向培養(yǎng)基中加入重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（20 ng/mL）和白介素4（10 ng/mL）。細(xì)胞于37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后分別給予PBS、OVA（20 μg/mL）、5×106CFUs EcN、EcN@OVA和YM-EcN@OVA。刺激6 h后，細(xì)胞分別與APC-OVA和PE-MHCII抗體孵育?？贵w孵育30 min后，樣本離心棄上清，用PBS漂洗2次后重懸細(xì)胞于300 μL PBS中，然后用流式細(xì)胞儀（BD Bioscience，BD，USA）進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 血漿中小鼠卵清蛋白特異性IgG水平測(cè)量

小鼠連續(xù)7 d分別給予PBS、EcN、卵清蛋白、EcN@OVA和YM-EcN@OVA灌胃。灌胃后1周和2周，分別對(duì)小鼠進(jìn)行取血。5000 r/min、4℃離心15 min后收集血漿樣本，根據(jù)小鼠卵清蛋白特異性IgG酶聯(lián)免疫試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血漿中的卵清蛋白特異性IgG水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），并使用最小顯著性差異檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YM-EcN@OVA制備與表征

本研究采用層層自組裝的方法將卵清蛋白搭載于益生菌表面。然后進(jìn)一步采用物理擠出的方式，將搭載卵清蛋白的益生菌包裹于酵母細(xì)胞膜中。通過共聚焦顯微鏡觀察可見異硫氰酸熒光素標(biāo)記的卵清蛋白（綠色）能夠有效搭載于轉(zhuǎn)染pCMVmCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒的EcN（紅色）。搭載了卵清蛋白的EcN進(jìn)一步包裹于酵母細(xì)胞膜［卡爾科弗盧爾熒光增白劑標(biāo)記，藍(lán)色，圖1（a）］。此外，將樣本滴加于銅網(wǎng)，進(jìn)一步通過透射電子顯微鏡分別確認(rèn)卵清蛋白的搭載和酵母細(xì)胞膜的包裹。如圖1（b）所示，與裸菌相比，與卵清蛋白共孵育的細(xì)菌表面顯示出一層涂層。并且，酵母膜的包覆使得涂層進(jìn)一步增厚。納米粒徑和Zeta電位分析結(jié)果顯示包裹酵母細(xì)胞膜EcN的粒徑比裸菌增加了1倍［圖1（c）］。EcN的Zeta電位隨著卵清蛋白的搭載和酵母細(xì)胞膜的包覆由原來的-37.80 mV±0.36 mV分別提高至-28.23 mV±1.07 mV以及-5.95 mV±0.90 mV［圖1（d）］。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明卵清蛋白的搭載率高達(dá)68.0%［圖1（e）］，而酵母細(xì)胞膜的包裹率進(jìn)一步增加至80.6%［圖1（f）］。這些結(jié)果表明通過層層自組裝和物理擠出方法能夠有效地將模式抗原搭載于細(xì)菌表面并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的酵母細(xì)胞膜包裹。

圖1 YM-EcN@OVA表征（a）YM-EcN@OVA激光共聚焦代表圖。轉(zhuǎn)染mCherry質(zhì)粒的EcN顯示紅色熒光；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的卵清蛋白為綠色熒光；卡爾科弗盧爾熒光增白劑標(biāo)記的酵母細(xì)胞膜為藍(lán)色熒光；標(biāo)尺為10 μm。（b）EcN，EcN@OVA和YM-EcN@OVA代表性透射電鏡圖。第2排為局部放大圖，標(biāo)尺分別為500 nm（第1排）和200 nm（第2排）；白色虛線框?yàn)榧?xì)菌的邊緣；箭頭指示涂層所在區(qū)域。（c）EcN，EcN@OVA和YM-EcN@OVA的粒徑；（d）EcN，EcN@OVA和YM-EcN@OVA的Zeta電位；（e）EcN和EcN@OVA流式代表圖；（f）EcN@OVA和YM-EcN@OVA流式代表圖。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。**P<0.01 Fig.1 Characterization of YM-EcN@OVA(a)Typical laser scanning confocal microscopy images of YM-EcN@OVA.Red,green and blue channels show EcN expressing mCherry,fluorescein isothiocyanate-OVA,and yeast cell membranes stained with calcofluor-white,respectively;Scale bar:10 μm.(b)Representative transmission electron microscopy images of EcN,EcN@OVA,and YM-EcN@OVA,respectively.Scale bars:500 nmand 200 nm for the first and second row of the figure,respectively;The outer edge and coating layers of bacteria are indicated by white dotted line and arrows,respectively.(c)Size of EcN,EcN@OVA,and YM-EcN@OVA,respectively;(d)Zeta potential of EcN,EcN@OVA,and YM-EcN@OVA,respectively;(e)Flow cytometric analysis of EcN@OVA.(f)Flow cytometric analysis of YM-EcN@OVA.Error bars represent standard deviation.**P<0.01

2.2 酵母細(xì)胞膜能夠保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境刺激

通過口服將搭載卵清蛋白的益生菌遞送進(jìn)入派氏結(jié)之前，細(xì)菌需要克服胃部酸性以及腸道中多種酶類和膽汁酸等特殊環(huán)境的刺激。足夠數(shù)量且具有活性的益生菌進(jìn)入腸道淋巴系統(tǒng)是誘導(dǎo)黏膜免疫的關(guān)鍵因素。因此首先評(píng)估酵母細(xì)胞膜能否保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境刺激。將細(xì)菌分別與體外模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸共同孵育一段時(shí)間后，取樣進(jìn)行細(xì)菌涂板。樣本培養(yǎng)24 h后，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示經(jīng)過體外模擬胃液、模擬腸液和膽汁酸刺激相同時(shí)間后，酵母細(xì)胞膜的包覆能進(jìn)一步提高益生菌對(duì)不利因素的抵抗能力。YMEcN@OVA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌數(shù)量明顯多于EcN和EcN@OVA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌數(shù)量（圖2）。上述結(jié)果表明酵母膜包覆能夠有效保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境的刺激。

圖2 YM-EcN@OVA在胃腸道中的穩(wěn)定性體外模擬胃液（a）、模擬腸液（b）以及膽汁酸（c）刺激一段時(shí)間后取樣進(jìn)行涂板和細(xì)菌培養(yǎng)24 h的EcN數(shù)量。SGF—模擬胃液；SIF—模擬腸液；CA—膽汁酸。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。**P<0.01，*P<0.05Fig.2 Stability of YM-EcN@OVA in simulated gastrointestinal environments(a)Survived EcN after treatment with SGF for 30 min,1 h,and 2 h,respectively.(b)Bacterial counts of EcN after culture with SIF for 1 h,2 h,and 4 h,respectively.(c)Numbers of survived EcN after cultivation with CA for 1 h,2 h,and 4 h,respectively.SGF—simulated gastric fluid;SIF—simulated intestinal fluid;CA—cholic acid.Error bars represent standard deviation.**P<0.01,*P<0.05

2.3 酵母細(xì)胞膜促進(jìn)益生菌的腸道淋巴系統(tǒng)富集

在確認(rèn)酵母細(xì)胞膜包覆能夠保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境刺激后，進(jìn)一步檢測(cè)益生菌能否有效進(jìn)入腸道淋巴系統(tǒng)。在包含有派氏結(jié)的腸段兩側(cè)進(jìn)行結(jié)扎后，向腸腔分別注射PBS、EcN@OVA和YMEcN@OVA。注射1.5 h后，小鼠處死并剪取派氏結(jié)進(jìn)行細(xì)菌涂板，收取腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行活體成像和細(xì)菌涂板。活體成像結(jié)果顯示，酵母細(xì)胞膜的包覆能夠顯著性提高細(xì)菌在腸道淋巴系統(tǒng)的富集。腸腔注射YM-EcN@OVA后，小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的活體成像熒光強(qiáng)度明顯高于腸腔注射PBS或EcN@OVA小鼠腸系膜淋巴結(jié)的熒光強(qiáng)度［圖3（a）、（b）］。細(xì)菌涂板結(jié)果同樣顯示，YM-EcN@OVA小鼠的派氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中的EcN數(shù)量明顯高于其他兩組小鼠［圖3（c）、（d）］。上述結(jié)果表明，借助酵母細(xì)胞膜能夠?qū)崿F(xiàn)向腸道淋巴系統(tǒng)靶向遞送搭載抗原的益生菌。

圖3 腸道淋巴組織中的EcN數(shù)量（小鼠腸腔分別注射PBS、EcN@OVA和YM-EcN@OVA，其中所使用的細(xì)菌為轉(zhuǎn)染pBBR1MCS2-Tac-mCherry質(zhì)粒的益生菌。腸腔注射1.5 h后，剪取腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行活體成像，隨后腸系膜淋巴結(jié)和派氏結(jié)分別進(jìn)行勻漿并涂板。MLNs—腸系膜淋巴結(jié)；PPs—派氏結(jié)。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。**P<0.01）Fig.3 Quantification of accumulated EcN(PBS,EcN@OVA,and YM-EcN@OVA were injected into the intestinal lumen of mice,respectively.EcN used in the experiment was transfected with pBBR1MCS2-Tac-mCherry.At 1.5 h post injection,fluorescence signals of MLNs were captured by in vivo imaging system(IVIS).Homogenates of MLNs and PPs were separately prepared for bacterial culture.MLNs,mesenteric lymph nodes;PPs,Peyer’s patches Error bars represent standard deviation.**P<0.01)

2.4 YM-EcN@OVA誘導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng)

確認(rèn)了酵母細(xì)胞膜包裹能夠保護(hù)益生菌免受胃腸道環(huán)境刺激并進(jìn)一步將益生菌遞送進(jìn)入腸道淋巴系統(tǒng)后，緊接著分別從細(xì)胞和動(dòng)物水平分析搭載了卵清蛋白的益生菌進(jìn)入淋巴系統(tǒng)后能否誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。骨髓來源樹突狀細(xì)胞分別用PBS、EcN、OVA、EcN@OVA和YM-EcN@OVA進(jìn)行刺激。如圖4（a）～（d）所示，培養(yǎng)一定時(shí)間后，YM-EcN@OVA能夠顯著促進(jìn)骨髓來源樹突狀細(xì)胞的活化與OVA的抗原遞呈效果。小鼠分別連續(xù) 灌 胃PBS、EcN、OVA、EcN@OVA和YMEcN@OVA 7 d。灌胃后1周和2周，分別取血進(jìn)行血漿中OVA-IgG水平的檢測(cè)。如圖4（e）、（f）所示，YM-EcN@OVA灌胃小鼠血漿中的OVA-IgG水平明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組［圖4（e）］。該免疫效應(yīng)能夠有效維持14 d［圖4（f）］。上述結(jié)果表明，YMEcN@OVA不僅能夠有效誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，還能夠誘導(dǎo)抗OVA的特異性免疫反應(yīng)。

圖4 YM-EcN@OVA對(duì)腸道免疫的調(diào)節(jié)作用。（BMDC受PBS、EcN、卵清蛋白EcN@OVA和YM-EcN@OVA刺激一段時(shí)間后，分別與APC-OVA抗體和PE-MHC II抗體進(jìn)行孵育，然后用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)OVA+和MHC II+的BMDC比例。BMDC，骨髓來源的樹突狀細(xì)胞；OVA-IgG，卵清蛋白特異性IgG。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。**P<0.01，*P<0.05）Fig.4 Immune responses mediated by YM-EcN@OVA(After stimulation with PBS,EcN,OVA,EcN@OVA,and YM-EcN@OVA,BMDC were incubated with APC-OVA and PE-MHC II antibodies,respectively.Cells were measured by FACS.BMDC,mouse bone marrow derived dendritic cells;OVA-IgG,ovalbumin specific IgG.Error bars represent standard deviation.**P<0.01,*P<0.05)

3 結(jié)果與討論

如何有效降低腫瘤的發(fā)生率和死亡率是急需解決的公共衛(wèi)生健康難題［34］。免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼性細(xì)胞療法和腫瘤疫苗被視為是腫瘤免疫療法的三駕馬車［35-37］。與免疫檢查點(diǎn)抑制劑和過繼性細(xì)胞療法不同，腫瘤疫苗除了能夠發(fā)揮清除腫瘤細(xì)胞的作用外，還具有預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)［36-37］。盡管目前腫瘤疫苗在科學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化方面取得了一定的進(jìn)展。同時(shí)這些疫苗主要為皮下或靜脈注射型疫苗，目前缺乏口服疫苗［4，8］。相比于皮下或靜脈注射的給藥方式，口服被視為是最簡(jiǎn)單、安全和高效的給藥方式。并且，腸道是人體最大的免疫器官，通過口服遞送抗原的方式不僅能夠誘導(dǎo)腸道黏膜免疫，隨著抗原的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，還能進(jìn)一步發(fā)揮激活系統(tǒng)性免疫的作用［7］。雖然口服腫瘤疫苗受到了廣泛關(guān)注，但其發(fā)展嚴(yán)重滯后，主要與腫瘤抗原容易在胃腸道中發(fā)生降解和難以穿過腸屏障進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)有關(guān)［4］。因此急需發(fā)展新的抗原遞送載體以實(shí)現(xiàn)腫瘤疫苗的口服遞送，進(jìn)而誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了酵母細(xì)胞膜包覆益生菌的口服遞送系統(tǒng)。通過層層自主裝的方式將抗原搭載于細(xì)菌表面。進(jìn)一步通過物理擠出方式將搭載了抗原的益生菌包裹于酵母細(xì)胞膜中。酵母細(xì)胞膜的包裹一方面保護(hù)了益生菌和抗原免受胃腸道環(huán)境的刺激，另一方面酵母細(xì)胞膜表面豐富的β-葡聚糖能夠與腸道M細(xì)胞表面的Dectin-1受體結(jié)合，進(jìn)而通過M細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗原向派氏結(jié)的有效遞送。由于派氏結(jié)與腸系膜淋巴相連，抗原經(jīng)過派氏結(jié)進(jìn)入腸系膜淋巴后能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至外周循環(huán)系統(tǒng)，從而激活外周免疫反應(yīng)。此外，M細(xì)胞表面缺乏黏液覆蓋，因此與其他覆蓋有黏液層的腸上皮細(xì)胞相比，靶向M細(xì)胞能夠更加高效地向腸道淋巴系統(tǒng)遞送抗原。與未包裹的益生菌相比，酵母細(xì)胞膜能夠提高益生菌在腸道免疫系統(tǒng)的富集，從而促進(jìn)抗原被樹突狀細(xì)胞攝取和遞呈，最終誘導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng)。此外，與單純的抗原、益生菌以及搭載抗原的益生菌相比，酵母膜包裹的抗原搭載益生菌能夠更有效地促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的激活和抗原遞呈，這可能與酵母細(xì)胞膜和益生菌同時(shí)具有免疫原性有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)展了一種新型口服遞送載體。該口服遞送載體不僅能夠保護(hù)益生菌和抗原免受胃腸道環(huán)境的刺激，還能夠?qū)崿F(xiàn)高效地向腸道淋巴系統(tǒng)遞送抗原，并同時(shí)發(fā)揮佐劑作用而更有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。