成肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及臨床應(yīng)用前景*

邱裕佳王偉*

成肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及臨床應(yīng)用前景*

邱裕佳1王偉2,3*

成肌細(xì)胞（Myoblast）是肌組織中靜止的單核細(xì)胞，肌纖維肌膜與基底膜之間，是肌細(xì)胞的前體細(xì)胞，在肌肉損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。隨著分子及細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展成肌細(xì)胞的特性逐漸被人們認(rèn)識(shí)，如取材方便、來源廣泛、體外增殖分化能力強(qiáng)、能與受體肌細(xì)胞融合并共享基因產(chǎn)物、移植后不會(huì)無限增殖或形成腫瘤、自體成肌細(xì)胞移植沒有倫理爭(zhēng)議等，因而成肌細(xì)胞被視為優(yōu)良的種子細(xì)胞被應(yīng)用于多種系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究和治療中。文章針對(duì)成肌細(xì)胞的原代分離、純化、影響其增殖及分化因素、成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景等方面作以概述。

成肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)；細(xì)胞治療；

成肌細(xì)胞是骨骼肌中具有增殖分化潛能的成體干細(xì)胞，由Muaor（1961年）首次從青蛙骨骼肌纖維中分離出來。成熟個(gè)體骨骼肌組織中成肌細(xì)胞以肌衛(wèi)星細(xì)胞形式存在，因其取材方便、增殖能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注。隨著研究的不斷深入，成肌細(xì)胞已在心臟疾患、肌損傷和肌病、骨科學(xué)損傷修復(fù)等治療領(lǐng)域，展示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。基于臨床應(yīng)用角度考慮，移植細(xì)胞應(yīng)以自體來源為佳，但自體成肌細(xì)胞數(shù)量有限[1]難以滿足臨床應(yīng)用供求需要。所以大量、優(yōu)良的成肌細(xì)胞，是從事相關(guān)研究和臨床應(yīng)用開展的前提。

本文就成肌細(xì)胞培養(yǎng)涉及到的原代分離、純化、影響其增殖及分化因素、成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景等方面加以概述。

1 成肌細(xì)胞原代分離方法

目前成肌細(xì)胞的分離方法趨于成熟。較為常用的方法有：酶消化法、組織塊法和單根肌纖維法3種。

1.1 酶消化法

酶消化法是目前體外獲得成肌細(xì)胞最常用的方法，骨骼肌成肌細(xì)胞經(jīng)典培養(yǎng)方法為Blau等[2]的方法，即胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合分步消化法分離成肌細(xì)胞。對(duì)此改進(jìn)較多的是采用混合酶消化，減少消化時(shí)間，減輕酶對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)也就可以降低了酶的濃度，這樣既節(jié)省了酶的用量也提高了細(xì)胞的存活率。后續(xù)不少研究人員應(yīng)用該改進(jìn)方式，并獲得了較好的效果[3]。

1.2 組織塊法

組織塊法是利用的是成肌細(xì)胞被激活后具有遷移能力，能從組織塊或肌纖維游離出來的特點(diǎn)，將1mm3肌組織小塊接種于培養(yǎng)瓶，待成肌細(xì)胞從貼壁的組織塊周圍游離出來，達(dá)到合適密度進(jìn)行消化傳代。

1.3 單根肌纖維法

該方法剝離完整肌組織塊，然后用酶消化肌組織釋放肌纖維，隨后成肌細(xì)胞便可游離出來[4,5]。適于研究成肌細(xì)胞的原始位置及其子代從肌纖維上的遷移、自我更新、增殖、分化和融合等過程，且獲得的成肌細(xì)胞再生能力強(qiáng)，并且更接近于成肌細(xì)胞的活體研究。

2 原代成肌細(xì)胞純化方法

成肌細(xì)胞原代培養(yǎng)中會(huì)不可避免的混有成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞等雜細(xì)胞，因此有效的純化方法，以便得到較純的成肌細(xì)胞是進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

2.1 差速貼壁

該方法是利用成纖維細(xì)胞先于成肌細(xì)胞貼壁的原理來分離細(xì)胞，當(dāng)成纖維細(xì)胞已經(jīng)貼壁而成肌細(xì)胞未貼壁或貼壁不多時(shí)，轉(zhuǎn)出含有尚未貼壁的成肌細(xì)胞的細(xì)胞懸液于一新培養(yǎng)瓶，重復(fù)3次以上即可完成細(xì)胞純化。在成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究中很多研究者都采用這一方法進(jìn)行純化。如 Wu等[6]、Kyle等[7]都采用該方法分別對(duì)山羊、小鼠骨骼肌進(jìn)行純化。另外，差速貼壁純化法有別于其他細(xì)胞標(biāo)記分選方法，對(duì)細(xì)胞生物活性等影響較小，適應(yīng)于在體移植及臨床應(yīng)用；該方法原理相對(duì)簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模培養(yǎng)或生產(chǎn)；但相比其他純化方法，操作步驟相對(duì)較多，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

2.2 梯度離心

該法是將Percoll液制成非連續(xù)密度的梯度液，根據(jù)細(xì)胞的沉降系數(shù)的不同，不同種類的細(xì)胞會(huì)沉降在不同的密度液面之間，然后根據(jù)目的細(xì)胞的沉降特點(diǎn)，選取對(duì)應(yīng)液面即可抽出目的細(xì)胞。Percoll液密度梯度離心法的特點(diǎn)是一次性就能分選純化出目的細(xì)胞，但是所需的細(xì)胞量大、操作步驟繁瑣、易受污染等。

2.3 其他

隨著成肌細(xì)胞特異性的標(biāo)志物的逐漸認(rèn)識(shí)，流式細(xì)胞分選、免疫磁珠分選等技術(shù)開始被用來分選成肌細(xì)胞。Bosnakovski等[8]通過 Pax7標(biāo)記成肌細(xì)胞成功運(yùn)用流式細(xì)胞分選方法將其分選出來。流式細(xì)胞分選和免疫磁珠分選的特點(diǎn)是可以短時(shí)間內(nèi)純化出高純度的目的細(xì)胞，但是由于產(chǎn)量低，設(shè)備和條件的限制，較難普遍開展，并且所使用的抗體等試劑價(jià)格較高且有種屬特異性，所以上述兩種方法的應(yīng)用受到限制。另外使用成纖維細(xì)胞抑制劑也被認(rèn)為是一種純化方法，但是抑制劑不可避免的會(huì)影響成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，所以應(yīng)用并不廣泛。

3 影響成肌細(xì)胞增殖分化的因素

從組織工程學(xué)的角度考慮，成肌細(xì)胞作為種子最好是保持增殖狀態(tài)避免分化為肌管，以便于體外獲得更多且保留“干性”的種子細(xì)胞[9]，因此研究影響成肌細(xì)胞增殖分化的因素就顯得極為重要。

正常成年骨骼肌中，成肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，不進(jìn)行有絲分裂，不進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)錄，處于細(xì)胞周期G0期，當(dāng)成肌細(xì)胞受到外界刺激，如機(jī)械牽拉、損傷或者肌病時(shí)便被激活，進(jìn)入G1期開始增殖。目前關(guān)于成肌細(xì)胞啟動(dòng)激活的作用機(jī)制還不完全清楚，但是有學(xué)者認(rèn)為在成肌細(xì)胞激活過程中一氧化氮（NO）/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（c-MET）信號(hào)通路起著重要作用[10]。

激活后的成肌細(xì)胞增殖和分化受多種因素的影響，其中包括MRF和多種生長(zhǎng)因子。但目前對(duì)它們的具體作用機(jī)制仍處于探索研究階段。

肌肉特異性的基礎(chǔ)蛋白 MyoD、Myf5、肌細(xì)胞生成素（myogenin，Myog）和MRF4組成了MRF轉(zhuǎn)錄因子家族，它們?cè)诔杉∵^程中調(diào)控著基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控起著重要的作用。已被證實(shí)，MyoD和Myf5直接激活參與細(xì)胞周期進(jìn)程的基因，導(dǎo)致成肌細(xì)胞增殖；Myog通過激活下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表現(xiàn)出抗增殖活性，導(dǎo)致成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期并進(jìn)行成肌分化；MRF4由于缺乏良好的細(xì)胞模型對(duì)其功能進(jìn)行研究，所以它對(duì)于成肌作用的特點(diǎn)尚未揭示清楚[11]。

HGF可以作用于靜息和激活成肌細(xì)胞的表面受體 c-Met，活化的HGF/c-Met通可以刺激靜息的成肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期、增加其增殖并抑制成肌分化[12]。bFGF參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、遷移和胚胎發(fā)育。在活體骨骼肌以及體外培養(yǎng)分化的成肌細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有bFGF[13]。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞活性方面扮演著重要角色。IGF-Ⅰ有多重功能，包括抗炎、細(xì)胞遷移以及促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖分化；IGF-Ⅱ被認(rèn)為只有促進(jìn)成肌分化的作用[14]。

近期研究表明[15]，低氧環(huán)境通過上調(diào) Pax7以及下調(diào)MyoD和Myog利于成肌細(xì)胞維持靜止?fàn)顟B(tài)，這一過程可能是通過激活Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的；更為重要是的低氧環(huán)境能夠增加移植效率并促進(jìn)移植細(xì)胞的自我更新。

4 成肌細(xì)胞臨床應(yīng)用前景

近年來，隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展的深入，細(xì)胞、基因治療逐漸步入臨床應(yīng)用。有研究表明，成肌細(xì)胞移植后不僅可修復(fù)局部組織缺損，還能與宿主細(xì)胞融合共享正?；虍a(chǎn)物，進(jìn)而治療宿主的基因缺陷[16]。體現(xiàn)了成肌細(xì)胞可應(yīng)用于細(xì)胞治療和基因治療的兩面性，進(jìn)而被廣泛關(guān)注。

4.1 成肌細(xì)胞在心臟疾病治療的應(yīng)用

成肌細(xì)胞用于心肌梗死后移植的想法起源于在20世紀(jì)90年代中期左右，基于幾個(gè)臨床相關(guān)的優(yōu)勢(shì)，成肌細(xì)胞成為第一個(gè)試圖被用來治療心衰的細(xì)胞[17]。這些優(yōu)勢(shì)包括：自體來源，高度增殖能力，成肌分化特性，抗缺血能力[18]。成肌細(xì)胞移植能增加心肌梗死動(dòng)物模型的左心室功能[19]。盡管移植的成肌細(xì)胞仍然保留著增殖能力，但是幾周后移植心臟上只檢測(cè)很少的移植細(xì)胞。心內(nèi)移植的成肌細(xì)胞存活率低原因可能是無效移植和它們?cè)隗w內(nèi)有限的再生能力導(dǎo)致的。使用自體成肌細(xì)胞移植已經(jīng)證明通過減輕受損心臟的心臟重塑和心肌代謝來提高心功能[20]。當(dāng)然，成肌細(xì)胞移植治療心臟疾病所需要面對(duì)的問題還遠(yuǎn)不止這些，如合適的細(xì)胞移植數(shù)目、移植后可能出現(xiàn)心電紊亂進(jìn)而導(dǎo)致心律失常等問題需要今后更多、更加深入的研究。

4.2 成肌細(xì)胞在肌損傷和肌病的應(yīng)用

成肌細(xì)胞移植一直以來被認(rèn)為是肌損傷和肌病的有效治療方式，特別是進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致的肌萎縮，如杜氏綜合征（DMD）。現(xiàn)已研究證實(shí)，成肌細(xì)胞能夠在萎縮肌肉里形成肌萎縮蛋白（分布于骨骼肌和心肌細(xì)胞膜的質(zhì)膜面，起細(xì)胞支架作用，維持肌纖維完整性和抗?fàn)坷δ埽╆栃约±w維，并且這種供體來源的肌萎縮蛋白的轉(zhuǎn)錄可以被觀察到[21]，移植后肌纖維的強(qiáng)度得到明顯提高[22]。目前限制成肌細(xì)胞移植治療的障礙是移植細(xì)胞迅速死亡以及移植細(xì)胞遷移能力有限[23]，可以分別通過使用免疫抑制劑以及高密度接種使其得到一定的解決[24]。對(duì)于體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞的再生能力以及自我更新能力受限的問題，目前部分研究關(guān)注提高成肌細(xì)胞培養(yǎng)條件[25]，已期望解決這一問題。

4.3 成肌細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病的應(yīng)用

肌源性細(xì)胞移植已被用來治療由于括約肌缺乏或者損傷導(dǎo)致的尿失禁。將成肌細(xì)胞移植到下尿路的尿道和膀胱壁上后，觀察到這些部位的平滑肌層有肌管肌纖維形成[26]。高度純化的肌源性細(xì)胞（包括有干細(xì)胞特性的克隆譜系細(xì)胞）不僅在注射點(diǎn)展現(xiàn)出成肌分化，而且也能分化成 平滑肌肌動(dòng)蛋白陽性肌細(xì)胞；另外，實(shí)驗(yàn)研究表明在膀胱注射部位一些供體細(xì)胞移植來源的肌纖維可以接受神經(jīng)支配并表達(dá)乙酰膽堿受體[27]。總體說來，壓力性尿失禁患者的一期臨床實(shí)驗(yàn)的初步研究結(jié)果是鼓舞人心的。12個(gè)月的跟蹤隨訪顯示85%的尿失禁病人得到了治愈[17]。

4.4 成肌細(xì)胞在骨科的應(yīng)用

目前應(yīng)用于骨組織修復(fù)的種子細(xì)胞研究主要集中在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），并已證實(shí)其良好的應(yīng)用前景，但是其來源及取材限制等問題卻不可忽略。骨骼肌源性干細(xì)胞（MDSCs）是一類具有多分化潛能和自我更新能力的多潛能干細(xì)胞。此外，這些干細(xì)胞豐富，易于獲得和迅速擴(kuò)增。研究人員用純化的小鼠肌源性干細(xì)胞的克隆譜系證明了這種細(xì)胞移植能夠促進(jìn)骨愈合，并且表明這些細(xì)胞是良好的BMP4 （TFG-超家族成員之一，對(duì)骨形成起著重要作用）基因載體。同時(shí)攜帶BMP4和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的肌源性干細(xì)胞在骨形成時(shí)能夠一起到協(xié)同作用，能同時(shí)促進(jìn)骨和血管生成[28]。近期研究者從兔骨骼肌組織中分離培養(yǎng)出MDSCs，并成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，而且誘導(dǎo)分化后細(xì)胞外基質(zhì)可見明顯礦化，成骨基因mRNA表達(dá)明顯升高[29]。

4.5 成肌細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用

成肌細(xì)胞作為成體干細(xì)胞已被證實(shí)有多向分化潛能，向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化就是其中一種[30]。近年研究人員利用生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞在一定條件下可以向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。MitraLavasani等人從成人肌組織分離得到肌源性干細(xì)胞并將其移植到軸突生長(zhǎng)錐周圍，植入的肌源性干細(xì)胞浸潤(rùn)再生神經(jīng)并向雪旺細(xì)胞分化，促進(jìn)了損傷軸突再生，并且可以檢測(cè)到功能恢復(fù)得到持續(xù)改善，而且術(shù)后18月沒有觀察到明顯不良反應(yīng)[31]。

5 展望

伴隨細(xì)胞、分子生物學(xué)研究的發(fā)展與進(jìn)步，對(duì)成肌細(xì)胞的研究展示出了誘人的應(yīng)用前景。如何進(jìn)一步深化對(duì)影響成肌細(xì)胞自我更新、增殖分化微環(huán)境等因素的認(rèn)知，充分應(yīng)用無血清培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，使成肌細(xì)胞在組織工程、醫(yī)用再生生物材料的研發(fā)與3D打印技術(shù)領(lǐng)域中得到應(yīng)用，將會(huì)為臨床精準(zhǔn)醫(yī)療奠定基礎(chǔ)，而（成?。┘?xì)胞培養(yǎng)體系的建立與完善是促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化不可或缺的。

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Primary culture of myoblast and its clinical application prospect

Qiu Yujia1,Wang Wei2,3.1 School of Graduate,Jinzhou Medical University;2 Department of Orthopedics Research In stitute,Jinzhou MedicalUniversity;3KeyLaboratory ofMedical Tissue Engineering,JinzhouLiaoning,121000,China

Myoblast,mononuclearquiescent cellsin muscle tissue,locatedbetweensarcolemmaandbasementmembrane, the precursor cell of muscle cell,plays an important role in the repair process of damaged muscle.With the development ofmolecular biologyandcellbiology,pecu-liaritiesof myoblastwere further discovered,suchaseasyaccessibility,wide source,strongabilityof proliferationanddifferentiationin vitro,fusionwith receptormusclecellsandsharegeneproducts, without unlimited proliferation and tumor formationafter implantation,autologous myoblast transplantation would not cause ethical controversy.Therefore myoblast is regarded as excellent seed cells to be used in the study and treatment of many kinds of system related diseases.This article provides a summary concentrate on the primary myoblast isolation, purification,factors affecting the proliferation and differentiation,and the prospects of the clinical application.

Myoblast;Primary culture;Cell therapy

Q813.1+1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.02.018

swgk2016-09-00207

邱裕佳（1989-）男，碩士。研究方向：骨、脊髓與周圍神經(jīng)損傷修復(fù)重建。

*[通訊作者]王偉（1961-）男，博士，二級(jí)教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：骨、脊髓與周圍神經(jīng)損傷修復(fù)重建、醫(yī)學(xué)組織工程與再生醫(yī)學(xué)。

2016-09-06)

遼寧省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（201602322、2015020556）

錦州醫(yī)科大學(xué)，1研究生院；2骨外科學(xué)研究所；3遼寧省醫(yī)學(xué)組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；遼寧錦州121000