成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用進展

劉幸卉 廖 華

成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用進展

劉幸卉 廖 華

成肌細(xì)胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細(xì)胞，來源于中胚層干細(xì)胞，胚胎發(fā)育過程中首先由間充質(zhì)細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，然后分裂、融合成多核肌纖維，形成肌小管，再進一步分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞具有自我更新和促進肌纖維再生的能力。成熟個體心肌組織與平滑肌組織均不含成肌細(xì)胞；骨骼肌組織中的成肌細(xì)胞是以肌衛(wèi)星細(xì)胞形式存在，位于肌纖維基底膜與肌膜之間，相互間不融合，也不合成收縮蛋白，因環(huán)繞多核肌纖維而得名[1]。生理狀態(tài)下，衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)；在骨骼肌損傷及再生過程中，衛(wèi)星細(xì)胞被激活，大量增殖、融合并分化，產(chǎn)生新生肌纖維。因此，成肌細(xì)胞在骨骼肌再生中是新生肌肉的細(xì)胞來源，起著關(guān)鍵作用。成肌細(xì)胞可以從肌組織中分離，可在體外條件下以克隆或混合培養(yǎng)、遺傳工程的方法大量增殖，并回輸至肌肉組織以治療肌肉的損傷或缺損[2]。

目前，成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用已相當(dāng)廣泛，本文就成肌細(xì)胞移植在心血管系統(tǒng)及肌肉損傷治療等方面的應(yīng)用進展進行綜述。

1 成肌細(xì)胞是廣泛采用的基因治療靶細(xì)胞

在臨床和基礎(chǔ)研究中,利用成肌細(xì)胞的生物學(xué)特性作為基因治療的靶細(xì)胞有很多優(yōu)點：①成肌細(xì)胞數(shù)量豐富，易獲取，可通過注射進行大規(guī)模細(xì)胞移植；②目的基因產(chǎn)物（有活性的蛋白）可在成肌細(xì)胞中高水平表達，并可分泌到細(xì)胞外；③成肌細(xì)胞可與宿主肌肉細(xì)胞融合，形成多核肌細(xì)胞，并可在肌纖維中長期存活，有利于目的蛋白穩(wěn)定、持續(xù)地表達；④骨骼肌是藥物注射的常用組織，具有一定耐受性，肌肉組織血供豐富，表達產(chǎn)物易進入血液循環(huán)，到達靶器官發(fā)揮作用；⑤成肌細(xì)胞移植后不干擾鄰近組織的正常生理功能，不需膠原包埋，肌肉組織易于重復(fù)活檢，臨床應(yīng)用簡便、安全[2]。Day等[3]以腺病毒為載體,將LacZ標(biāo)志基因（B2半乳糖苷酶基因）轉(zhuǎn)入永生化成肌細(xì)胞，注入兔膝關(guān)節(jié)后檢測關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)目的基因的表達,6 d后在髕骨滑膜層見到大片表達目的基因的肌細(xì)胞以及有支架蛋白染色陽性的肌管和肌纖維，部分附著于髕韌帶、交叉韌帶止點及股骨髁間窩等處，7周后仍可見大量表達目的基因的細(xì)胞。Ye等[4]以聚乙烯亞胺納米顆粒為載體，把人血管內(nèi)皮生長因子-165基因轉(zhuǎn)染自體骨骼肌成肌細(xì)胞，然后移植到急性心肌梗死大鼠心臟，4周后行分子學(xué)和組織學(xué)檢查，與單純注射DMEM和人骨骼肌成肌細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染組大鼠心臟血管密度顯著增高，左心室前壁局域血流量也顯著增加，說明基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞治療骨骼肌系統(tǒng)和心血管疾病是可行且高效的。

2 成肌細(xì)胞治療心血管系統(tǒng)疾病

骨骼肌纖維與心肌細(xì)胞同為橫紋肌，都起源于中胚層，分化過程有相似之處，經(jīng)體外培養(yǎng)可得到大量可供移植的成肌干細(xì)胞。自體骨骼肌成肌細(xì)胞移植可避免免疫排斥反應(yīng)，不存在醫(yī)學(xué)倫理問題。骨骼肌成肌細(xì)胞植入體內(nèi)后，可存活于缺血組織中，且不會無限增殖或形成腫瘤。將骨骼肌成肌細(xì)胞直接注入損傷心肌，能產(chǎn)生心肌細(xì)胞樣的收縮與舒張。研究證明，成肌細(xì)胞可用于治療缺血性心臟病，如心肌梗死和頑固性心力衰竭等。Tambara等[5]將新鮮分離的成肌細(xì)胞（未經(jīng)培養(yǎng)擴增）植入梗死后的大鼠心肌，發(fā)現(xiàn)足量的成肌細(xì)胞移植后，能存活并定位于宿主受損心肌，分化成肌管，新生的肌組織占據(jù)了絕大多數(shù)心肌梗死區(qū)域，從而改善了心功能。另外，Gavira等[6]以豬為模型，研究成肌細(xì)胞在治療慢性心梗方面的療效，他們把20只豬分成4組，在6周內(nèi)分別注射不同數(shù)量的骨骼肌成肌細(xì)胞，進行7個月的觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組心臟功能明顯好于對照組。3個劑量單位注射豬的左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction,LVEF）明顯高于1個劑量單位注射豬。實驗表明，盡管成肌細(xì)胞移植后出現(xiàn)心律失常，反復(fù)和/或大劑量注射成肌細(xì)胞于心肌受損部位，能顯著改善宿主心功能，臨床應(yīng)用前景廣闊。Murry等[7]觀察到成肌細(xì)胞在植入成年大鼠缺血心肌2周后，表達慢收縮細(xì)胞的標(biāo)志物肌球蛋白重鏈β（β-MHC），而不表達心肌細(xì)胞特異的標(biāo)志物肌球蛋白重鏈α（α-MHC），并最終在心肌瘢痕內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蛊诘穆磻?yīng)纖維，以適應(yīng)心臟的生理功能。說明移植的成肌細(xì)胞并未分化成心肌細(xì)胞,而是分化為能負(fù)擔(dān)心臟工作的慢收縮細(xì)胞。雖然無法證實成肌細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞，但以多種動物為研究對象、不同心梗模型（冷凍、動脈結(jié)扎及毒性藥物）的多種試驗，均可證明成肌細(xì)胞移植可使心功能得到改善。Taylor等[8]以羊為研究對象，用蛇毒注射至左室壁內(nèi)形成心梗模型，3周后超聲心動圖檢測其收縮功能；然后取自體骨骼肌成肌細(xì)胞移植，2個月后左室收縮功能證實較月前有所提高。Pouzet等[9]以小鼠為研究對象，在自體成肌細(xì)胞移植后2個月和1年時檢測左室射血分?jǐn)?shù)，證實兩個時間點無明顯差別，說明成肌細(xì)胞移植后對心功能的提供作用是長期的。

目前的臨床試驗并不支持成肌細(xì)胞移植對心梗的治療效應(yīng)。Philippe等[10]將心臟病患者隨機分成低劑量組、高劑量組和安慰劑對照組。這些患者均有左心室功能障礙并伴有心肌梗死，具備冠狀動脈手術(shù)指征。所有患者均接受了植入式心臟轉(zhuǎn)復(fù)除顫器，97例接受成肌細(xì)胞注射（400或800萬個；n=33和n=34）或安慰劑（n=30）。然而結(jié)果表明成肌細(xì)胞注射并沒有改善心臟功能，可能是移植細(xì)胞因缺血、凋亡而導(dǎo)致移植失敗。

骨骼肌成肌細(xì)胞是具有廣闊應(yīng)用前景的一種干細(xì)胞，也是修復(fù)心肌缺損時優(yōu)先考慮的種子細(xì)胞。近年來，動物實驗取得了一些令人鼓舞的成果，多數(shù)研究證明，植入細(xì)胞改善左室功能和逆轉(zhuǎn)心室重塑，可能源于其在壞死心肌內(nèi)形成了肌管。關(guān)于成肌細(xì)胞在心梗治療的臨床應(yīng)用上，目前主要存在3個障礙：第一，移植后導(dǎo)致的心律失常；第二，植入細(xì)胞存活率低；第三，成肌細(xì)胞植入機體后存在變異性。雖然成肌細(xì)胞在體外易于培養(yǎng)和擴增，但體外擴增需要時間，因此對急性心肌梗死的患者來說使用自體成肌細(xì)胞移植目前仍不現(xiàn)實[11]。

盡管面臨著諸多問題，但成肌細(xì)胞移植技術(shù)作為治療心肌梗死的一種嶄新手段，顯示了其具有的治療潛力。隨著對分化調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、歸巢分子機制等研究的深入以及更多的大規(guī)模、臨床隨機雙盲對照實驗的開展，成肌細(xì)胞移植將為心肌梗死等疾病的治療帶來新的希望

3 成肌細(xì)胞治療壓力性尿失禁

尿道固有括約肌缺陷（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是導(dǎo)致女性壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）的重要原因。目前對ISD導(dǎo)致的SUI尚無長期有效的治療方法。由于ISD患者的尿道括約肌存在收縮功能障礙，進行肌肉干細(xì)胞移植可能是治療SUI的最佳方法。其中成肌細(xì)胞具有增殖快、融合慢、多向分化潛能等特性，移植后存活率高，是一種理想的細(xì)胞移植物[12]。

Strasser等[13]選擇42名女性和21名男性，接受經(jīng)尿道超聲引導(dǎo)自體成肌細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的注射治療，其中成肌纖維細(xì)胞注入尿道粘膜，成肌細(xì)胞注射入尿道橫紋肌。把這些接受治療的病人隨機地分為兩組。同時，7名男性和21名女性患者接受膠原注射治療以作為對照組。經(jīng)過12個月的隨訪，自體細(xì)胞注射治愈了39名女性和11名男性的尿失禁癥狀，生活質(zhì)量評分從術(shù)前的51.38提高到術(shù)后的104.06。尿道橫紋肌由術(shù)前的2.103 mm增厚到3.303 mm，并伴有收縮功能增強。術(shù)后的結(jié)果表明，在尿道橫紋肌內(nèi)有新的肌肉組織形成，但常規(guī)的膠原注射只治愈了2例患者。需要強調(diào)的是，超聲引導(dǎo)在這種治療中起著關(guān)鍵作用，傳統(tǒng)的內(nèi)鏡操作不能夠準(zhǔn)確定位，因此影響自體細(xì)胞移植的治療效果。男性和女性治療結(jié)果的不同，在一定程度上是源于男性前列腺切除術(shù)后的影響。另外，這種治療方法對放射治療以及術(shù)后出現(xiàn)尿路瘢痕的患者無效。結(jié)果證實，成肌細(xì)胞移植可以用于治療尿失禁，但遠期效果尚有待更長時間的觀察隨訪。理想的注射細(xì)胞數(shù)量和注射后對膀胱功能的遠期影響也需要進一步研究。

4 成肌細(xì)胞治療骨骼肌疾病

利用傳統(tǒng)方法治療骨骼肌嚴(yán)重?fù)p傷和許多遺傳性肌?。ㄈ缂I養(yǎng)不良癥等）效果不佳。作為肌肉前體細(xì)胞，成肌干細(xì)胞在骨骼、肌肉系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，可用于修復(fù)損傷的骨骼、關(guān)節(jié)和肌肉組織[14－15]。

成肌細(xì)胞是目前已知的哺乳動物體內(nèi)唯一能大量分裂、增殖及遷移的肌組織前體細(xì)胞，具有與宿主肌纖維融合的能力，可作為有效載體廣泛用于特定目的基因的轉(zhuǎn)移，從而參與遺傳性肌病的基因治療。

成肌細(xì)胞移植較早用于某些遺傳性肌病的基因治療，如Duchenne肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）。Duchenne肌營養(yǎng)不良癥是一種X-性連鎖隱性遺傳肌病，男性發(fā)病率為1/3 500，居神經(jīng)遺傳病之首。病因主要是X染色體短臂2區(qū)1帶（Xp21）基因突變導(dǎo)致細(xì)胞膜骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白（Dystrophin，Dys）缺乏所致，其病程進展快，預(yù)后差，目前臨床尚無有效治療方法[16]。細(xì)胞和基因工程治療給DMD患者帶來了希望，王訓(xùn)等[17]以Duchenne肌營養(yǎng)不良癥模型－mdx鼠為模型進行成肌細(xì)胞移植，術(shù)后1個月、2個月、3個月分別取實驗鼠的四肢骨骼肌，運用免疫熒光法檢測抗肌萎縮蛋白的表達情況。結(jié)果表明，成肌細(xì)胞肌肉注射移植能夠在一定程度上修復(fù)mdx鼠的萎縮肌組織，能否改善鼠的運動機能還需進一步研究。劉立斌等[18]以mdx小鼠為模型進行成肌細(xì)胞移植，術(shù)后4周采用一次性游泳力竭實驗檢測小鼠運動能力，取材行HE染色及5-BrdU、結(jié)蛋白、Dys免疫組織化學(xué)染色觀察及圖像分析。實驗證實，移植的成肌細(xì)胞移植后，能在宿主體內(nèi)存活并與宿主骨骼肌細(xì)胞融合，起到了一定的治療作用。通過一次性游泳力竭實驗證實，成肌細(xì)胞移植治療后mdx小鼠的運動能力具有顯著改善。作為治療方法的一種，成肌細(xì)胞移植可以治療DMD，但成肌細(xì)胞治療存在融合性差及體內(nèi)存活率低等問題，在將來的成肌細(xì)胞移植研究中，應(yīng)該在基因修飾、趨化因子以及細(xì)胞間相互影響使之融合的技術(shù)等方面尋求突破，增加成肌細(xì)胞治療的成功率。

在日常生活和體育鍛煉中，肌肉損傷難免發(fā)生。肌肉一旦損傷，需要經(jīng)歷修復(fù)和再生過程。而成肌細(xì)胞對骨骼肌的修復(fù)和再生的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的過程研究，對骨骼肌損傷后的治療和康復(fù)治療具有重要意義。Irintcher等[19]將培養(yǎng)的成肌細(xì)胞移植到凍傷骨骼肌中，可改善肌肉收縮功能。成肌細(xì)胞移植也被用于治療肛門失禁，Ryoko等[20]利用差速貼壁分離法分別從1 d、1、2、3、4、8和12周的雌性小鼠獲取成肌細(xì)胞，注射至大腿和肛提肌損傷的小鼠。免疫熒光檢測證實，受損的下肢肌內(nèi)出現(xiàn)新生的肌纖維，肛提肌內(nèi)也出現(xiàn)融合肌管，成肌細(xì)胞移植為肛門直腸畸形修復(fù)手術(shù)后引起的大便失禁的治療提供了新的思路。

隨著對骨骼肌成肌細(xì)胞功能的深入了解和研究，會對成肌細(xì)胞在骨骼肌再生過程中的作用有更具體、準(zhǔn)確的理解和認(rèn)識，為骨骼肌損傷、遺傳性骨骼肌疾病等提供更安全、高效的治療方法。

5 成肌細(xì)胞臨床應(yīng)用的展望

隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，成肌細(xì)胞移植技術(shù)日趨成熟。為許多利用傳統(tǒng)方法治療效果不理想的疾病，如心肌梗死、壓力型尿失禁、DMD等提供了全新的治療方法，但目前相當(dāng)多的研究只限于動物模型，尚需進一步進行臨床應(yīng)用型研究。此外，細(xì)胞移植所引起的免疫反應(yīng)、細(xì)胞融合率、長期的臨床效果以及細(xì)胞移植所產(chǎn)生的并發(fā)癥等都需要進行仔細(xì)觀察和分析。我們相信，隨著上述問題的解決，成肌細(xì)胞移植將在多種疾病的治療上發(fā)揮重要作用，成為一種簡便、安全、高效的治療方法。

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Q813

B

1673－0364（2010）05－0295－03

2010年6月17日，

2010年7月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.017

國家自然科學(xué)基金項目(30771045)。

510515廣東省廣州市南方醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室。