多組學(xué)技術(shù)在葛根品質(zhì)提升研究中的應(yīng)用進(jìn)展

胡心怡 吳田澤 侯 聰 鄭雅芹 鄧 港 劉 霞

(武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,武漢,430070)

葛根為豆科葛屬植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛。葛根性味甘、辛、涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、解酒毒等諸多功效[1]，是一味常用的傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史可以追溯到東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》。此外葛根中富含異黃酮，可用于降低血脂、血壓、血糖，具有保健功能，是原衛(wèi)生部首批發(fā)布的藥食兩用植物[2]。

近年來對(duì)于葛根的化學(xué)成分、藥理藥效等的研究已經(jīng)具體深入，對(duì)于育種栽培以及分子生物學(xué)研究也逐年增多。本文將對(duì)葛根資源分布、質(zhì)量控制、多組學(xué)研究、栽培育種和品質(zhì)提升等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，對(duì)多組學(xué)研究在葛根品質(zhì)提升方面的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)展望，以期推動(dòng)對(duì)葛根的進(jìn)一步開發(fā)利用。

1 葛根的資源與分布

全世界葛屬植物35種，主要分布在溫帶和亞熱帶地區(qū)，中國有8種，在貴州有分布[3]。野葛和粉葛2種葛屬植物常作藥用，在《中華人民共和國藥典》(2005版)之前并無區(qū)分，顧志平[4]在全國各地進(jìn)行了實(shí)地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)野葛在全國絕大多數(shù)地區(qū)均有分布，而粉葛則主要分布于廣西和廣東，人工栽培粉葛較為常見[4-5]。其調(diào)查到的我國葛屬植物分布見表1。

表1 我國葛屬植物分布

2 葛根的質(zhì)量控制

2.1 化學(xué)成分 葛根的主要成分包括異黃酮類化合物和三萜類化合物，除此之外還富含生物堿類、皂苷類、香豆素類和多糖類化合物等多種化學(xué)成分[6]，還富含人體必需氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素等[7]。葛根的這些主要成分使其同時(shí)兼具藥用和使用價(jià)值，因此對(duì)葛根的質(zhì)量控制尤其重要。

2.2 藥理學(xué)作用 葛根作為重要的藥食同源中藥材，其諸多有效成分能夠發(fā)揮多種藥理活性，如降低血壓、抗腦梗死、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、抗糖尿病、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗阿爾茨海默病、抗帕金森癥、抗抑郁、預(yù)防骨質(zhì)疏松、保護(hù)肝臟、解酒等作用。見表2。

3 葛根的多組學(xué)研究

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，藥用植物的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)隨之發(fā)展迅速，研究者們對(duì)于葛根的多組學(xué)研究也逐漸被報(bào)道。接下來將對(duì)近年來葛根的多組學(xué)研究進(jìn)行總結(jié)。

3.1 葛根的基因組學(xué)研究 Zhang等[27]利用Illumina HiSeq X Ten測序獲得了葛根葉綠體基因組，得到了全長153 411 bp的基因組，由一個(gè)84 131個(gè)堿基的大單拷貝區(qū)和一個(gè)17 990個(gè)堿基的短單拷貝區(qū)組成，中間隔著一對(duì)25 645個(gè)堿基的反向重復(fù)序列；葉綠體全基因組包含111個(gè)基因，其中77個(gè)為蛋白質(zhì)編碼基因、30個(gè)為tRNA基因，4個(gè)為rRNA基因；總GC含量為35.4%；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，野葛與豆薯比較接近。

Cao等[28]對(duì)葛根的完整葉綠體基因組進(jìn)行了組裝，得到了全長153 442 bp的基因組，包含84 162個(gè)大的單拷貝區(qū)和17 998個(gè)小的單拷貝區(qū)，25 641個(gè)堿基的反向重復(fù)序列，GC含量為35.41%；葉綠體全基因組共編碼129個(gè)基因，其中84個(gè)為蛋白質(zhì)編碼基因，37個(gè)為RNA基因，8個(gè)為rRNA基因。注釋后的基因組序列提交GenBank，登錄號(hào)為MT818508；此外還通過對(duì)豆科鳳蝶亞科48種植物的系統(tǒng)發(fā)育樹分析證明，葛根屬于豆科蝶形花亞科，與豆薯(P.erosus)、赤豆(V.angularis)和菜豆(P.vulgaris)親緣關(guān)系較近。

表2 葛根的藥理作用

Sun等[29]也對(duì)葛根的葉綠體基因組測序，并利用這些數(shù)據(jù)對(duì)基因組資源進(jìn)行了評(píng)估，得到葉綠體基因組全長共153 411個(gè)堿基，包含84 142個(gè)大的單拷貝區(qū)和17 998個(gè)小的單拷貝區(qū)；重新組裝和注釋表明，共編碼112個(gè)基因，其中78個(gè)為蛋白質(zhì)編碼基因，30個(gè)為tRNA基因，4個(gè)為rRNA基因；總GC含量為35.4%。

3.2 葛根的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 對(duì)葛根的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究始于2015年，近年來越來越多的研究者將目光投向葛根的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。研究內(nèi)容及結(jié)果總結(jié)見表3。

表3 葛根的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

續(xù)表3 葛根的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

3.3 葛根的代謝組學(xué)研究 Shang等[39]使用長閱讀的單分子測序和Hi-C技術(shù)組裝了高質(zhì)量的葛根基因組?；蚪M大小為1.37 GB，由5 145個(gè)重疊群組成，重疊群N50為593.70 kb；基因組結(jié)構(gòu)注釋產(chǎn)生了869.33 Mb的重復(fù)區(qū)域，占基因組62.70%，編碼蛋白質(zhì)的基因45 270個(gè)；進(jìn)化分析表明，葛根與大豆的親緣關(guān)系最近，經(jīng)歷了2次古老的全基因組復(fù)制事件——一次是在豆科物種的共同祖先中，另一次是在大約720萬年前物種形成后獨(dú)立發(fā)生的；與其他5種豆科植物相比，葛根共有2 373個(gè)基因家族是獨(dú)一無二的；還對(duì)與葛根素含量相關(guān)的基因和代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，共鑒定了572個(gè)在葛根素生物合成途徑中上調(diào)的基因，235個(gè)候選基因通過組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步豐富；此外，還鑒定了6個(gè)與葛根素代謝密切相關(guān)的8-C-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(8-C-GT)候選基因，填補(bǔ)了豆科植物基因組的一個(gè)重要空白，為葛根的遺傳改良提供了有價(jià)值的多基因組資源。

Shang等[40]還進(jìn)行了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的廣靶代謝組學(xué)分析，共鑒定了614種代謝物，其中包括初生代謝物和次生代謝物，不同品種積累特異代謝物；進(jìn)行了主成分分析、聚類分析、KEGG富集分析來進(jìn)行代謝組學(xué)分析，用Log2FC≥3和VIP≥1來進(jìn)行營養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明，葛根與其變種之間的營養(yǎng)差異可以用氨基酸、核苷酸、糖類和脂類豐度的差異來解釋，而葛根與其變種之間藥用品質(zhì)差異則是由異黃酮類、異黃酮類、酚酸、有機(jī)酸和香豆素含量的差異造成的；此外，還確定了對(duì)3個(gè)葛根品種進(jìn)行分類的關(guān)鍵代謝物。

3.4 葛根的蛋白組學(xué)研究 暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。

4 葛根的育種栽培

4.1 葛根的種植技術(shù) 葛根在中國的栽培歷史悠久，最常見的葛屬植物有常作藥用的野葛和常做食用的粉葛。野葛在中國分布廣，除新疆、西藏外其余各省皆有分布，而粉葛更是以栽培為主，因此出現(xiàn)了多個(gè)有“粉葛之鄉(xiāng)”之稱的粉葛種植地，葛根的栽培技術(shù)在實(shí)踐中積累經(jīng)驗(yàn)不斷完善提升，從土地選擇、精細(xì)整地、堆捂營養(yǎng)土、種藤選取、芽節(jié)扦插、防治病蟲害等各個(gè)方面進(jìn)行了具體而科學(xué)的規(guī)范，以達(dá)到高產(chǎn)高抗的種植目標(biāo)[41]。

葛根喜溫喜濕，大多生長在海拔1 600～2 100 m的背陰坡地，適宜生長溫度為12～16 ℃。葛根于2月上旬開始萌芽，4～9月生長旺季，11月中旬生長減緩直至不再生長，在12月到次年2月之間為采收期，越冬率可達(dá)100%[42]。葛根耐寒耐干旱，對(duì)土壤的要求不高，因此在國內(nèi)種植范圍十分廣闊。

4.2 葛根的新品種選育 近年來，人們對(duì)藥食藥膳、綠色食品等健康飲食的需求越來越高，對(duì)葛根的食品開發(fā)和育種栽培等的研究也逐漸增多；另一方面，國家對(duì)葛根的加工工藝和流程等制定了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，使食用葛根的質(zhì)量和食品安全大大提高[43]。各研究所和藥企也開始開展葛根新品種選育相關(guān)工作，雖然目前我國葛根新品種報(bào)道較少，選育進(jìn)程緩慢，但也有了一定成效，選育出一系列優(yōu)良葛根新品種，如湘葛系列、贛葛系列、宋葛系列、橫峰系列、“恩葛-08”“桂葛1號(hào)”“桂粉葛1號(hào)”以及木生葛根、糯粉葛、菜粉葛和綠健葛根等[44-48]。

5 組學(xué)研究在品質(zhì)提升方面的應(yīng)用

葛根的有效成分絕大多數(shù)是它的次生代謝產(chǎn)物，代謝途徑需要多種酶催化，找到合成有效成分的關(guān)鍵酶，就能了解在藥材有效成分合成的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而利用基因工程技術(shù)對(duì)有效成分進(jìn)行調(diào)控和生產(chǎn)。

5.1 藥用有效成分葛根素 葛根素是葛根中最主要的藥用活性成分，近年來對(duì)葛根素合成相關(guān)的研究逐漸增多，找到了一些與葛根素合成相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄因子和酶等，在3.2中進(jìn)行了詳細(xì)論述。Wang等[31]對(duì)PlUGT43(一種葛根葡糖基轉(zhuǎn)移酶)進(jìn)行了分子克隆和功能鑒定，生化分析表明，PlUGT43具有大豆苷元C-糖基化為葛根素的活性，對(duì)異黃酮類大豆苷元和染料木素具有活性，但對(duì)包括黃酮類在內(nèi)的其他潛在受體沒有活性，證實(shí)了PlUGT43在葛根素生物合成中的作用。

5.2 膨大機(jī)制和淀粉合成 葛根作為重要的藥食同源植物，富含淀粉、黃酮和葛根素等成分，除可作藥用治療多種疾病，其食用價(jià)值也很高。葛根除了可以作為蔬菜鮮食、炒菜、煲湯之外，最常見的是加工成為葛根粉，還可做成葛根面條、饅頭、果糕、酒、茶、飲料等特色食品[2]。粉葛生長快、塊莖大且富含淀粉，是人工種植最多的葛根品種，因此對(duì)葛根的膨大機(jī)制和淀粉合成相關(guān)基因的研究也不在少數(shù)。劉冬梅等[49]選取了普通葛根和塊根膨大的野生型突變型葛根，運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行差異分析，分析結(jié)果篩選出5個(gè)特異表達(dá)片段，發(fā)現(xiàn)它們參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗脅迫應(yīng)答、電子傳遞和光合代謝等反應(yīng)。郭麗君[50]為了提高葛根產(chǎn)量，克隆了淀粉合成關(guān)鍵酶腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)小亞基基因(sAGP)和大亞基基因(LAGP)，探究其對(duì)葛根塊根長度、粗細(xì)、重量和產(chǎn)量的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)AGPase基因表達(dá)變化是植物通過自身信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互作用調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控淀粉合成關(guān)鍵酶活性變化，從而影響淀粉成分及含量變化。

5.3 抗逆 葛根喜愛濕潤溫暖的環(huán)境，干旱、低溫等環(huán)境因素會(huì)對(duì)葛根的生長帶來影響，因此可以利用溫度、光照、水分等非生物脅迫或者病蟲害等生物脅迫來篩選葛根相關(guān)的抗逆基因，為抗逆性強(qiáng)的葛根品種選育打下基礎(chǔ)，以提高葛根的品質(zhì)性狀和產(chǎn)量性狀。

6 展望

近年來，對(duì)葛根的分子研究逐漸增多，多組學(xué)研究特別是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究十分火熱。研究者主要專注于葛根異黃酮類化合物合成相關(guān)的基因和代謝通路進(jìn)行研究，獲得了長足進(jìn)展。然而，葛根的基因組學(xué)研究進(jìn)展緩慢，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究更是尚未起步。因此，可以利用多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)，挖掘葛根素等有效成分生物合成相關(guān)的基因、調(diào)控蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子以及次生代謝途徑等，從而從分子層面對(duì)葛根分子研究的短板進(jìn)行填補(bǔ)。

多組學(xué)研究可以從基因水平對(duì)葛根的品質(zhì)提升進(jìn)行指導(dǎo)，目前大部分研究針對(duì)的是葛根素合成相關(guān)的基因和酶，還有一部分研究專注于葛根膨大機(jī)制和淀粉合成，對(duì)于葛根抗逆方面的研究還有待提升。因此，可以利用溫度、光照、水分等非生物脅迫或者病蟲害等生物脅迫來篩選葛根相關(guān)的抗逆基因，從而提升葛根的抗逆性。

在葛根的種植和新品種選育方面，相對(duì)于常見的蔬菜水果等，葛根的品種選育進(jìn)展較為緩慢，全國報(bào)道的葛根新品種不多，且推廣種植面積較小。另外，最主要的藥用成分葛根素在野葛中含量較高，在粉葛中含量較低，但是主要選育和種植的葛根絕大部分為淀粉含量高、食用價(jià)值高的粉葛，其葛根素含量很難達(dá)到藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于富含藥用有效成分葛根素的野葛的新品種選育有待加強(qiáng)。