免疫親和高效液相色譜法結(jié)合二極管陣列 檢測(cè)器測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

◎ 莫秋云，陶劍恒，唐昭領(lǐng)

（賀州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 賀州 542800）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又稱(chēng)嘔吐毒素，是一種潛在致癌性霉菌毒素，是禾谷鐮刀菌侵染谷物時(shí)產(chǎn)生的B 型單端孢霉烯族毒素[1-2]。DON 在250 ℃下1 h 以上才能被完全降解[3]。谷類(lèi)作物在生長(zhǎng)、收割、倉(cāng)儲(chǔ)、加工、運(yùn)輸和銷(xiāo)售等諸多環(huán)節(jié)均可能產(chǎn)生霉變，因此DON 廣泛存在于受霉菌污染的小麥、大麥、玉米及其加工產(chǎn)品中[4]。DON 可抑制真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，既能引起急性中毒，也可造成慢性損害。動(dòng)物急性中毒主要表現(xiàn)為嘔吐、拒食、體質(zhì)量降低和腹瀉，人群DON 急性中毒癥狀包括惡心、嘔吐、胃腸紊亂、頭暈、頭痛和腹瀉，慢性中毒表現(xiàn)為攝食減少、生長(zhǎng)緩慢及血清免疫球蛋白水平改變[5-8]。

小麥?zhǔn)侨蚍N植面積最大、總產(chǎn)量最高，也是最為重要的糧食作物，全球有超過(guò)1/3 的人口以小麥制品為主食。在中國(guó)，小麥僅次于第一大糧食作物水稻，小麥及其制品的質(zhì)量安全直接關(guān)系到中國(guó)過(guò)半人口的食品安全[9]。我國(guó)在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中明確規(guī)定小麥粉中DON 的限量為1 000 μg·kg-1，DON 是糧食檢測(cè)中十分重要的安全指標(biāo)[10]。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法主要有4種，同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜測(cè)定法以及酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于小麥粉中DON 的測(cè)定主要為免疫親和層析凈化高效液相色譜法[11]。劉霞[12]對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》（GB 5009.111—2016）中高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行了驗(yàn)證，其測(cè)試的色譜條件為流動(dòng)相甲醇-水（20 ∶80，V/V），流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，線性和回收較好。姜云晶等[13]對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行了含量檢測(cè)，色譜條件為流動(dòng)相為乙腈-水（16 ∶84，V/V）；流 速0.8 mL·min-1；紫 外 波 長(zhǎng) 218 nm。姚霞等[14]比較了免疫親和柱-高效液相色譜法和免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，檢出限低，但在檢測(cè)有本底樣品時(shí)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，成本高，高效液相色譜法更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。免疫親和高效液相色譜法結(jié)合二極管陣列器定性和定量檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的文獻(xiàn)報(bào)道較少，何攀等[15]優(yōu)化了液相色譜條件為流動(dòng)相為甲醇-水（25 ∶75，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm、掃描范圍190 ～400 nm，研究了定性分析的方法。本文在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，選用特異的嘔吐毒素免疫親和柱凈化，高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定小麥粉中的DON。本方法前處理簡(jiǎn)單快速，高回收高靈敏，結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器，通過(guò)保留時(shí)間和光譜掃描定性可實(shí)現(xiàn)樣品確證。該方法避免了現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法的假陽(yáng)性，對(duì)提高檢測(cè)分析效率和保障糧食安全有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥粉，市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 試劑與儀器

甲醇（色譜純），F(xiàn)isher 公司；聚乙二醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和鹽酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q 超純水；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為200 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)編號(hào)為CDAA-S-290023-AB-1 mL），購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司（ANPEL）。

1260 液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫公司；BT125D 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HM100 刀式研磨儀，北京格瑞德曼儀器有限公司；JJSJ22 圓孔篩，飛穗；S180H 超聲波清洗器，德國(guó)ELMA；HNDK200-2 氮?dú)獯祾邇x，東京理化器械株式會(huì)社；ST16R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾；移液槍?zhuān)?0 ～200 μL，100 ～1 000 μL），德國(guó)艾本德股份有限公司；玻璃纖維濾紙，孔徑1.5 μm；0.22 μm水相微孔濾膜；50 mL 聚丙烯具塞刻度離心管；10 mL一次性注射器；真空泵；嘔吐毒素免疫親和柱（3 mL，1 000 ng），美國(guó)Romer。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

（1）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確移取適量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg·mL-1），用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥?00 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

（2）磷酸鹽緩沖溶液（以下簡(jiǎn)稱(chēng)PBS）配制。稱(chēng)取8.00 g 氯化鈉、1.20 g 磷酸氫二鈉、0.20 g 磷酸二氫鉀、0.20 g 氯化鉀，用900 mL 水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，用水定容至1 000 mL。

（3）甲醇-水溶液（25+75）配制。量取250 mL甲醇加入到750 mL 水中，混勻。

1.3.2 樣品前處理

①采樣和試樣制備。抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取1 000 g，粉碎后過(guò)0.5 mm 孔徑的分析篩，混勻，裝入自封袋中，密封保存，備用。②提取。稱(chēng)取25 g（準(zhǔn)確到0.1g）試樣于100 mL 具塞三角瓶中，加入5 g 聚乙二醇，加水100 mL，混勻，置于超聲波振蕩器超聲20 min，以玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集濾液，在10 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。③凈化。事先將低溫下保存的嘔吐毒素免疫親和柱恢復(fù)至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準(zhǔn)確移取 2.0 mL 上清液，注入注射器中。將真空泵與注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1 滴的流速通過(guò)免疫親和柱，用5 mL PBS 緩沖鹽溶液和5 mL 水先后淋洗，流速約為每秒1 ～2 滴，棄去全部流出液，抽干小柱。④洗脫。準(zhǔn)確加入2 mL 甲醇洗脫親和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?1.0 mL 初始流動(dòng)相，渦旋30 s 溶解殘留物，過(guò)0.22 μm濾膜以備檢測(cè)。

1.3.3 液相色譜條件

安捷倫Pursuit C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm，SN：552685）；流動(dòng)相：甲醇+水（25+75）；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積：50 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波 長(zhǎng)：218 nm；光譜掃描范圍：210 ～400 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相比例優(yōu)化

試驗(yàn)分別配制甲醇-水（V∶V）10 ∶90、15 ∶85、 20 ∶80、25 ∶75 和30 ∶70，在280 nm，0.8 mL·min-1流速下對(duì)DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相甲醇（有機(jī)相）比率的增大，DON 出峰越快，保留時(shí)間越短，但分離度也隨之變化。出峰越早，越容易被雜質(zhì)峰（洗脫液）包裹。在甲醇-水為25 ∶75（V∶V）時(shí)，保留時(shí)間為4.3 min，分離度最好，一次進(jìn)樣在8 min 內(nèi)完成。

2.1.2 流動(dòng)相流速優(yōu)化

流動(dòng)相的流速是另一個(gè)影響色譜出峰的重要因素。在其他條件不變的情況下，試驗(yàn)分別在流速為 0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1條件下進(jìn)行DON 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定。結(jié)果表明，流速越低，分離度越好，但DON 出峰慢，日常大批量檢測(cè)成本高。在流速0.8 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間和分離度最優(yōu)。優(yōu)化色譜條件后，DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 DON 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

樣品經(jīng)過(guò)優(yōu)化的提取條件提取后，選用特異的嘔吐毒素免疫親和柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化，洗脫更完全，柱回收率更高。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

試 驗(yàn) 以 流 動(dòng) 相 配 制100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、750 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的DON 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行測(cè)定分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制回歸方程為Y=0.231 753X-6.231 59，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 70，結(jié)果如圖2 所示。取未被DON污染的小麥粉樣品，以信噪比為3（S/N=3）的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度加標(biāo)，計(jì)算檢出限為36 μg·kg-1。

圖2 回歸曲線圖

2.4 回收率及精密度試驗(yàn)

以未被DON 污染的小麥粉為樣品，在200 μg·kg-1、400 μg·kg-1和1 000 μg·kg-13 個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)樣平行測(cè)試6 次，計(jì)算回收率和精密度。由表1 可知，樣品加標(biāo)回收率在91.2%～98.0%，精密度為0.73%～3.19%，回收率較高，偏差較小。

表1 不同加標(biāo)水平回收率和精密度表

2.5 二極管陣列檢測(cè)器定性

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍（210 ～400 nm），DON 最大吸收波長(zhǎng)為218 nm，與光譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，特征顯著 （圖3），通過(guò)保留時(shí)間和光譜圖可以對(duì)DON 實(shí)現(xiàn)定性分析，實(shí)現(xiàn)樣品確證。

圖3 光譜圖庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)溶液DON 光譜對(duì)比圖

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

用本方法對(duì)市售的10 份小麥粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了基于特異嘔吐毒素免疫親和柱，高效液液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)化前處理操作、提高方法回收率及靈敏度和檢測(cè)結(jié)果定性定量準(zhǔn)確性、無(wú)需質(zhì)譜進(jìn)行確證等目的。該方法的建立是現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的極大改進(jìn)，對(duì)政府部門(mén)開(kāi)展相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)部門(mén)開(kāi)展相應(yīng)的常規(guī)分析檢測(cè)具有重要的參考依據(jù)。