基于慢性輕度不可預(yù)知性溫和型應(yīng)激的C57BL/6N小鼠抑郁模型的建立與評價

約日古麗·麥海提 任小巧 范佳佳 李 鑫 劉媛媛 毛 萌

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

抑郁癥是由各種因素引起的一種心境障礙或情感障礙性疾病[1]，其主要臨床表現(xiàn)為情緒低落、對外界興趣減退、感到內(nèi)疚、毫無價值感及反復(fù)出現(xiàn)自殺念頭、食欲和體質(zhì)量顯著變化(增加或減少)、睡眠紊亂(嗜睡或失眠)等，除此之外它還可能會影響心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等，從而對人類生命健康產(chǎn)生威脅[2-3]。該病致殘率及發(fā)病率高，女性更易遭遇抑郁癥[4-5]。目前全球抑郁癥患者大約3.4億人，其中15%～20%的患者最終自殺身亡[6]。2030年抑郁癥可能會成為全球最大的健康殺手[4,7]，盡管如此，至今關(guān)于抑郁癥病因病機的探索尚處于初級階段[8]，更為棘手的是本病具有異質(zhì)性，臨床癥狀不一致，表現(xiàn)形式多樣、相關(guān)癥狀繁多，因而目前研究尚無法解釋抑郁癥的所有方面[9-10]。

抑郁動物模型是研究抑郁癥必不可少的工具，廣泛應(yīng)用于抑郁癥病因病機研究及抗抑郁藥的篩選。眾所周知，社會環(huán)境因素是抑郁癥發(fā)病的重要危險因素，以環(huán)境壓力為背景的抑郁動物模型的研究較為關(guān)鍵。慢性輕度不可預(yù)知性溫和型應(yīng)激(Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS)模型是一種強有效的抑郁動物模型，通過各種環(huán)境物理刺激方法，在動物不可預(yù)知的情況下長期施加于實驗動物，能有效模仿人類日常生活中遇到的各種心理壓力。本研究選取無特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級C57BL/6N小鼠，通過CUMS法，連續(xù)8周進行持續(xù)性刺激，建立CUMS應(yīng)激抑郁模型，探索CUMS法建立抑郁癥C57BL/6N小鼠模型的條件，在此基礎(chǔ)上觀察不同時間點該模型行為學(xué)變化，以明確造模時間對動物模型的影響，對該模型進行評價和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7周齡SPF級C57BL/6N雄性小鼠，體質(zhì)量18.0～21.0 g，實驗單位使用許可證編號：SYXK(京)2016-0038(由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)。實驗動物飼養(yǎng)于清潔級動物房，室溫維持在(25±1)℃，濕度維持在(65±5)%，采用12 h循環(huán)交替光照法(光照時間為7:30到19:30)晝夜節(jié)律。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 儀器 1)小鼠曠場行為測試箱：長×寬×高為50 cm×50 cm×40 cm的木制箱。底面用黑線劃分成面積相等的25個正方形方格，每行和每列各5個方格，中心9格為中央?yún)^(qū)。曠場箱中央正上方安置攝像頭，觀察記錄小鼠活動情況。2)小鼠游泳池：高度為30 cm，直徑為20 cm的圓柱形游泳池。3)小鼠懸尾箱：地面高度20 cm的紙箱，一面敞開，其余各面封閉。4)小動物生理系統(tǒng)檢測儀(Harvard Apparatus，美國，型號：HPMS)。5)行為學(xué)記錄分析軟件：EthoVision XT.15影像跟蹤系統(tǒng)(諾達思信息技術(shù)公司，荷蘭，型號：EthoVision XT.15)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，先對所有小鼠進行曠場實驗，按曠場實驗評分淘汰個別自發(fā)運動差的小鼠，再將納入的56只小鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組(n=14)和CUMS抑郁模型組(n=42)。對照組每5只一籠，正常飼養(yǎng)；CUMS組單籠飼養(yǎng)，給予CUMS應(yīng)激，其干預(yù)內(nèi)容如下：傾斜(45°)12 h、濕墊料(籠里加250 mL左右的水)過夜、束縛6 h、禁飲24 h、禁食24 h、冷水浴(4 ℃)3 min、熱水浴(45 ℃)3 min、晝夜交替8 h、頻閃8 h、空瓶刺激24 h、夾尾(尾尖1 cm處)2 min、陌生異常物品刺激(如塑料杯、牙刷等)過夜、合籠(2只小鼠一籠)過夜、冷環(huán)境2 h、長夜12 h、長晝24 h、大鼠墊料24 h等誘導(dǎo)抑郁癥的形成，每天給予23種應(yīng)激，同一種應(yīng)激1周內(nèi)不得出現(xiàn)2次以上，共執(zhí)行8周。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 一般情況的觀察 每天觀察所有小鼠的一般情況，包括毛發(fā)色澤、活躍程度、精神狀態(tài)、身體姿態(tài)、抓取時掙扎反映程度、對應(yīng)激的反應(yīng)情況及大小便等。

1.2.2.2 小鼠體質(zhì)量和肛溫的檢測 造模前、造模第1、2、3、4、5、6、7、8周末分別對2組小鼠進行稱重，并記錄不同時點的小鼠體質(zhì)量變化。造模第3、5、8周末分別對2組小鼠進行肛溫檢測，檢測肛溫時將小動物生理檢測器的探頭插入小鼠肛門內(nèi)，深度以探頭完全進入肛門為標準，維持時間至少10 s。

1.2.2.3 糖水偏好實驗 糖水偏好實驗(Sucrose Preference Test，SPT)用于測量小鼠快感缺乏，小鼠糖水偏好率下降顯示小鼠快感缺乏[11]。造模前3 d，訓(xùn)練動物適應(yīng)糖水測試，將所有小鼠單籠飼養(yǎng)，每籠同時放置2個水瓶。第1天，兩瓶均裝1%蔗糖水；第2天放置蔗糖水和蒸餾水各1瓶，每4小時轉(zhuǎn)換水瓶的位置，以防小鼠對水瓶的位置產(chǎn)生偏好；第3天禁食禁水；第4天上午9點，每只小鼠同時給予事先定量好的蔗糖水和蒸餾水各1瓶，2 h后取走所有水瓶并稱重。造模開始后按上述實驗方法分別在造模第3、5、8周末做一次SPT，并計算糖水偏好率(1%糖水消耗量/總水消耗量×100%)。

1.2.2.4 曠場實驗 曠場實驗(Open Field Test，OFT)可檢測小鼠自發(fā)運動能力以及探索行為，效果顯著、操作方便，對小鼠的傷害小[12]。本實驗造模前，造模第3、5、8周末各做1次OFT，實驗開始前將小鼠置于實驗室60 min讓其適應(yīng)實驗室環(huán)境，觀察時將單只小鼠置于50 cm×50 cm×40 cm光潔敞箱中央(箱內(nèi)表面顏色為藍色、地板為白色)，由攝像機記錄小鼠5 min內(nèi)的動作行為表現(xiàn)，并由1名實驗人員在固定位置記錄小鼠直立次數(shù)(小鼠前兩肢完全離開底板或爬墻)、修飾行為(理毛)情況，在每次測試完成之后，用75%的乙醇進行清理。整體實驗結(jié)束后通過EthovisionXT.15軟件分析曠場視頻。

1.2.2.5 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗(Forced Swimming Test，F(xiàn)ST)是由Porsolt于1978年開發(fā)的一種嚙齒動物行為實驗，常用于評估模型動物抑郁樣行為，具有良好的可信度和預(yù)測效度[13-14]。本實驗造模前，造模第3、5、8周末各做1次強迫游泳實驗。將小鼠放入高30 cm，直徑20 cm的圓柱形游泳池，水位15 cm，水溫23～25 ℃，將小鼠放置在水中6 min，前2 min讓其適應(yīng)環(huán)境后，記錄后4 min中內(nèi)不動的時間，當小鼠以直立的姿勢漂浮，只做一些小動作把頭露出水面時才被判斷為不動[15]。每次測完后換水，實驗過程中保持實驗室環(huán)境安靜。

1.2.2.6 懸尾實驗 懸尾實驗(Tail Suspension Test，TST)從1985年首次引入抑郁癥研究領(lǐng)域以來已有20余年，一直被用于抗抑郁藥的篩選以及動物模型行為評價[16]。實驗全過程通常持續(xù)6 min，TST不動時間一般被評價為小鼠絕望狀態(tài)[17]。本實驗造模前，造模第3、5、8周末各做1次懸尾實驗。自制離地面高度20 cm的紙箱，紙箱一面敞開，便于觀察小鼠，其余各面封閉，避免外界環(huán)境的干擾，從其中一個側(cè)面穿一小圓孔，將小鼠尾巴從圓孔穿過去，一位實驗員抓小鼠尾根1/3處保持不動，另一位實驗員記錄小鼠不動的時間。前2 min讓小鼠適應(yīng)環(huán)境，后4 min記錄不動時間，實驗過程中保持實驗室環(huán)境安靜。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠一般情況的影響 造模開始之前對照組和CUMS組小鼠均毛發(fā)整潔光亮，活潑好動，精神狀態(tài)良好。應(yīng)激3周后抓取CUMS組小鼠時，小鼠反應(yīng)不太劇烈，易抓取，喜歡疊摞墊料在角落里睡覺，而對照組小鼠抓取時不易抓取，多動，抓取后用四肢反抗，喜歡趴在籠蓋上。應(yīng)激5周后，CUMS組小鼠毛發(fā)凌亂、枯黃失澤，抓取時容易脫毛，對冰水浴、熱水浴刺激的耐受能力下降(耐受時間<3 min)，合籠時相互毆斗不太劇烈，抓尾巴時反應(yīng)遲鈍，抓頸部皮膚時不反抗，平時嗜睡、蜷臥在籠角落里。對照組小鼠依然活潑好動，毛發(fā)光澤，未出現(xiàn)脫毛等現(xiàn)象。第7周后CUMS組小鼠后頸、背、頭等身體各部分毛發(fā)出現(xiàn)片狀脫落，精神萎靡、體型瘦削。見圖1。

圖1 毛發(fā)變化

2.2 體質(zhì)量變化 造模開始之前2組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模開始之后，前3周對照組和CUMS組小鼠體質(zhì)量均有不同程度的增長，2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。至造模第4周后，CUMS組小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢，2組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 體質(zhì)量變化

2.3 肛溫的變化 與對照組比較，CUMS組在造模第3、5、8周肛溫差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，可認為造模過程中或造模建立后CUMS組小鼠體溫未出現(xiàn)顯著變化，體溫正常。見圖3。

圖3 2組小鼠肛溫比較

2.4 對行為學(xué)變化的影響

2.4.1 糖水偏好實驗 分別在造模第3、5、8周末對所有小鼠進行糖水偏好實驗，計算2組小鼠糖水偏好百分比，并且這3個時間點CUMS組糖水偏好率顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，可認為此時間點CUMS組小鼠糖水攝入量均低于對照組。見圖4。

圖4 糖水偏好實驗

2.4.2 曠場實驗 本研究重點觀察了2組小鼠在造模第3、5、8周后的OFT抑郁樣行為。其中造模第3、5周后，2組小鼠的OFT行為表現(xiàn)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；第8周后結(jié)果顯示，CUMS組小鼠水平運動總距離及運動速度均顯著小于對照組(均P<0.05)。見圖5～6。并且其中央?yún)^(qū)運動累積時間顯著少于對照組(P<0.05)。見圖7～8。垂直運動和修飾行為比較，CUMS組小鼠出現(xiàn)了垂直運動次數(shù)的減少而修飾行為的增多，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

圖5 運動速度

圖6 運動距離

圖7 中央格停留時間

圖8 曠場實驗軌跡

表1 2組小鼠直立次數(shù)比較次)

表2 2組小鼠修飾行為次數(shù)的比較次)

2.4.3 懸尾實驗 與對照組比較，造模第3、5、8周后，CUMS組小鼠懸尾實驗不動時間長，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖9。

圖9 懸尾實驗

2.4.4 強迫游泳 與對照組比較，造模第3周CUMS組強迫游泳不動的時間長，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可認為CUMS組小鼠表現(xiàn)為強迫游泳實驗不動時間出現(xiàn)了延長。造模第5、8周2組小鼠強迫游泳實驗不動的時間長雖均有延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖10。

圖10 強迫游泳實驗

2.4.5 不同時點CUMS組小鼠抑郁行為比較 對CUMS組小鼠造模3、5、8周時行為學(xué)變化進行多重比較：CUMS組小鼠在應(yīng)激過程中體質(zhì)量逐漸減輕(P<0.05)；SPT結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，這3個時間點糖水攝入量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；OFT結(jié)果顯示，CUMS組小鼠直立次數(shù)和中央各停留時間逐漸減少(均P<0.05)，修飾行為增多(均P<0.05)，水平運動總距離和運動速度造模8周時出現(xiàn)顯著縮短及減慢(P<0.05)；FST不動時間逐漸延長(P<0.05)；TST不動時間至造模第5周有顯著延長，造模第8周時開始縮短(P<0.05)。見表3。

表3 CUMS組小鼠各時間段行為學(xué)結(jié)果比較

3 討論

C57BL/6(B6)小鼠是生物醫(yī)學(xué)和行為實驗研究中使用最廣泛的品系，B6小鼠較活躍，學(xué)習能力強，且近交系動物品系提高了動物實驗的可靠性和重復(fù)性[18-19]，故本研究中選擇了B6的近交系C57BL/6N小鼠。

當前，抑郁癥的造模方法有20余種，目前常用有習得性無助(Learned Helplessness，LH)、慢性不可預(yù)知性溫和型應(yīng)激(CUMS)、社會失敗應(yīng)激(Social Defeat Stress，SDS)、生命早期應(yīng)激(Early Life Stress，ELS)、行為絕望(強迫游泳和小鼠懸尾)、給藥(如：糖皮質(zhì)激素)、基因操作等[20-21]。其中CUMS是目前最常用、最可靠，能有效模仿抑郁癥病因病機的嚙齒類動物抑郁模型[22]，該模型是20世紀80年代后期發(fā)展起來的，至今已有30多年的經(jīng)歷。CUMS模型誘導(dǎo)條件相對真實，通過給予各種不同壓力源，以防止或延遲習慣性，較常用的壓力源有：晝夜顛倒、社會壓力、禁飲、禁食、束縛、濕墊料、強迫游泳和傾斜等[23-24]。不同實驗室對CUMS內(nèi)容及操作也不盡一致，本研究通過傾斜、濕墊料、束縛、禁飲、禁食、冷水浴、熱水浴、晝夜交替、頻閃、空瓶刺激、夾尾、陌生異物、合籠、冷環(huán)境、長夜、長晝、大鼠墊料等刺激對C57BL/6N小鼠進行了連續(xù)8周的持續(xù)性刺激。

一般情況觀察發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于CUMS應(yīng)急后逐漸出現(xiàn)活動減少、精神不振、毛發(fā)變軟、易脫落；造模7周時上述情況更加惡化，甚至出現(xiàn)毛發(fā)片狀脫落。造模過程中CUMS組小鼠體質(zhì)量逐漸減輕，具有顯著時間-應(yīng)激交互作用；SPT顯示，造模3周時CUMS組小鼠糖水攝入量顯著下降，即出現(xiàn)了快感缺失，并且整個應(yīng)激過程中幾乎保持同一水平，可見C57BL/6N小鼠糖水攝入率的變化無顯著時間效應(yīng)。上述變化十分類似于大部分抑郁癥患者中出現(xiàn)的體質(zhì)量逐漸減輕、脫發(fā)、愉悅感喪失等臨床癥狀[25-26]。

CUMS應(yīng)激會逐漸削弱抑郁模型動物主動應(yīng)對壓力的動機，因此CUMS組小鼠在TST和FST不可避免的惡劣環(huán)境(水/懸尾)中會出現(xiàn)短時間內(nèi)適應(yīng)環(huán)境后放棄掙扎而保持不動的行為表現(xiàn)，即“絕望”情感狀態(tài)，雖然這2種實驗理論基礎(chǔ)相同，但是他們之間有區(qū)別，各品種動物對該實驗的敏感度不同[27]，有研究者發(fā)現(xiàn)C57BL/6品系在TST過程中有爬尾傾向[28-29]，本研究中C57BL/6N小鼠TST過程中亦出現(xiàn)了類似行為，并且FST中不動時間比TST長。經(jīng)各時間點分析發(fā)現(xiàn)，造模3周時CUMS組小鼠FST和TST不動時間均顯著延長；造模5周時TST和FST不動時間比3周時的更長，到8周時雖然2組組間比較CUMS組小鼠TST不動時間有顯著延長，但是CUMS組組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)其不動時間呈縮短趨勢，說明隨著時間的延長C57BL/6N小鼠對TST敏感性降低，產(chǎn)生了適應(yīng)性。在造模第5、8周時FST中，2組小鼠均出現(xiàn)了不動時間的延長，使得2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與季節(jié)更換有關(guān)，因為本實驗十月中旬開始進行，實驗后期時剛好是入冬。有研究表明，強迫游泳實驗會受到季節(jié)因素的影響，在冬天時老鼠強迫游泳不動時間會增多，而在春天會減少[30]，并且臨床上亦有發(fā)現(xiàn)，太陽照射時間的縮短，比如秋季，會增加抑郁癥發(fā)病率[31]，這說明季節(jié)因素在抑郁癥發(fā)病過程中可能有一定的影響。從這2種實驗中發(fā)現(xiàn)C57BL/6N小鼠較敏感于FST，隨著時間的延長該品種小鼠可能會對TST產(chǎn)生耐受。

OFT一般檢測抑郁模型動物在新的、陌生環(huán)境條件下的自主運動活動及探索行為(直立、爬墻、穿梭中央?yún)^(qū))的變化狀況[32]。本研究重點分析了C57BL/6N小鼠OFT水平運動總路程、運動速度、箱中央各停留累積時間、直立運動次數(shù)、修飾行為頻數(shù)等5個指標，并發(fā)現(xiàn)C57BL/6N小鼠遭受為期5周的CUMS后出現(xiàn)直立次數(shù)和中央各停留時間的顯著減少，而且其中直立行為隨著應(yīng)激時間的延長會逐漸減少；造模時間延期到第8周時則表現(xiàn)為水平運動總路程減小、運動速度減慢、修飾頻繁等。該時間較其他研究晚[33-34]，這可能和應(yīng)激程序或小鼠品系或品種不同有關(guān)。從上述異常的行為表現(xiàn)中得出：C57BL/6N小鼠受到應(yīng)激后先喪失了對外界的興趣，即探索能力，并且隨著應(yīng)激時間的延長逐漸加重，而它的自發(fā)運動能力當環(huán)境壓力已超過其承受能力時才出現(xiàn)減弱；而修飾行為是嚙齒類動物天生的行為，具有清潔及維護毛發(fā)、皮膚的作用，動物理毛時間及理毛次數(shù)與環(huán)境因素和壓力有關(guān)，壓力源會增加實驗動物的理毛次數(shù)[35-36]，正如本研究顯示，較長時間(8周)的CUMS誘C57BL/6N小鼠修飾行為次數(shù)頻繁。

經(jīng)各時間段行為學(xué)評價，從上述實驗結(jié)果分析可得出CUMS組小鼠行為變化具有逐漸性：應(yīng)激早期(3、5周時)出現(xiàn)快感缺失、絕望感，探索能力逐漸減弱，并且這些前期行為變化較符合于抑郁癥患者所出現(xiàn)的對外界事物興趣喪失、愉快感喪失、疲乏或精力減退、絕望感等輕度臨床抑郁表現(xiàn)[37]；到第8周時CUMS組小鼠抑郁表現(xiàn)更為顯著，CUMS組小鼠行為學(xué)障礙加重，其行為變化和嚴重抑郁癥患者臨床上所出現(xiàn)的運動執(zhí)行能力及社會交際或交往能力下降、探索思考能力減退等行為表象十分相似[38]。

4 小結(jié)和展望

綜上所述，本研究通過CUMS應(yīng)激誘導(dǎo)C57BL/6N小鼠建立了抑郁樣動物模型，并由此發(fā)現(xiàn)該模型中隨著造模時間的延長，C57BL/6N小鼠抑郁表現(xiàn)更為顯著，抑郁程度逐漸加重：首先出現(xiàn)快感缺失、絕望感、對外界興趣減退，隨著時間的延長會出現(xiàn)運動能力減弱等行為表現(xiàn)。本研究為今后針對抑郁癥各階段的藥物研究和對抑郁癥各階段的臨床表現(xiàn)及其進程的研究提供了參考，但是還需要進一步結(jié)合多項指標進行驗證。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6N小鼠對籠內(nèi)環(huán)境很敏感，平常喜歡干燥、干凈的環(huán)境，如若放在刨花類墊料籠里喜歡在籠角落建筑圓形巢穴，并且喜歡在自建巢穴里睡覺，白天喜歡爬在籠蓋欄桿上，但是每次濕籠過夜或束縛后表現(xiàn)為精神萎靡，爬桿或籠里運動減少等，所以適當增加濕籠子和束縛次數(shù)，可能會有助于縮短造模時間；此外將來研究抑郁模型動物筑巢方面的行為研究中C57BL/6N小鼠的實驗效果可能會較好。

抑郁動物模型的制備，尤其是CUMS模型易受環(huán)境因素的影響，不同的實驗環(huán)境以及CUMS刺激方式會導(dǎo)致不同的實驗結(jié)果，并且不同品系或品種動物對應(yīng)激的敏感程度不同，甚至行為學(xué)實驗(OFT、TST、FST)等表現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義[39]，例如：C57BL/6、BALBC、昆明、ICR等不同品系小鼠曠場行為表現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義[40]，除此之外C57BL/6品系中最常用的C57BL/6j和C57BL/6N之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義[41]，因此在不同實驗室很難得到一致的實驗結(jié)果。抑郁模型研究不僅注重實驗動物生理解剖結(jié)構(gòu)特點，還需要注重其本性情感特點，所以抑郁模型的制備需要將來從動物品系或品種以及性別的選擇、造模環(huán)境等方面進行進一步細化研究，并且按照動物的行為特點科學(xué)地選用合適的動物品系或品種，再選擇該實驗動物較敏感的刺激方式，從而提高模型效果以及實驗結(jié)果的一致性。