柚皮素對(duì)人自然殺傷細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制

馬利節(jié)， 于 暢， 王 芳， 唐亦非， 鄔海龍， 孫學(xué)華， 高月求

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a.肝病科， b.中心實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 3 上海健康醫(yī)學(xué)院， 上海 201203

肝細(xì)胞癌是當(dāng)前我國(guó)第4位常見(jiàn)惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命健康[1-2]。肝癌治療包括肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、局部消融治療、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、放射治療、全身治療等多種手段[3]。然而由于肝癌患者早期癥狀不明顯，多數(shù)確診時(shí)已屬中晚期，治療效果差，病死率高[4]。因此，為提高肝癌患者的生存率，進(jìn)一步尋找新的藥物、生物免疫等治療方法成為近年的研究熱點(diǎn)。

柚皮素(4,5,7-三羥基黃酮)是一種類(lèi)黃酮化合物，無(wú)色無(wú)味，主要存在于各種葡萄、漿果和柑橘類(lèi)水果中[5]。柚皮素具有多種生物學(xué)作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤[6]等。其中，抗腫瘤活性是目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。有報(bào)道[7]提出柚皮素可增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性，抑制巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞氧化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)殺死感染、入侵、應(yīng)激或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，保護(hù)宿主。此外，NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞相互作用發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)。近年來(lái)，以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療取得重大進(jìn)展，包括NK細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移治療、募集NK細(xì)胞至腫瘤微環(huán)境、阻斷限制NK細(xì)胞功能的抑制受體等[8]。本實(shí)驗(yàn)探討柚皮素對(duì)人NK細(xì)胞殺傷人肝癌細(xì)胞株CLC5活性的影響，并初步分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自CEDARLANE(加拿大)；注射用重組人白細(xì)胞介素2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司；柚皮素(純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜、青鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NK細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)CellGro SCGM；CD56-APC、CD3-FITC購(gòu)自美國(guó)BD公司；CellTiter-LumiTM、黑色96孔板均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK8試劑購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinso公司；SpectraMax iD5酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器(上海)有限公司；RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人NK細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)知情同意，先后取3名健康志愿者外周抗凝血100 mL，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。每100 mL外周抗凝血可分離約3×106PBMC，用含500 IU/mL rhIL-2的NK培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/mL，接種于6個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶中。每瓶NK細(xì)胞培養(yǎng)基加至5 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d半量換液1次，維持細(xì)胞密度為 5×105/mL，收集培養(yǎng)擴(kuò)增15 d的NK細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的CD3、APC標(biāo)記的CD56進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)[9]，流式鑒定重復(fù)3次。

1.3 CCK8法檢測(cè)不同濃度柚皮素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 人肝細(xì)胞癌CLC5細(xì)胞(購(gòu)自BRICS生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蘇州研究院質(zhì)粒細(xì)胞庫(kù))，編號(hào)：BRICS0004，以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將肝癌細(xì)胞配成5×104/mL的細(xì)胞懸液，100 μL/孔接種于96孔板，加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24、48 h后，每孔加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光值(OD)并記錄結(jié)果，同時(shí)計(jì)算肝癌細(xì)胞增殖率。肝癌細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。

1.4 CCK8法檢測(cè)不同濃度柚皮素對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 由于CCK8試劑對(duì)懸浮細(xì)胞染色較為困難，將NK細(xì)胞配成2×105/mL的細(xì)胞懸液；100 μL/孔接種于96孔板，加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔OD值并記錄結(jié)果，同時(shí)計(jì)算NK細(xì)胞增殖率。NK細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。

1.5 CellTiter-LumiTM法檢測(cè)不同濃度柚皮素對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的影響 胰酶消化肝癌細(xì)胞并計(jì)數(shù)，配成5×104/mL的細(xì)胞懸液，50 μL/孔接種于黑色96孔板；將NK細(xì)胞配成5×104/mL的細(xì)胞懸液，50 μL/孔同時(shí)接種于黑色96孔板，構(gòu)建NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系，每組6個(gè)復(fù)孔；加入柚皮素(終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)共培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板室溫平衡10 min，每孔加入100 μL CellTiter-LumiTM試劑，室溫振蕩2 min促進(jìn)細(xì)胞裂解后，室溫孵育10 min使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)并記錄Luminescence值。NK細(xì)胞殺傷率=[1-(共培養(yǎng)孔-NK細(xì)胞孔)/肝癌細(xì)胞孔平均值]×100%[10]。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)柚皮素對(duì)NKG2D受體及配體的影響 胰酶消化肝癌細(xì)胞并計(jì)數(shù)，配成1×105/mL的細(xì)胞懸液，1 mL/孔接種于6孔板；將NK細(xì)胞配成1×105/mL的細(xì)胞懸液，1 mL/孔同時(shí)接種于6孔板，構(gòu)建NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系。柚皮素刺激24 h，收集細(xì)胞使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NK細(xì)胞中NKG2D受體及肝癌細(xì)胞中NKG2DL(MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海擎科生物工程股份有限公司合成，信息見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 人 NK 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 研究[11-12]表明，人NK細(xì)胞表型為CD3-CD56+；收集3名健康志愿者經(jīng)rhIL-2誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，培養(yǎng)15 d后NK細(xì)胞占PBMC比例為82.33%±0.70%(圖1)。

2.2 柚皮素對(duì)肝癌細(xì)胞的影響 柚皮素作用24 h后，所有濃度組CLC5肝癌細(xì)胞的增殖率均無(wú)明顯差異(P值均>0.05)；48 h后3.125～50 μmol/L濃度組CLC5肝癌細(xì)胞的增殖率較0 μmol/L濃度組(642.76%±30.44%)均有所下降(P值均<0.000 1)，且具有一定的濃度依賴(lài)關(guān)系。其中，3.125 μmol/L柚皮素組即有明顯抑制CLC5肝癌細(xì)胞增殖率(561.96%±42.84%)的作用(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組CLC5肝癌細(xì)胞增殖率(464.02%±13.15%)最低(P<0.000 1)(圖2)。

注：a， NK細(xì)胞流式鑒定；b， 顯微鏡下NK細(xì)胞形態(tài)。

注：與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。圖2 不同質(zhì)量濃度柚皮素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖率的影響Figure 2 Effects of different naringin concentrations onviability of hepatocellular carcinoma cells

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物列表Table 1 List of primers for fluorescence quantitative PCR

2.3 柚皮素對(duì)NK細(xì)胞的影響 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究目的，以及柚皮素作用24 h對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，僅觀察不同質(zhì)量濃度柚皮素作用NK細(xì)胞24 h后，對(duì)NK細(xì)胞增殖率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柚皮素作用24 h后，3.125～12.5 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細(xì)胞的增殖率較0 μmol/L組均無(wú)明顯差異(P值均>0.05)；25 μmol/L濃度組柚皮素NK細(xì)胞的增殖率(109.89%±1.93%)較0 μmol/L組(100.17%±1.88%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組柚皮素對(duì)NK細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(118.29%±2.34%)尤為突出(P<0.000 1)(圖3)。

注：與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。圖3 不同質(zhì)量濃度柚皮素對(duì)NK細(xì)胞增殖率的影響Figure 3 Effects of different naringin concentrations onviability of NK cells

2.4 柚皮素對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的影響 柚皮素作用NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h后，3.125～12.5 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細(xì)胞的殺傷率較0 μmol/L組均無(wú)明顯差異(P值均>0.05)；25 μmol/L濃度組NK細(xì)胞的殺傷率(44.75%±3.25%)較0 μmol/L組(32.70%±3.68%)即有升高(P<0.000 1)，50 μmol/L濃度組對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的提高(46.79%±3.54%)較25 μmol/L濃度組無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖4)。

2.5 柚皮素對(duì)NKG2D受體及配體的影響 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以0 μmol/L柚皮素作為對(duì)照組，觀察25、50 μmol/L濃度組柚皮素對(duì)NK細(xì)胞中NKG2D受體及肝癌細(xì)胞中NKG2D配體(NKG2D ligand, NKG2DL)表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用于NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h后，25、50 μmol/L濃度組柚皮素對(duì)NK細(xì)胞中NKG2D受體的表達(dá)均無(wú)影響(P值均>0.05)，對(duì)肝癌細(xì)胞中部分NKG2DL(MICB、ULBP2)的表達(dá)亦無(wú)影響(P值均>0.05)；25、50 μmol/L濃度組可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中部分NKG2DL(ULBP1、ULBP3)的表達(dá)(P值均<0.001)。而25 μmol/L與50 μmol/L濃度組柚皮素對(duì)肝癌細(xì)胞中ULBP1和ULBP3表達(dá)的上調(diào)均無(wú)明顯差異(P值均>0.05)(圖5)。

3 討論

近年來(lái)，中草藥及其提取物在減少腫瘤治療的副作用和改善免疫系統(tǒng)功能方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[13-15]，從而延長(zhǎng)癌癥患者的生存時(shí)間，提高生活質(zhì)量。柚皮素在防治腫瘤方面的潛在作用引起廣泛關(guān)注[16]。據(jù)報(bào)道，柚皮素可作為一種化學(xué)增敏劑，協(xié)同增強(qiáng)紫杉醇在前列腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用[17]；并可與衣霉素BAY 11-7082結(jié)合有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[18]。NK細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，是腫瘤細(xì)胞免疫治療的基礎(chǔ)[19-20]，NK細(xì)胞的抗腫瘤作用除了依賴(lài)其殺傷活性外，與其數(shù)量也有很大的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮素作用于NK細(xì)胞24 h后，25 μmol/L質(zhì)量濃度組NK細(xì)胞的增殖率逐漸上升，50 μmol/L時(shí)NK細(xì)胞增殖率達(dá)最高峰，提示一定濃度的柚皮素能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，其具體機(jī)制尚不清楚。

注：a, CellTiter-LumiTM檢測(cè)原理；b, 柚皮素對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的影響。與0 μmol/L濃度組相比，P<0.000 1。

注：a, 柚皮素對(duì)NKG2D受體的影響；b, 柚皮素對(duì)NKG2DL的影響。

NKG2D是NK細(xì)胞和部分T淋巴細(xì)胞中的重要激活型受體。NKG2DL在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)[21]。NKG2DL與NK細(xì)胞上的NKG2D結(jié)合將誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性從而破壞靶細(xì)胞。然而隨著病程的進(jìn)展，一些腫瘤細(xì)胞通過(guò)配體脫落、配體保留和誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞上的配體，以規(guī)避NKG2D介導(dǎo)的免疫監(jiān)測(cè)，這表明了NKG2D/NKG2DL的相互作用在腫瘤免疫反應(yīng)過(guò)程中的重要性，使NKG2D/NKG2DL在癌癥治療應(yīng)用中具有巨大的潛力[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柚皮素作用于NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h，當(dāng)濃度超過(guò)25 μmol/L時(shí)NK細(xì)胞的殺傷率較對(duì)照組上升，而25 μmol/L與50 μmol/L濃度組之間對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的提高無(wú)明顯差異。25 μmol/L與50 μmol/L柚皮素分別作用于NK-肝癌細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)體系24 h，NK細(xì)胞中NKG2D的表達(dá)較之對(duì)照組無(wú)明顯差異，CLC5細(xì)胞中ULBP1及ULBP3的表達(dá)較之對(duì)照組升高，即柚皮素通過(guò)暴露肝癌細(xì)胞中NKG2DL，使其與NKG2D結(jié)合而促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷作用。

綜上所述，柚皮素不僅能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，而且能夠增加NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性，其機(jī)制可能與柚皮素上調(diào)肝癌細(xì)胞中ULBP1、ULBP3等NKG2DL的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，上述結(jié)論為柚皮素應(yīng)用于肝癌的免疫治療提供了理論依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究于2018年11月20日通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，批號(hào)：2018-628-57-01。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬利節(jié)、于暢負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；王芳、鄔海龍參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；唐亦非參與修稿事宜；孫學(xué)華、高月求負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。