補(bǔ)腎活血法治療腰椎間盤突出癥的用藥規(guī)律和潛在分子機(jī)制預(yù)測

劉 劍 楊 雷 沈 浮 聶 穎

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙，410007； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208)

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Herniation，LDH)是導(dǎo)致腰腿痛最常見的原因之一[1]，其主要病理學(xué)變化包括早期的纖維環(huán)內(nèi)板層膠原網(wǎng)絡(luò)的紊亂加之椎間盤髓核中蛋白多糖的丟失，導(dǎo)致椎間盤的水分減少，隨著纖維環(huán)撕裂的加重，使得凝膠狀的髓核組織突出并壓迫腰骶神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)等鄰近組織[2]。隨著社會人口老齡化和人們生活方式的改變，LDH的發(fā)病率明顯增加。LDH具有高致殘率，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[3-4]。然而大多數(shù)的LDH患者并不需要手術(shù)治療。近年來，中醫(yī)藥治療越來越受到人們的重視。LDH歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰痹”病范疇，病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，其中以腎虛為本、瘀血為標(biāo)，加之腎虛勞傷，感受寒濕之邪誘發(fā)經(jīng)絡(luò)閉阻，氣血瘀滯而發(fā)病[5]。腎主骨，腎虛則元?dú)獠蛔?，氣血運(yùn)行不暢，瘀血內(nèi)生，腰府失養(yǎng)，日久凝結(jié)成痹，腎虛同時伴有血瘀，血瘀隨時間遷移可出現(xiàn)腎虛，二者又能互為因果而成惡性循環(huán)[6-7]，因此補(bǔ)腎活血、標(biāo)本兼治為目前LDH辨證論治的基本大法。

由于醫(yī)家臨證經(jīng)驗(yàn)的差異性和中藥本身的復(fù)雜性，補(bǔ)腎活血法在治療LDH的臨床運(yùn)用中處方側(cè)重各有不同，因此，從有效治療LDH的臨床方劑中挖掘用藥規(guī)律及尋找核心方藥并分析其作用機(jī)制，對于豐富補(bǔ)腎活血法的科學(xué)內(nèi)涵及新藥的開發(fā)具有重要意義。隨著信息科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，數(shù)據(jù)挖掘、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等新興技術(shù)的應(yīng)用極大地促進(jìn)了中醫(yī)藥的科學(xué)認(rèn)識，在解決中醫(yī)藥復(fù)雜性方面發(fā)揮了重要作用[8]。數(shù)據(jù)挖掘被公認(rèn)為發(fā)掘核心配伍及處方潛在關(guān)聯(lián)的重要工具[9]，為經(jīng)驗(yàn)用藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)搭建了橋梁，利于名醫(yī)處方的梳理與挖掘，為方劑精準(zhǔn)配伍與診療提供了新視角。而多組分、多靶點(diǎn)的中藥方劑干預(yù)疾病的多種復(fù)雜因素大大增加了中藥復(fù)方機(jī)制研究的難度，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥理學(xué)新興分支學(xué)科，在揭示化學(xué)成分復(fù)雜的中藥復(fù)方的藥理學(xué)規(guī)律上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，并且其整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治等基本理論趨于一致，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的科技支撐[10-11]。本研究利用數(shù)據(jù)挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的新研究模式，對補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的用藥規(guī)律及機(jī)制進(jìn)行綜合分析，為補(bǔ)腎活血法的中醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)提供循證醫(yī)學(xué)理論支撐，為后續(xù)研究提供新的研究思路和策略。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源 本研究的所納入的處方均來自于國家知識基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)，為保證文獻(xiàn)的質(zhì)量，文獻(xiàn)的來源限定為“中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊”“中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫”或“中文核心期刊目錄總覽”3類數(shù)據(jù)庫，高級檢索條件設(shè)置為(“腰椎間盤突出癥”O(jiān)R“腰椎間盤突出”)AND“腎虛”AND“血瘀”，閱讀文獻(xiàn)內(nèi)容并提取腎虛血瘀相關(guān)LDH的中藥處方，時間設(shè)定為2000年1月1日至2020年8月1日。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)納入的中藥處方符合補(bǔ)腎活血法治療LDH的相關(guān)臨床研究文獻(xiàn)，包括臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)、臨床案例報道、名老中醫(yī)專家經(jīng)驗(yàn)等；2)納入的文獻(xiàn)需有“腎虛血瘀型”“腎虛血瘀證”等辨證的相關(guān)描述；3)處方中各中藥的組成需明確，對于多次復(fù)診的臨床病案只納入首次處方；4)處方的療效在文獻(xiàn)中應(yīng)明確記載有效。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、理論總結(jié)、系統(tǒng)綜述等非臨床相關(guān)研究文獻(xiàn)；2)中藥外治、離子導(dǎo)入等非口服藥物治療文獻(xiàn)；3)方劑中藥物組成不全面或單味用藥的文獻(xiàn)；4)剔除相同用藥文獻(xiàn)。

1.4 研究方法

1.4.1 藥名規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)處理 依據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》對納入藥物名稱標(biāo)準(zhǔn)化處置[12]，而炮制方法具有差異的或者同類藥物不同稱呼的進(jìn)行名字的統(tǒng)一規(guī)范。

1.4.2 數(shù)據(jù)錄入與核對 將篩選并規(guī)范后的處方錄入中醫(yī)傳承計(jì)算平臺V3.0(TCMICS V3.0)中的數(shù)據(jù)采集模塊中，為避免錄入時可能出現(xiàn)的紕漏，由2人負(fù)責(zé)核準(zhǔn)相關(guān)數(shù)據(jù)，來確保數(shù)據(jù)錄入準(zhǔn)確性。

1.4.3 藥物頻次屬性統(tǒng)計(jì) 依據(jù)藥物出現(xiàn)的頻次高低進(jìn)行排序，并統(tǒng)計(jì)藥物的四氣、五味、歸經(jīng)信息，進(jìn)行可視化展示。

1.4.4 組方關(guān)聯(lián)規(guī)律分析 設(shè)置TCMICS V3.0平臺中的“支持度個數(shù)”參數(shù)為17，“置信度”參數(shù)為0.5，點(diǎn)擊用藥模式、規(guī)則分析、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洳?dǎo)出Excel及可視化，用以分析方劑藥物的組方關(guān)聯(lián)規(guī)律。

1.4.5 組方聚類規(guī)律分析 k均值聚類算法(k-means Clustering Algorithm)是基于迭代求解進(jìn)行聚類算法的分析方法，其把任意研究對象支配于其距離最短的聚類中心，以達(dá)到最佳的聚類選擇[13]。利用TCMICS V3.0平臺中的k均值聚類算法與回歸模型對處方進(jìn)行聚類規(guī)則分析，聚類個數(shù)設(shè)置為5個，進(jìn)行核心類方組合提取，并在核心類方的基礎(chǔ)上模擬出新處方。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.5.1 核心藥物組合及類方的成分及靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18篩選核心藥物的活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)，與GeneCards、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數(shù)據(jù)庫中獲取的LDH靶基因相映射，獲取核心處方干預(yù)LDH的潛在靶標(biāo)，并建立藥物-活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.5.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，在Network Analyzer插件中以拓?fù)鋮?shù)度值(Degree)大于中位數(shù)的2倍為關(guān)鍵靶蛋白，繪制核心PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5.3 基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 利用R語言(clusterProfiler包)完成潛在靶點(diǎn)的基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻次統(tǒng)計(jì)分析 共篩選并整理出104首補(bǔ)腎活血法治療LDH的中藥方劑，共涉及中藥233味，其中使用頻次最高的分別是當(dāng)歸、牛膝、甘草、川芎、地龍。38味藥物的使用頻次大于10，小于10的藥物有195味。藥物使用頻次超過15的藥物見表1。

表1 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中高頻藥物頻次分布(頻次≥15次)

2.2 藥物性味歸經(jīng)功效統(tǒng)計(jì) 233味藥的屬性中，性溫的中藥所占比例最多，約50.6%；五味中味苦的最多，占32.5%；歸經(jīng)多屬于肝、脾、腎，其占比分別為30.3%、16.3%、15.9%；功效多屬于補(bǔ)虛類、活血化瘀類，其占比分別為28.7%、26.7%。見圖1。

圖1 補(bǔ)腎活血法治療LDH用藥性味歸經(jīng)功效規(guī)律統(tǒng)計(jì)

2.3 組方關(guān)聯(lián)規(guī)律分析結(jié)果 關(guān)聯(lián)較為密切的藥物組合共44組。在藥對組合模式中當(dāng)歸、牛膝的出現(xiàn)頻次最高，為36次；在多味藥組合模式中，當(dāng)歸、牛膝、川芎出現(xiàn)的次數(shù)最高，為23次；當(dāng)歸、川芎、紅花、桃仁在4味藥組合模式出現(xiàn)的頻次最高，為18次。按藥物組合出現(xiàn)頻次由高到低排序見表2。核心藥物網(wǎng)絡(luò)展示見圖2。

表2 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中的藥物組合分布情況(支持度≥17次)

圖2 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中核心藥物網(wǎng)絡(luò)

2.4 基于聚類分析的方劑組方規(guī)律分析 本研究前期進(jìn)行聚類模擬中發(fā)現(xiàn)，將處方組合分為5類時，得到的聚類選擇的處方最佳，其核心類方組合見表3。以當(dāng)歸、紅花、川芎、桃仁、甘草為核心的活血化瘀類方組合的支持度最高，其代表方為身痛逐瘀湯和桃紅四物湯加減，其次為牛膝、當(dāng)歸、川芎、獨(dú)活、杜仲為核心的補(bǔ)腎活血類方，代表方為補(bǔ)腎活血湯。用不同顏色的節(jié)點(diǎn)表示不同類方的聚類藥物，本研究納入的處方藥物基本在回歸曲線的周圍分布較為集中，表示本聚類可信度較高。見圖3。

表3 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中的核心藥物類方

圖3 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中的核心藥物類方回歸模型

2.5 核心藥物組合的成分及靶點(diǎn)篩選 核心藥物組合以及核心類方進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸(Danggui)、牛膝(Niuxi)、甘草(Gancao)、川芎(Chuanxiong)、杜仲(Duzhong)、紅花(Honghua)、桃仁(Taoren)、黃芪(Huangqi)、秦艽(Qinjiao)、沒藥(Moyao)、乳香(Ruxiang)、獨(dú)活(Duhuo)12位藥物處于核心地位，對其進(jìn)行活性成分篩選，核心藥物共涉及活性成分178個，甘草、杜仲、沒藥活性成分占比較高，分別為29.3%、20.4%、14.3%。見圖4A。核心藥物的活性成分與LDH的交集靶標(biāo)共有52個。見圖4B?！八幬?活性成分-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)244個，邊839條，平均度值為6.8。其中MOL000098(槲皮素)、MOL000006(木犀草素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷固醇)、MOL000173(漢黃芩素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)為關(guān)鍵活性成分，其度值分別為47、20、19、17、16、15。關(guān)鍵靶基因?yàn)榄h(huán)氧合酶-2、雌激素受體1、雄激素受體、誘生型一氧化氮合酶、乙酰膽堿酯酶，度值分別為102、91、76、75、35。見圖5。

圖4 補(bǔ)腎活血法治療LDH處方中的核心藥物的活性成分分布情況及與LDH疾病的交集靶標(biāo)韋恩圖

圖5 補(bǔ)腎活血法治療LDH的核心藥物的“藥物-活性成分-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)46個，邊126條，得到度值的中位數(shù)為5.3，以該值的2倍為核心靶蛋白，JUN、AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA、FOS、MAPK14給出中文如IL(白細(xì)胞介素6)的度值符合核心靶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，成為補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的核心靶蛋白。見圖6。

圖6 補(bǔ)腎活血法治療LDH的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.7 GO及KEGG富集分析 預(yù)測得出潛在靶點(diǎn)的生物過程(Biological Process，BP)527條，細(xì)胞組分(Cell Component，CC)33條，及分子功能(Molecular Function，MF)82條，按照富集的基因數(shù)目進(jìn)行排序，對排名前10位的條目進(jìn)行柱狀圖展示。見圖7。

共富集到135條信號通路。前15條通路見表4。補(bǔ)腎活血法核心藥物干預(yù)LDH的潛在通路與TNF Signaling Pathway(腫瘤壞死因子信號通路)、IL-17 Signaling Pathway(IL-17信號通路)、MAPK Signaling Pathway(MAPK信號通路)、PI3K-AKT Signaling Pathway(PI3K-AKT信號通路)、HIF-1 Signaling Pathway(HIF-1信號通路)等炎性相關(guān)通路密切相關(guān)，在Th17 Cell Differentiation(Th17細(xì)胞分化相關(guān)通路)、T Cell Receptor Signaling Pathway(T細(xì)胞受體信號通路)等免疫相關(guān)通路基因富集數(shù)目較多。

圖7 補(bǔ)腎活血法方劑核心藥物干預(yù)LDH的GO富集分析

表4 補(bǔ)腎活血法方劑核心藥物干預(yù)LDH組相關(guān)KEGG富集分析

2.8 補(bǔ)腎活血類方干預(yù)LDH的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)模型”中，類方的度值排名前5的活性成分均為：山柰酚、槲皮素、豆甾醇、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇。見圖8。補(bǔ)腎活血類方中特有活性成分為當(dāng)歸素(Angelicone)、歐前胡素(Ammidin)等?；钛鲱惙街刑赜谢钚猿煞钟凶匣ㄇ昂?Nodakenin)、赤霉酸(Gibberellin)等。健脾補(bǔ)腎類方中特有活性成分有綿馬酚(Aspidinol)、柚苷素(Naringenin)、佛手內(nèi)酯(Bergapten)等?；钛ńj(luò)類方中特有活性成分為：蚓堿(Lumbritin)、溶蚓素(Lumbrolysin)、蚯蚓解熱堿(Lumbrifebrine)等。見表5。

類方中共有活性成分干預(yù)LDH的靶蛋白中IL6、AKT1、IL1B、VEGFA、MAPK1、JUN給出中文如IL(白細(xì)胞介素6)的度值最高。而補(bǔ)腎活血類方、滋陰補(bǔ)腎類方、活性化瘀的特征性靶蛋白分別為多巴胺D3受體、胰島素、維生素D受體，健脾補(bǔ)腎類方與白細(xì)胞介素17A、腫瘤壞死因子關(guān)系密切?；钛ńj(luò)類方中核心靶蛋白為C-X-C基序趨化因子配體8、核因子κB亞基1。見圖9。

圖8 補(bǔ)腎活血類方干預(yù)LDH的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)模型”

表5 補(bǔ)腎活血相關(guān)類方干預(yù)LDH的特征性活性成分

圖9 補(bǔ)腎活血類方干預(yù)LDH的PPI模型

3 討論

LDH作為一種退行性疾病，是長期腰腿痛、下肢神經(jīng)功能受損的重要原因之一。大多數(shù)LDH患者可以通過藥物、物理療法以及類固醇注射等非手術(shù)治療取得良好的臨床效果，而強(qiáng)調(diào)辨證論治的中醫(yī)藥療法作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的寶貴財富，其根據(jù)發(fā)病季節(jié)、特點(diǎn)和個體差異采用的個性化治療策略在臨床治療LDH中具有獨(dú)特療效，且避免了西藥的不良反應(yīng)[14]。本病的病機(jī)主要由于腎精虧虛、生化乏源，腎精虧虛而主骨無力，從而出現(xiàn)下肢麻痛等不適[15]，中醫(yī)認(rèn)為“痹久多瘀”“血瘀”與“腰痹”互為因果關(guān)系，故“腎虛”為本，“血瘀”為標(biāo)而發(fā)為腰痹[16]，因此，肝腎虧虛、瘀血內(nèi)停為LDH的重要病機(jī)，所以施以補(bǔ)腎活血之法正切病機(jī)。

從宏觀角度來探討補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的用藥規(guī)律，本研究以腎虛血瘀型LDH為研究對象，對距今20年以內(nèi)的相關(guān)核心雜志文獻(xiàn)進(jìn)行處方收集，利用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺軟件進(jìn)行藥物頻次統(tǒng)計(jì)分析得出，當(dāng)歸、牛膝、甘草、川芎、地龍的使用頻次最高，在藥物的屬性中，四氣歸屬性溫的中藥占比最多，且歸經(jīng)多屬于肝、脾、腎經(jīng)，功效多屬于補(bǔ)虛類、活血化瘀類，這與本研究納入的LDH屬于腎虛血瘀的證型相符合。在中藥的功效分析中，除補(bǔ)腎活血類中藥以外，亦多見配伍祛風(fēng)除濕、解表散寒之藥，體現(xiàn)LDH病性多屬于本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，病機(jī)在本為肝脾腎不足，在標(biāo)為寒濕之邪閉阻絡(luò)脈?；陉P(guān)聯(lián)規(guī)則對補(bǔ)腎活血法治療LDH進(jìn)行組方規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸、牛膝藥對出現(xiàn)頻次最高。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸具有良好的抗炎活性及神經(jīng)保護(hù)功效，當(dāng)歸提取物可降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW264小鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[17]，且當(dāng)歸酮對小鼠成纖維細(xì)胞中神經(jīng)生長因子的產(chǎn)生有促進(jìn)作用[18]。牛膝總皂苷作為牛膝的主要活性成分，可通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1自噬信號通路促進(jìn)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞存活和細(xì)胞外基質(zhì)合成[19]。在4味藥組合模式中，當(dāng)歸、川芎、紅花、桃仁的組合處于核心地位，為《醫(yī)宗金鑒》中桃紅四物湯的主要成分，動物實(shí)驗(yàn)研究表明，能夠顯著降低血瘀模型大鼠全血、血漿及血清的黏度比，具有較好的抗血小板活化及抗血栓作用，從而達(dá)到中醫(yī)意義上的活血化瘀作用[20]。因此，采用數(shù)據(jù)挖掘方法得出的高頻中藥，其治療LDH亦有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。此外，采用k均值聚類算法得出的聚類方案中，將補(bǔ)腎活血法治療LDH的處方用藥分為5類時，回歸模型提示，納入藥物集中分布于核心類方曲線周圍，說明所得核心類方最具有代表性。核心類方的來源多為補(bǔ)腎活血湯、身痛逐瘀湯以及六味地黃湯中的藥物，并且聚類處方除活血化瘀、補(bǔ)腎活血法支持度最高以外，通絡(luò)、健脾、滋陰之法常配合補(bǔ)腎活血協(xié)同運(yùn)用，體現(xiàn)補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH治法的靈活性。

對補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的核心藥物進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸、牛膝、甘草、川芎、杜仲、紅花、桃仁、黃芪、秦艽、沒藥、乳香、獨(dú)活12位藥物處于核心地位，在“藥物-活性成分-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型中，槲皮素、木犀草素、山柰酚為關(guān)鍵活性成分，并作用于環(huán)氧合酶-2、雌激素受體1、雄激素受體等多個靶基因，體現(xiàn)補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。槲皮素、木犀草素均為抗氧化作用較強(qiáng)的黃酮化合物，槲皮素不僅具有神經(jīng)保護(hù)功效，還能提高肌肉的抗疲勞耐性[21]，研究證實(shí)槲皮素在氧化損傷介導(dǎo)的神經(jīng)退化模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，還可以通過抑制核因子κB通路激活減輕周圍神經(jīng)缺血再灌注損傷[22]，其可抑制Toll樣受體4/核因子κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及C-胱天蛋白酶3和Bax的表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡以減輕神經(jīng)損傷[23]。槲皮素可通誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活物-1α的表達(dá)，調(diào)節(jié)線粒體氧化酶的活性從而提高機(jī)體肌肉的疲勞耐受力[24]。木犀草素的多種藥理活性被證實(shí)與其抗炎作用有關(guān)，其結(jié)構(gòu)含有一定數(shù)目的酚羥基，可通過抑制一氧化氮合酶來減少一氧化氮的合成以發(fā)揮抗炎及抗氧化的作用[25]。山柰酚具有多種成骨生物活性，如抑制破骨細(xì)胞生成和誘導(dǎo)軟骨生成[26]，其可通過降低炎癥介質(zhì)水平和通過抑制核因子κB P65的核移位來增加抗炎細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-10)以減輕炎癥[27]。在類方的特征性活性成分中，蟲類藥物的使用使作用于LDH的靶點(diǎn)更為豐富，活血通絡(luò)類方中的地龍含有豐富的蚓素，不僅具有良好的解熱鎮(zhèn)痛功效，還具有抗凝、促進(jìn)血液循環(huán)的作用[28]。本研究對補(bǔ)腎活血法核心藥物活性與潛在靶點(diǎn)有較高親和力的成分進(jìn)行預(yù)測，但未被報道的成分可后期開展藥效實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，可為中藥功效及標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

PPI網(wǎng)絡(luò)模型提示補(bǔ)腎活血法核心藥物組合通過JUN、蛋白激酶B1、白細(xì)胞介素6、促分裂原活化的蛋白激酶1、血管內(nèi)皮生長因子A、FOS、促分裂原活化的蛋白激酶14干預(yù)LDH的可能性較大。JUN是一種快速反應(yīng)早期基因，c-Jun氨基端激酶是促分裂原活化的蛋白激酶家族的重要成員，并參與病理性神經(jīng)痛的發(fā)生[29]。椎間盤組織中的白細(xì)胞介素-6炎癥介質(zhì)在椎間盤退變的早期可顯著增加，其在LDH神經(jīng)損傷和病理性疼痛的發(fā)生中起重要作用，白細(xì)胞介素-6抑制劑可顯著減輕慢性壓迫模型大鼠的疼痛[30]。有學(xué)者利用白細(xì)胞介素-6基因沉默治療LDH，可顯著減輕脊髓神經(jīng)早剝模型大鼠的機(jī)械性痛覺過敏[31]。蛋白激酶B1在退化椎間盤組織的新生血管的生長中也起著重要作用，而新的血管生成可能是一個負(fù)性因素，它可以招募炎癥介質(zhì)和細(xì)胞，加速基質(zhì)破壞和退化過程[32]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在椎間盤退變及病程進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，目前有學(xué)者提出VEGF的過表達(dá)可能是退變模型的椎間盤組織退變的始發(fā)因素，亦可能是自我修復(fù)以及自噬的結(jié)果[33]。而在類方的作用靶蛋白的結(jié)果中，五大類方所得共有的作用靶蛋白與核心藥物組合的靶點(diǎn)類似，而每類處方作用的特征性靶點(diǎn)則各有不同，補(bǔ)腎活血類方、滋陰補(bǔ)腎類方、活性化瘀的特征性靶蛋白分別為多巴胺D3受體、胰島素、維生素D受體，健脾補(bǔ)腎類方與白細(xì)胞介素17A、腫瘤壞死因子關(guān)系密切?；钛ńj(luò)類方中核心靶蛋白為C-X-C基序趨化因子配體8、核因子κB亞基1核因子κB亞基1，其中白細(xì)胞介素17A、腫瘤壞死因子均與炎癥反應(yīng)相關(guān)。有研究報道核因子κB亞基1在鼠髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡中發(fā)揮促進(jìn)作用[34]，維生素D受體的基因多態(tài)性同樣影響著椎間盤退變的發(fā)生率[35]，而CXC趨化因子配體8以及多巴胺D3受體尚無文獻(xiàn)報道其為LDH的相關(guān)靶點(diǎn)。

綜上分析，補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的靶點(diǎn)較為豐富，也側(cè)面印證了中藥復(fù)方干預(yù)疾病的復(fù)雜性。

在補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的GO及KEGG通路分析中，關(guān)鍵通路主要與腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素-17信號通路、PI3K/AKT等炎癥相關(guān)通路密切相關(guān)，在Th17細(xì)胞分化相關(guān)的免疫相關(guān)通路基因富集數(shù)目較多?，F(xiàn)代研究證實(shí)了本預(yù)測結(jié)果中相關(guān)炎癥通路在椎間盤退變中的關(guān)聯(lián)性，白細(xì)胞介素-17A與椎間盤退變密切相關(guān)，其可通過介導(dǎo)腫瘤壞死因子-α信號上調(diào)退變模型小鼠髓核細(xì)胞ADMA-TS-7的表達(dá)來影響免疫缺陷病(Immunodeficiency Disease，IDD)的發(fā)生[36]，并且白細(xì)胞介素-17A可通過激活人退變髓核細(xì)胞中的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信號通路來抑制自噬，可能有助于開發(fā)未來的靶向治療方法[37]。在髓核所處的復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境中，含有高水平的硫酸化蛋白聚糖，其通過與陽離子的相互作用，為組織提供其特有的生物力學(xué)特性，現(xiàn)代研究證實(shí)，PI3K/AKT激活能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、遷移和黏附，是控制聚集蛋白聚糖合成的重要途徑[38]。自身免疫學(xué)說是LDH發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，Th17細(xì)胞在許多免疫介導(dǎo)疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，Th17相關(guān)的細(xì)胞因子通過上調(diào)退變椎間盤細(xì)胞CC趨化因子配體20的分泌而形成一個正相趨化性反饋環(huán)，從而在退變椎間盤的發(fā)育中起作用[39]。因此，補(bǔ)腎活血法治療LDH作用機(jī)制不僅涉及抑制局部組織的炎癥反應(yīng)，還可能通過調(diào)節(jié)全身免疫平衡的途徑進(jìn)行綜合干預(yù)，這與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念不謀而合，亦體現(xiàn)了補(bǔ)腎活血法在痹證治療中的科學(xué)內(nèi)涵。

本研究亦有諸多不足之處。首先，本研究基于CNKI進(jìn)行文獻(xiàn)的收集，且納入的數(shù)量有限，而對于補(bǔ)腎活血法的理解著眼于各醫(yī)家自身的理解，以各醫(yī)家醫(yī)案處方的核心藥物來代表補(bǔ)腎活血法，難免存在偏倚。其次，本研究納入的核心藥物的活性成分均來自TCMSP，由于TCMSP的局限性，地龍藥物尚未納入其中，且數(shù)據(jù)庫并不能完全代表某個藥物的所有活性成分，亦是本研究的局限之處。本研究的預(yù)測結(jié)果仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，收集各醫(yī)家補(bǔ)腎活血法干預(yù)LDH的處方進(jìn)行用藥規(guī)律及機(jī)制預(yù)測，一定程度上科學(xué)闡述了補(bǔ)腎活血法的科學(xué)性，對于后續(xù)機(jī)制探討有一定的參考意義。