糯米山藥炭疽病病原菌的分離·鑒定與生物防治

張呈念，黃哲鴻，王科晶，華樹(shù)妹，涂金文，張楊文，陳仕朋*

(1.文成縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院，浙江溫州 325000；2.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建三明 365050；3.慕恩(廣州)生物科技有限公司，廣東廣州 510700)

山藥 (L.)，別名薯蕷、參薯、大薯、田薯等，屬于薯蕷科 (Dioscoreaceae) 薯蕷屬 ()一年或多年生纏繞性藤本植物，其利用部位為根狀或塊狀莖，山藥除食用功能外還有補(bǔ)脾、養(yǎng)肺、固腎等保健功效。我國(guó)山藥種植面積常年穩(wěn)定在33.33萬(wàn)hm左右，分布區(qū)域遍布全國(guó)，許多地方的山藥品種已形成區(qū)域品牌，如河南溫縣鐵棍山藥、湖北武穴佛手山藥、江西瑞昌山藥、福建清流雪薯、福建山格淮山、浙江文成糯米山藥等。文成糯米山藥以其糯性為主要特色，全縣近年種植面積為400.00～533.33 hm，平均產(chǎn)量30 t/hm，市場(chǎng)銷售價(jià)達(dá)16元/ kg，產(chǎn)值高達(dá)48萬(wàn)/hm，成為文成縣農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)，也被文成縣作為鄉(xiāng)村振興的有力助手。但文成糯米山藥抗病能力弱，炭疽病的發(fā)生尤其嚴(yán)重，一般造成減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上，甚至絕收。炭疽病是山藥的主要病害，各地山藥炭疽病的病原菌存在差異，林永康從福建沙縣山藥病葉分離的致病菌為辣椒炭疽菌 () ，黃婷從江西瑞昌山藥的病葉中分離出膠孢炭疽菌 ()，韓曉勇等從江蘇六合山藥病葉中分離到膠孢炭疽菌與暹邏炭疽菌 ()。目前文成糯米山藥炭疽病的相關(guān)研究仍未見(jiàn)報(bào)道，因此分離鑒定糯米山藥病原菌是精準(zhǔn)防控其炭疽病的首要課題。目前山藥炭疽病防治以化學(xué)防治為主，在生產(chǎn)上常用防治藥劑有70% 甲基硫菌靈、50% 烯酰嗎啉、30%苯醚甲環(huán)唑乳油、50%氯溴異氰尿酸、75%拿敵穩(wěn)等，然而化學(xué)農(nóng)藥的頻繁施用不僅造成食品安全問(wèn)題而且破壞土壤生態(tài)。生物防治具有綠色、生態(tài)、高效、安全等特點(diǎn)。Palaniyandi等用具有生防能力的鏈霉菌防治山藥病害取得良好效果；李華用地衣芽孢桿菌防治辣椒炭疽病，防治效果可達(dá)68.1%；馮江鵬等用貝萊斯芽孢桿菌防治草莓膠孢炭疽病，預(yù)防效果達(dá)95%以上。哈茨木霉菌已被應(yīng)用于多種植物病害的生物防治，Brito等研究表明木霉對(duì)芒果青枯病具有良好的防治效果；Swehla等研究表明，哈茨木霉的分離物對(duì)菜豆根腐病病原菌具有抑制作用；Li等研究發(fā)現(xiàn)大白菜接種哈茨木霉后，可降低大白菜馬蹄根病的發(fā)生率。宋光桃從油茶根際土壤中分離出3株木霉菌，其對(duì)油茶炭疽病抑菌效果較明顯。筆者分離了糯米山藥的炭疽病原菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)探究其生長(zhǎng)適應(yīng)條件，驗(yàn)證可用于糯米山藥炭疽病生物防治的哈茨木霉菌生防菌劑，并開(kāi)展田間藥效試驗(yàn)，探明糯米山藥炭疽病病原菌的菌屬、生存條件以及挑選抑制炭疽病發(fā)生的生物防治，以期為文成糯米山藥的綠色生物防治提供有效措施和理論依據(jù)。

1 材料與方法

2019年7月從浙江文成縣沙垟采集糯米山藥呈典型炭疽病病狀的病葉樣品，樣品采集后立刻進(jìn)行病原菌分離。

通過(guò)常規(guī)分離法分離病菌，將PDA平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)成，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行分離純化，并在顯微鏡下觀察其孢子形態(tài)。

將分離純化的病原菌接種至PDA平板培養(yǎng)基，3 d后觀察菌絲形態(tài)特征，并鏡檢分生孢子形態(tài)，參考東秀珠等的方法。

采用 CTAB 法提取病原菌DNA，采用真核生物通用引物擴(kuò)增rDNA-ITS序列 (ITS5：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，依次加入以下試劑：ITS5(10 μmol/L) 0.5 μL,ITS4(10 μmol/L) 0.5 μL,DNA 模板1 μL,2×PCR Master Mix 25.0 μL,ddHO 23.0 μL，混勻后按如下程序進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 min，5 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)， 最后一次循環(huán)后，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，回收產(chǎn)物交由鉑尚公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列上傳到 NCBI Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行序列同源性分析。

將供試菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水沖洗分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板配制1×10個(gè)/mL孢子懸浮液。采未轉(zhuǎn)綠的新鮮山藥嫩葉，用滅菌水將葉片表面沖洗干凈，晾干之后，用75%乙醇擦拭，待葉片表面殘留的水干之后，吸取5 μL孢子液，滴加于葉片上，放置于水瓊脂培養(yǎng)皿保濕并在室溫下等待其發(fā)病。

探究溫度及pH對(duì)分離菌株生長(zhǎng)的影響，測(cè)定方法：將分離菌接種于pH為5.7的PDA培養(yǎng)基，并放置于25、30、35、40、45 ℃下，6 d后觀察并記錄菌落直徑。配制PDA培養(yǎng)基pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11、12，接種菌株放置溫度為30 ℃的培養(yǎng)箱在第6天進(jìn)行觀察，并記錄菌落的直徑。

采用平板對(duì)峙法，選取哈茨木霉菌株Th7和Th19(慕恩(廣州)生物科技有限公司提供)對(duì)所分離的炭疽菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。分別記錄拮抗3和9 d的菌落直徑，并計(jì)算抑制率。

2020年設(shè)置長(zhǎng)9 m、寬1 m的糯米山藥，3個(gè)重復(fù)，以噴施水處理作為CK，對(duì)株高50 cm的山藥幼苗葉片噴哈茨木霉Th7(樣品由慕恩(廣州)生物科技有限公司提供)300倍稀釋液,葉片正反兩面噴施至葉面滴水，間隔15 d噴施一次，于2020年6月15日和8月15日按5點(diǎn)取樣法對(duì)文成糯米山藥進(jìn)行病害調(diào)查，記載病情指數(shù)和計(jì)算防治效果。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，葉面的病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；2級(jí)，葉面的病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；3級(jí)，葉面的病斑面積占整個(gè)葉面積11%～25%；4級(jí)，葉面的病斑面積占整個(gè)葉面積26%～50%；5級(jí)，葉面的病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。計(jì)算公式：

用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析與student t-test檢驗(yàn)，用Excel 2016處理數(shù)據(jù)和繪圖，通過(guò)MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

圖1為采集的文成沙垟村與二源村種植的糯米山藥病葉，病斑的中心為褐色向外圈擴(kuò)展至灰黑色，呈同心圓，是典型的炭疽病病葉的病斑特征。

圖1 糯米山藥炭疽病病葉Fig.1 Anthracnose leaf of glutinous yam

從采集的病葉中分離出3個(gè)表型明顯不同的菌株，命名為WC01、WC02、WC03，在PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定(圖2)。WC01菌落從中間逐漸變?yōu)榛疑?，菌絲直徑為7 cm，邊緣會(huì)產(chǎn)生橘紅色的孢子團(tuán)，菌落中間正面為灰色，外緣為黃色，呈同心狀分布，分生孢子白灰色，形狀為長(zhǎng)橢圓至紡錘形，單孢，兩端鈍圓，長(zhǎng)度為(10.2～12.1)μm×(2.0～4.0) μm；WC02菌落由白色菌絲從中間逐漸變?yōu)闇\灰色，待菌絲長(zhǎng)滿盤直徑為9 cm，背面為灰褐色，菌絲緊致，邊緣光滑，分生孢子為無(wú)色長(zhǎng)橢圓形，單孢，大小為(6.6～10.2)μm×(2.2～4.0) μm；WC03的菌落白色菌絲向四周擴(kuò)散，菌絲直徑為6 cm，從中間向四周變?yōu)榛揖G色。菌絲緊致，邊緣白色光滑，分生孢子無(wú)色長(zhǎng)橢圓形，單孢，大小為(4.70～6.35) μm×(1.60～2.00)μm。這3株菌的菌落形態(tài)與spp.相似。

提取3個(gè)菌株基因組DNA，并通過(guò)PCR擴(kuò)增病原菌rDNA-ITS序列，分別擴(kuò)增獲得578、601和571 bp，并將基因序列登錄GenBank(登錄號(hào)WC01:MW221348，WC02:MW221823，WC03:MW221353)，通過(guò)NCBI網(wǎng)站的Blastn比較3株病原菌DNA相似度，發(fā)現(xiàn)WC01、WC02、WC03分別與CMUBE812、ICMP 17919、ICMP 17919最為相似，相似度分別達(dá)96.53%、99.66%與98.21% (表1)。

圖2 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌株第14天的生長(zhǎng)情況與形態(tài)Fig.2 Growth and morphology of the isolated pathogens on PDA medium on the 14 th day

將WC01、WC02和WC03的ITS序列同GenBank比對(duì)的同源性最高的29個(gè)序列用MEGA7軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。根據(jù)發(fā)育樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，WC01、WC02和WC03與ICMP 17919處于同一分支內(nèi)(圖3)。

表1 菌種ITS-DNA比對(duì)Table 1 ITS-DNA comparison of strains

遵循柯赫氏法則，將糯米山藥病葉分離鑒定到的3株病原菌，回接糯米山藥嫩葉驗(yàn)證其致病癥，均表現(xiàn)出明顯的炭疽病癥，其中WC03致病性最強(qiáng)(圖4)。進(jìn)行再次分離后，通過(guò)ITS序列驗(yàn)證為同一菌株。因此可以確定分離的3株菌株均為炭疽病病原菌。

測(cè)定pH和溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)狀況的影響，了解病原菌生長(zhǎng)所需的環(huán)境，從而進(jìn)行預(yù)防和發(fā)病預(yù)警。不同溫度條件下，3個(gè)菌株均最適合生長(zhǎng)于30 ℃，觀察培養(yǎng)基中的菌絲，發(fā)現(xiàn)30 ℃的菌絲生長(zhǎng)最為密集，菌絲量最多，溫度大于30 ℃不利于菌絲的生長(zhǎng)， WC01和WC02的菌絲生長(zhǎng)速度均顯著快于WC03(圖5)。此外溫度為30 ℃時(shí)，炭疽病菌株會(huì)產(chǎn)生更多的孢子(圖6)；當(dāng)pH為5～9時(shí)，WC01的菌落直徑顯著大于其他pH的菌落直徑；當(dāng)pH為4～11時(shí)，WC02的菌落直徑顯著大于pH為12的菌落直徑；當(dāng)pH為4～10時(shí)，WC03的菌落直徑顯著大于pH為11和12時(shí)的WC03菌落直徑，3株菌株的菌落直徑在各pH下無(wú)顯著差異，在pH為12時(shí)，生長(zhǎng)均受到抑制(圖7)。

采用平板對(duì)峙法鑒定2株哈茨木霉菌Th7和Th19對(duì)于WC01的拮抗作用(圖8)。由表2可知，在接種第3天時(shí)，Th7和Th19對(duì)于3株炭疽病病原菌均有抑制作用，Th7對(duì)3株炭疽病病原菌的抑制率在9.4%～12.73%，Th19對(duì)3株炭疽病病原菌的抑制率則在11.28%～27.27%。在接種第9天時(shí)，2株木霉對(duì)于炭疽病病菌都有良好的抑制效果， Th7對(duì)3株炭疽菌的抑制率均達(dá)100%，Th19對(duì)3株炭疽菌的抑制率也均達(dá)67%以上。表明哈茨木霉Th7的拮抗效果大于Th19。

圖3 Colletotrichum spp.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis of Colletotrichum spp.

圖4 接種3株菌株的山藥葉片F(xiàn)ig.4 Yam leaves inoculated with three isolated strains

注：不同小寫字母表示同一溫度不同菌株間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示同一菌株不同溫度下差異顯著(P<0.05) Note:Different lowercase letters represent significant difference between strains;different capital letters represent significant difference between different temperatures圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on pathogens growth

進(jìn)一步通過(guò)田間種植試驗(yàn)研究哈茨木霉Th7對(duì)糯米山藥炭疽病的防治效果，每隔15 d施用一次。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，施用30 d后， Th7對(duì)于山藥炭疽病有顯著的防治效果，且從田間的病葉圖中看到經(jīng)過(guò)木霉處理的病斑聚為一個(gè)小斑點(diǎn)，并不會(huì)擴(kuò)散到整個(gè)葉片，而CK處理的葉片病斑擴(kuò)大并占據(jù)整個(gè)葉片的27% (圖9a)。病情指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Th7處理的病情指數(shù)顯著低于CK處理，說(shuō)明施用30 d木霉菌能防止炭疽病對(duì)山藥的入侵。木霉菌Th7施用90 d的病情指數(shù)仍顯著低于CK處理 (圖9b)，整體防治效果為49.72% (圖9c)。

圖6 25和30 ℃下3株分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況Fig.6 Spore production of three isolated strains on PDA medium at 25 and 30 ℃

注：不同小寫字母表示同一pH不同菌株間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示同一菌株不同pH下差異顯著(P<0.05) Note:Different lowercase letters represent significant difference between strains;different capital letters represent significant difference between different pH values圖7 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of pH on pathogens growth

3 討論與結(jié)論

炭疽病為山藥產(chǎn)區(qū)的重要病害，目前研究表明在我國(guó)各地炭疽病的致病菌有所不同，該研究從糯米山藥病葉上發(fā)現(xiàn)并分離了3株炭疽病菌株并驗(yàn)證其致病性。研究炭疽病病原菌的生長(zhǎng)條件對(duì)于防治炭疽病起著重要作用。劉愛(ài)媛等研究表明，荔枝炭疽病菌絲適合的生長(zhǎng)溫度為8～38 ℃，產(chǎn)生孢子的溫度為12～36 ℃；曾思海等對(duì)杉木球果炭疽病的研究表明，該病菌生殖生長(zhǎng)的溫度為22～30 ℃；該研究從糯米山藥所分離的炭疽病適合的生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，最適合產(chǎn)孢的溫度為30 ℃，該結(jié)果與唐景美等從辣椒中分離出辣椒膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性相似。不同屬的炭疽病的生理特性有所不同，可以根據(jù)該菌的生理特性在環(huán)境溫度達(dá)到其適合生長(zhǎng)之前預(yù)警和防治，對(duì)于糯米山藥炭疽病的防治應(yīng)在夏初，在病原菌暴發(fā)前期防治可以取得更好的預(yù)防效果。木霉菌在作物病害的生物防治中具有廣泛的應(yīng)用。

圖8 木霉Th7與WC01的平板拮抗試驗(yàn)Fig.8 Plate antagonistic test between Trichoderma Th7 and WC01

表2 哈茨木霉Th7和Th19對(duì)3株炭疽病病原菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effects of Trichoderma harzianum Th7 and Th19 on three Colletotrichum strains

王學(xué)堅(jiān)等研究表明，鉤狀木霉菌YMF1.00247的發(fā)酵液能顯著增加煙草的株高、葉片、莖圍等生理性狀，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，且能減少煙草黑莖病的發(fā)病率；馬麗婷等發(fā)現(xiàn)木霉菌能抑制石榴枯萎病且抑制率在60%～70%；陸美珍等篩選出的木霉菌T6對(duì)于美洲南瓜枯萎病病原菌抑制率達(dá)85.7%；該試驗(yàn)中的哈茨木霉菌Th7在第9天時(shí)對(duì)山藥炭疽病病原菌的抑制率達(dá)100%，Th19的抑制率在67%以上，表明哈茨木霉菌對(duì)于文成山藥炭疽病病原菌具有較高的抑制效果。朱洪江等發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)于煙草青枯病的田間防治隨著時(shí)間增長(zhǎng)，防治效果越弱，這可能是由于田間環(huán)境的影響和生防菌株自身適應(yīng)性的影響。該研究中，增加處理時(shí)間防治效果也隨之增加，說(shuō)明施用90 d的木霉菌比施用30 d防治效果更好。因此，可以適當(dāng)延長(zhǎng)或增加施用木霉的時(shí)間與次數(shù)來(lái)增加防控效果。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)開(kāi)展了各種作物炭疽病的生物防治研究，篩選了芽孢桿菌()、抗生素溶桿菌()、熒光假單孢桿菌(sp.)等生防菌用于炭疽病的防治。木霉菌作為新型的生防菌已被用于多種作物病害的防治，如煙草黑脛病、辣椒立枯病、黃瓜灰霉病等真菌、細(xì)菌病害的防治，但木霉菌應(yīng)用于山藥炭疽病防治尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)平板對(duì)峙法和田間防治，發(fā)現(xiàn)木霉菌Th7對(duì)于文成糯米山藥炭疽病具有較好的防治效果，為文成山藥炭疽病的防治提供了一定的理論依據(jù)，但其具體的生防機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

注：a、b、c分別為施用木霉Th7后30 d炭疽病癥狀、病情指數(shù)和總體防治效果。*表示不同處理間差異顯著(P<0.05) Note：a,b,c were anthracnose symptoms 30 d after applying Th7,disease index and control effect.* indicated significant difference between different treatments at 0.05 level圖9 哈茨木霉Th7田間防治效果與病害分析Fig.9 Field effect and disease analysis of Trichoderma harzianum Th7