防風(fēng)藥材多指標(biāo)綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)及指紋圖譜研究

陳 昊 李心愿 劉 霞 張雪瓊 姚子豪 汪沁柔 熊富良

(1 武漢理工大學(xué)，武漢，430070； 2 武漢同濟(jì)中維醫(yī)藥有限責(zé)任公司，武漢，430056)

防風(fēng)是傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，習(xí)稱(chēng)公防風(fēng)，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效，主要用于治療外感風(fēng)寒、頭暈?zāi)垦！L(fēng)濕痹痛、骨節(jié)疼痛等病癥[1-2]。防風(fēng)含有色原酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、多糖類(lèi)等多種化學(xué)成分[3-9]，防風(fēng)功效包括抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等[10-11]。

目前防風(fēng)主要以產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分，主要參考依據(jù)為《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，如把產(chǎn)于東北三省、內(nèi)蒙古、河北張家口、山西雁北及陜西榆林者稱(chēng)“北防風(fēng)”；產(chǎn)于河南、山西運(yùn)城、陜西扶風(fēng)者稱(chēng)“水防風(fēng)”；產(chǎn)于云南者稱(chēng)“云防風(fēng)”；產(chǎn)于四川東部萬(wàn)縣、涪陵、宜賓者稱(chēng)“川防風(fēng)”；產(chǎn)于青海、甘肅、寧夏者稱(chēng)“西北防風(fēng)”；質(zhì)量等級(jí)劃分不合理，未進(jìn)行純度、有效成分含量、安全性等指標(biāo)限量規(guī)定，導(dǎo)致防風(fēng)質(zhì)量參差不齊，影響了臨床用藥的安全有效[12-13]。

為客觀(guān)、有效地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地防風(fēng)藥材的質(zhì)量，研究收集了15批不同產(chǎn)地防風(fēng)藥材，結(jié)合防風(fēng)含量測(cè)定、水分、灰分及浸出物等理化指標(biāo)及防風(fēng)指紋圖譜，通過(guò)主成分分析等藥理方法，構(gòu)建防風(fēng)藥材綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)防風(fēng)藥材進(jìn)行多指標(biāo)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)，為藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加直接的量化指標(biāo)[14]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津公司，日本，型號(hào)：Shimadzu LC-16)；萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：ME-204)、十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：XS205)、超聲儀(昆山美美超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-3200B)、粉碎機(jī)(浙江紅景天工貿(mào)有限公司，型號(hào)：DE-100)、烘箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：101-1)、水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司，型號(hào)：HH-4)、電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：DZTW-2000)。

1.2 試劑與藥材 甲醇(AR，成都科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2021111702)、乙醇(AR，湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：202002251)、甲醇(HPLC，康科德，批號(hào)：2022MG001)、升麻素苷(純度94.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111522-201913)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(純度97.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111523-201811)、升麻素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111710-200602)、純水(娃哈哈，批號(hào)：202110122106HT)，其他試劑均為分析純。

防風(fēng)藥材經(jīng)武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院劉霞副教授鑒定為防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.。防風(fēng)藥材信息見(jiàn)表1。

表1 防風(fēng)藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 水分、浸出物、總灰分及酸不溶性灰分測(cè)定 按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020版)對(duì)15批防風(fēng)藥材的水分、浸出物、總灰分以及酸不溶性灰分進(jìn)行測(cè)定，15批防風(fēng)藥材的水分：含水量為8.7%～9.7%，平均含水量為9.3%，含水量均小于10.0%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。15批防風(fēng)藥材的浸出物：浸出物含量為29.8%～36%，平均浸出物含量為33.3%，浸出物含量均大于13.0%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。15批防風(fēng)藥材中的總灰分：總灰分為5.30%～6.38%，平均灰分為5.88%，總灰分均小于6.5%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。15批防風(fēng)藥材中的酸不溶性灰分：酸不溶性灰分為0.8%～1.59%，酸不溶性灰分平均為1.41%，酸不溶性灰分均小于1.6%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。見(jiàn)表2。

表2 15批防風(fēng)藥材的水分、浸出物、總灰分及酸不溶性灰分測(cè)定及RSD(%)

2.2 防風(fēng)藥材中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Supersil ODS2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，分析時(shí)間30 min。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取升麻素苷對(duì)照品及5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每毫升各含60 μg的溶液，即得[1]。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱(chēng)定重量，水浴回流2 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液各3 μL與供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得[1]。15批防風(fēng)藥材中升麻素苷的含量為0.187 6%～0.590 5%，平均值為0.348 9%；5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為0.219 4%～0.408 0%，平均值為0.295 5%；二者總含量為0.428 4%～0.992 7%，平均值為0.644 3%；15批防風(fēng)藥材中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷總含量均大于0.240 0%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。見(jiàn)表3。

表3 15批防風(fēng)藥材的含量測(cè)定及RSD(按干燥品計(jì)算)(%，n=2)

2.3 多指標(biāo)成分分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)15批防風(fēng)藥材的浸出物、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Z-score法)處理。主成分分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。提取特征值≥1的前2個(gè)成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到92.751%，結(jié)果表明前2個(gè)成分基本能代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息，分析得到的線(xiàn)性組合表達(dá)式為：Y1=-0.659 9×X1+0.213 1×X2+0.720 3×X3；Y2=0.391 7×X1+0.915 9×X2+0.088 0×X3；F=0.571 18×Y1+0.356 33×Y2，將15批藥材樣品進(jìn)行線(xiàn)性計(jì)算后，帶入綜合評(píng)價(jià)函數(shù)，計(jì)算綜合得分值，分值越高，說(shuō)明樣品的綜合品質(zhì)越高。15批防風(fēng)藥材樣品的綜合得分見(jiàn)表5。FF-3批樣品的綜合得分最高，綜合質(zhì)量最優(yōu)。

表4 主成分分析數(shù)據(jù)(%)

表5 15批防風(fēng)藥材樣品綜合得分值

2.4 防風(fēng)指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 采用Agela Innoval C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)以甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，0～10 min，B相70%～55%；10～20 min，B相55%；20～30 min，B相55%～35%；30～45 min，B相35%～10%；45～60 min，B相10%；60～65 min，B相10%～70%；65～80 min，B相70%；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取升麻素、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含50 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取防風(fēng)藥材粉末(過(guò)5號(hào)篩)約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱(chēng)定重量，超聲30 min，放冷至室溫后用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻后濾過(guò)，用0.45 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取防風(fēng)藥材粉末(編號(hào)：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，色譜條件按“2.4.1”，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜，導(dǎo)入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，各峰保留時(shí)間RSD值均小于3%，峰面積RSD均小于3%，說(shuō)明該指紋圖譜方法的精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取防風(fēng)藥材粉末(編號(hào)：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，平行6次，按“2.4.1”下色譜條件方法進(jìn)樣，記錄圖譜，導(dǎo)入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，峰保留時(shí)間RSD值均小于3%，峰面積RSD值均小于3%，說(shuō)明該指紋圖譜方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取防風(fēng)藥材粉末(編號(hào)：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，按“2.4.1”下色譜條件方法，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄圖譜，導(dǎo)入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，共有峰保留時(shí)間RSD值均小于3%，共有峰峰面積RSD值均小于3%，說(shuō)明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.7 樣品測(cè)定及分析 取各批次防風(fēng)藥材粉末，按“2.4.3”制備供試品溶液，按“2.4.1”下色譜條件方法記錄色譜圖，導(dǎo)入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，S1-S15對(duì)應(yīng)FF-1至FF-15，設(shè)置時(shí)間窗口為0.3 min，以中位數(shù)的方式生成對(duì)照指紋圖譜。生成圖譜見(jiàn)圖1。得到8個(gè)共有峰，指認(rèn)出3個(gè)成分。共有峰及指認(rèn)峰結(jié)果見(jiàn)表6。相似度結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，15批防風(fēng)藥材相似度均>0.9，表明藥材間相似度較高。

表6 15批防風(fēng)藥材共有峰峰面積RSD

表7 15批防風(fēng)藥材的相似度結(jié)果

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 聚類(lèi)分析 以15批樣品8個(gè)共有峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用組間連接法，利用平方歐氏距離作為樣品的測(cè)度，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，得到聚類(lèi)樹(shù)狀圖。見(jiàn)圖2。將樣品大致分為2類(lèi)，Ⅰ類(lèi)為河南產(chǎn)防風(fēng)，俗稱(chēng)水防風(fēng)，Ⅱ類(lèi)為河北、山西、內(nèi)蒙古產(chǎn)防風(fēng)，俗稱(chēng)北防風(fēng)類(lèi)，聚類(lèi)分析結(jié)果說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)防風(fēng)藥材質(zhì)量有一定的影響，聚類(lèi)結(jié)果與“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”結(jié)果相似。

2.5.2 主成分分析 將15批防風(fēng)藥材的8個(gè)共有峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析。主成分分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表8。提取特征值≥1的前3個(gè)成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到84.911%，結(jié)果表明前3個(gè)成分基本能代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息，得到的線(xiàn)性組合表達(dá)式為：Z1=-0.219 5×Q1+0.501 6×Q2+0.062 6×Q3+0.546 1×Q4+0.225 9×Q5-0.175 0×Q6+0.323 7×Q7+0.460 1×Q8，Z2=0.528 1×Q1-0.215 0×Q2+0.427 4×Q3+0.072 1×Q4+0.375 5×Q5+0.459 9×Q6+0.357 3×Q7+0.083 1×Q8，Z3=-0.079 9×Q1+0.194 1×Q2+0.513 7×Q3-0.093 0×Q4-0.545 5×Q5+0.338 4×Q6-0.319 6×Q7+0.411 8×Q8，F(xiàn)=0.364 84×Z1+0.296 30×Z2+0.187 97×Z3，將15批藥材樣品進(jìn)行線(xiàn)性計(jì)算后，帶入綜合評(píng)價(jià)函數(shù)，計(jì)算綜合得分值，分值越高，說(shuō)明樣品的綜合品質(zhì)越高。FF-3批樣品的綜合得分最高，綜合質(zhì)量最優(yōu)。15批防風(fēng)藥材樣品的綜合得分情況見(jiàn)表9。根據(jù)因子負(fù)荷矩陣表，推測(cè)影響防風(fēng)差異的并不是單一成分，而是多成分(群)協(xié)同作用的結(jié)果，峰2、峰4、峰7和峰8在主成分1上載荷絕對(duì)值最大；峰1、峰3、峰6、峰5和峰7在主成分2上的載荷絕對(duì)值最大；峰3、峰5和峰8在主成分3上的載荷量最大。見(jiàn)表10，圖3。

圖1 15批防風(fēng)藥材相似度評(píng)價(jià)譜圖

圖2 15批防風(fēng)藥材系統(tǒng)聚類(lèi)

表8 15批防風(fēng)藥材主成分分析結(jié)果(%)

3 討論

防風(fēng)藥材中含有多類(lèi)不同的化學(xué)成分，影響防風(fēng)藥材質(zhì)量的因素較多，僅根據(jù)單一化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行定性定量分析評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，易產(chǎn)生片面性。多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)中評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重分配不均又會(huì)導(dǎo)致評(píng)價(jià)對(duì)象優(yōu)劣順序的改變，因此權(quán)重的合理性、準(zhǔn)確性直接影響評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性[15-17]。采用客觀(guān)賦權(quán)評(píng)價(jià)方法對(duì)防風(fēng)的浸出物、升麻素苷含量、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量3種指標(biāo)性成分設(shè)置權(quán)重系數(shù)，避免主觀(guān)因素造成的誤差，能更全面、客觀(guān)地評(píng)價(jià)防風(fēng)藥材質(zhì)量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，15批藥材間浸出物、含量測(cè)定、灰分等質(zhì)量指標(biāo)存在一些差異，RSD值均大于5%，說(shuō)明不同產(chǎn)地及不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)防風(fēng)藥材含量影響較大，結(jié)果顯示15批藥材中河南安陽(yáng)產(chǎn)防風(fēng)質(zhì)量更優(yōu)。

表9 15批藥材防風(fēng)藥材指紋圖譜綜合得分值

表10 因子負(fù)荷矩陣

圖3 載荷圖

在指紋圖譜分析方法建立過(guò)程中，為盡可能多地提取主要代表性成分，通過(guò)比較超聲與回流2種提取方式，并考察純水、甲醇和乙醇3種不同溶劑的提取效果，以及不同提取時(shí)間的提取效果，考察流動(dòng)相、柱溫、流速等因素的影響，以色譜圖出峰個(gè)數(shù)、峰形、基線(xiàn)平穩(wěn)性等為指標(biāo)進(jìn)行綜合考察，結(jié)果顯示，前處理方式為甲醇超聲30 min時(shí)，可以盡可能多地提取主要成分，色譜條件選擇1.0 mL/min流速、40 ℃柱溫、254 nm以及甲醇-水的流動(dòng)相時(shí)色譜圖效果最佳。通過(guò)大量預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確保建立的指紋圖譜共有模式具有代表性，通過(guò)對(duì)指紋圖譜結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)及主成分研究分析[18-19]，可將15批藥材大致分為2類(lèi)，Ⅰ類(lèi)為河南產(chǎn)防風(fēng)，俗稱(chēng)水防風(fēng)，Ⅱ類(lèi)為河北、山西、內(nèi)蒙古產(chǎn)防風(fēng)，俗稱(chēng)北防風(fēng)類(lèi)，聚類(lèi)分析結(jié)果說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)防風(fēng)藥材質(zhì)量有一定的影響。通過(guò)對(duì)8個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，得到的3個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)84.911%，可基本代表原始數(shù)據(jù)的整體信息，根據(jù)載荷圖發(fā)現(xiàn)8個(gè)共有峰對(duì)結(jié)果均有影響，說(shuō)明影響防風(fēng)質(zhì)量的不是單一成分，而是多成分(群)協(xié)同作用的結(jié)果。

本研究將多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)與指紋圖譜整體性評(píng)價(jià)2種評(píng)價(jià)方式相結(jié)合對(duì)不同產(chǎn)地的防風(fēng)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示2種評(píng)價(jià)方法得出的結(jié)論基本一致。2種評(píng)價(jià)方法相結(jié)合可以更加全面地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，對(duì)建立更加全面、科學(xué)、合理的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系具有一定的參考意義。