丁酸鹽對C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化作用

管理，曹子怡，陳潔

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200040

肌少癥是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性、全身性骨骼肌疾病，涉及肌肉質(zhì)量下降和肌肉功能喪失，可引發(fā)跌倒、骨折、衰弱和死亡等不良后果。回顧性研究提示，亞洲人群的肌少癥患病率為5.5%～25.7%［1-2］。肌少癥的發(fā)生由炎癥、免疫衰老、肌肉蛋白合成代謝、氧化應(yīng)激和肌衛(wèi)星細(xì)胞活性抑制等共同作用［3-7］，在機(jī)體活動(dòng)減少和營養(yǎng)不良的情況下，這些機(jī)制會(huì)進(jìn)一步影響肌少癥［8］。因此，抗阻運(yùn)動(dòng)聯(lián)合營養(yǎng)補(bǔ)充是治療和預(yù)防肌少癥的有效方法［9］，但由于目前肌少癥的發(fā)病機(jī)制不明，具體的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑以及治療靶點(diǎn)仍未有定論。近年來的研究表明，腸道微生物群可能參與肌少癥的發(fā)生，增齡引起的腸道菌群組成及其衍生代謝物改變可以促進(jìn)慢性炎癥和肌肉蛋白合成代謝抵抗，最終導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降和功能受損［10-11］。丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA），目前已知的丁酸鹽作用多通過抑制組蛋白脫乙酰酶產(chǎn)生的表觀遺傳效應(yīng)［12］。雖然SCFA 能夠改善肌肉組織功能，但丁酸鹽本身對肌肉萎縮的影響及具體作用機(jī)制仍有待確定。本研究旨在探索腸道菌群代謝物在肌少癥人群中的改變，明確SCFAs（尤其是丁酸鹽）對肌肉組織的作用，為肌少癥的防治提供嶄新思路。

1 材料和方法

1.1 一般資料

2020年11月—12月，經(jīng)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后入選共和新路街道及甘泉路街道的社區(qū)老年人14 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60 歲；（2）性別不限；（3）本地常住人口。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）常年臥床；（2）體成分發(fā)生急性變化（顯著水腫或脫水）；（3）發(fā)熱、感染或不明原因傳染病；（4）患有嚴(yán)重心、肺、腎和腦疾??；（5）近3 個(gè)月使用抗生素、非甾體抗炎藥、抗過敏藥或類固醇激素；（6）近3 個(gè)月患有嚴(yán)重影響身體活動(dòng)的疾?。ㄊ中g(shù)或骨折）；（7）過去1 周存在吸煙、飲酒等影響腸道菌群的行為。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（20190068），所有受試者自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

14 例受試者年齡62～85 歲，平均（71.5 ±8.1）歲，其中男性5 例、女性9 例，肌少癥6 例、非肌少癥8例。與非肌少癥組比較，肌少癥組四肢骨骼肌質(zhì)量（appendicular skeletal muscle mass，ASM）降低，6 m 步速減慢，丁酸鹽水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 組的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（appendicular skeletal muscle mass index，ASMI）和握力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)研究選擇丁酸鹽作為干預(yù)因素。見表1。

表1 2 組一般資料比較（±s，n=14）

表1 2 組一般資料比較（±s，n=14）

項(xiàng)目 非肌少癥組（n＝8） 肌少癥組（n＝6） t/χ2 P年齡（歲） 62～80 （69.4 ±6.8） 63～85 （74.3 ±9.5） －1.136 0.278性別［例（%）］— 1.000男性 3 （37.50） 2 （33.33）女性 5 （62.50） 4 （66.67）BMI （kg·m －2） 22.96 ±2.33 20.68 ±2.53 1.746 0.106 ASM （kg） 18.10 ±3.66 14.30 ±1.86 2.531 0.028 ASMI （kg·m －2） 6.63 ±0.84 5.75 ±0.67 2.094 0.058握力（kg） 31.44 ±8.13 23.10 ±6.05 2.104 0.057 6 m 步速（m·s －1） 1.28 ±0.18 1.01 ±0.23 2.495 0.028丁酸鹽（μmol·g －1） 30.79 ±1.48 14.37 ±8.32 2.429 0.032

1.2 肌少癥診斷

1.2.1 肌肉質(zhì)量通過人體成分分析儀（Inbody 270）檢測受試者的ASM，ASMI＝ASM/身高2。

1.2.2 肌肉力量受試者站立位，雙臂自然垂于身體兩側(cè)，用力握住握力器（瑞獅生物科技有限公司）手柄，測量3 次，記錄測量最大值。

1.2.3 軀體功能受試者以日常步速沿直線方向行走6 m，可借助拐杖（不鼓勵(lì)使用）。共測試2 次，計(jì)算2 次的平均6 m 步速。

采用2019年亞洲肌少癥工作組［13］推薦的診斷閾值評估肌少癥：（1）男性ASMI＜7.0 kg/m2、女性ASMI＜5.7 kg/m2為肌肉質(zhì)量下降；（2）男性握力＜28.0 kg、女性握力＜18.0 kg 為肌肉力量下降；（3）步速＜1 m/s為軀體功能受損。在滿足肌肉質(zhì)量下降的基礎(chǔ)上，握力與步速符合任1 項(xiàng)即可確診為肌少癥，據(jù)此將所有受試者分為肌少癥組和非肌少癥組。

1.3 標(biāo)本采集

采集受試者糞便樣本，并于－80 ℃冰箱保存，由麥特繪普生物科技（上海）有限公司提取代謝物，經(jīng)衍生化處理后基于UPLC-MS/MS 平臺(tái)，通過Q300TM試劑盒（麥特繪譜，HY5023R）進(jìn)行代謝物檢測。

1.4 藥物與試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素（雙抗）、馬血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Gibco 公司，貨號(hào)分別為11995065、15140122、16050122、10091148、25200056）；抗-Ki67 抗體、抗-Myf5 抗體（英國Abcam公司，貨號(hào)分別為ab15580、ab125301）；Hoechst 抗體（美國Thermo Fisher 公司，貨號(hào)H3570）；抗-MyoD 抗體（中國Santa Cruz 公司，貨號(hào)sc-377460）；抗-MyHC抗體（美國R&D Systems 公司，貨號(hào)MF20）；β-Tubulin抗體、二抗鼠IgG 抗體、二抗兔IgG 抗體（美國CST 公司，貨號(hào)分別為5346S、7076S、7074P2）；PBS 緩沖液（中國Bioss 公司，貨號(hào)C01-01001）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，貨號(hào)CK04）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國Takara 公司，貨號(hào)RR036A）；RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（中國碧云天公司，貨號(hào)分別為P0013B、P0012A）。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

1.5.1 溶液制備丁酸鈉購自上海阿拉丁生化科技有限公司（貨號(hào)S102956），充分溶于ddH2O，制成1 000 mmol/L 的丁酸鹽溶液備用，避光環(huán)境下室溫儲(chǔ)存。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組C2C12 成肌細(xì)胞購自富恒生物，應(yīng)用DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 更換1 次生長培養(yǎng)液（DMEM ＋10%胎牛血清＋1%青霉素-鏈霉素）。待細(xì)胞貼壁后，丁鹽酸組每4 mL 培養(yǎng)液加入3 μL 丁酸鹽儲(chǔ)備液，對照組加入等體積、濃度的ddH2O。

1.5.3 細(xì)胞分化2 組細(xì)胞經(jīng)丁酸鹽和ddH2O處理48 h 后，當(dāng)細(xì)胞密度≥80%時(shí)吸棄生長培養(yǎng)液，加入分化培養(yǎng)液（DMEM ＋2%馬血清＋1%青霉素-鏈霉素）進(jìn)行分化誘導(dǎo)，隔天換液，持續(xù)96 h。

1.6 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將每孔2 ×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入10 μL CCK-8 進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。恒溫箱孵育1～2 h后，于24 h、48 h 使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

1.7 免疫熒光染色

丁酸鹽處理48 h 后，檢測C2C12 成肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)。PBS 緩沖液潤洗細(xì)胞2 遍，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛固定60 min。1 mL PBS 慢洗3 遍，每遍5 min。封閉液（PBS ＋10% 山羊血清＋0.3%Triton）覆蓋皿底，室溫孵育1 h。使用抗-Ki67 抗體標(biāo)記增殖的細(xì)胞核，Hoechst 抗體標(biāo)記全體細(xì)胞核?？?Ki67 一抗（1∶100）4 ℃冰箱孵育過夜，熒光鼠/兔IgG二抗（1∶500）室溫孵育2 h。PBS 充分洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿后，以PBS 稀釋Hoechst 抗體（1∶500），室溫避光孵育20 min。通過激光共聚焦顯微鏡（德國Leica，TCS SP8）對每個(gè)樣品隨機(jī)取5 個(gè)視野顯像。

Ki-67 是一種標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的核抗原，Ki-67增殖指數(shù)常被用于評價(jià)細(xì)胞增殖水平。Ki-67 增殖指數(shù)＝陽性細(xì)胞核數(shù)/全體細(xì)胞核數(shù)。

1.8 蛋白免疫印跡檢測

將處理后的細(xì)胞充分裂解，并加入上樣緩沖液。蛋白樣本移入金屬水浴鍋中100 ℃加熱15 min 變性，室溫下冷卻5 min 后離心，取上清加入SDS-PAGE 凝膠樣品槽。轉(zhuǎn)膜后將0.4 μm 聚偏二氟乙烯膜（美國Merck 公司）放入BSA 封閉液中置低速搖床上封閉1 h。使用MyoD、Myf5、MyHC 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，鼠/兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。充分洗膜后通過ECL 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，2 組間比較采用Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖

采用CCK-8 檢測丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞增殖能力的影響。與對照組比較，丁酸鹽處理48 h 后C2C12成肌細(xì)胞增殖率上調(diào)。對2 組細(xì)胞的Ki-67 增殖指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對照組比較，丁酸鹽組Ki-67 ＋細(xì)胞核增多（16.82%vs35.96%，P＝0.009）。見圖1。

圖1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖（n=3）

2.2 丁酸鹽改善C2C12 成肌細(xì)胞分化

與對照組比較，分化48 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyoD、Myf5 的蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；分化96 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyHC 的蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 丁酸鹽改善C2C12 分化水平（n=3）

3 討論

近年來測序分析技術(shù)不斷進(jìn)步，幫助研究者挖掘微生物學(xué)標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)由微生物群落的比較到臨床診斷與微生物學(xué)應(yīng)用的跨越［13-14］。人體內(nèi)微生物群落與健康和疾病等因素密切相關(guān)［15-16］。

目前，已知促進(jìn)骨骼肌生長的特定腸道菌群種類包括干酪乳桿菌、長雙歧桿菌、直腸真桿菌、球狀梭菌和巴氏桿菌。這些菌種通過產(chǎn)生SCFA 來改善肌肉的功能［17-18］，而菌群紊亂導(dǎo)致SCFA 減少可引起胰島素抵抗，減少線粒體脂肪酸氧化，繼而引起肌肉內(nèi)脂肪酸沉積增多。這種現(xiàn)象會(huì)使肌肉力量與質(zhì)量下降，并進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗，從而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肌少癥的發(fā)生［19-20］。此外，SCFA 可以增加血清中胰島素樣生長因子1 的含量，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖，改善肌肉再生［21］。補(bǔ)充劑（如基于果聚糖的益生元或抗性馬鈴薯淀粉等）可以增加個(gè)別產(chǎn)丁酸菌的相對豐度，提高丁酸的產(chǎn)量［22］。攝取益生元（如菊粉型果聚糖和阿拉伯低聚木糖）有利于促進(jìn)雙歧桿菌與產(chǎn)丁酸菌之間的相互作用，從而增加產(chǎn)量。因此，聯(lián)合營養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)的綜合治療方案，可以促進(jìn)衰弱老人腸道微生物群結(jié)構(gòu)的年輕化。

本次研究表明，丁酸鹽通過改善成肌細(xì)胞增殖促進(jìn)肌肉再生。一方面丁酸鹽對于C2C12 成肌細(xì)胞有促增殖效應(yīng)；另一方面丁酸鹽上調(diào)Myf5、MyoD 的表達(dá)水平，進(jìn)而改善成肌細(xì)胞分化水平。促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)是增殖、分化等細(xì)胞活動(dòng)的基礎(chǔ)，對該通路的調(diào)控有利于改善肌細(xì)胞的細(xì)胞活力和蛋白質(zhì)降解。此外，丁酸鹽對能量攝取的調(diào)節(jié)作用以及胞內(nèi)脂滴沉積的緩解，有利于改善肌細(xì)胞的分化水平［23］。通過對組蛋白去乙?；傅囊种?，丁酸鹽還有助于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化［24］。成肌細(xì)胞的促增殖環(huán)境為預(yù)防、治療隨年齡引起的骨骼肌退化提供了新的視角。

本研究通過對社區(qū)老年人群糞便樣本的代謝物檢測，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了特定濃度的丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞生成的促進(jìn)作用。后續(xù)研究中，更大的樣本量將有利于明確產(chǎn)丁酸菌是否為肌少癥患者與健康人群間的差異菌種，同時(shí)血清學(xué)數(shù)據(jù)有助于確定丁酸鹽與肌少癥之間的相關(guān)性［25］。