EasyDisc與傳統(tǒng)平皿計數(shù)法檢測水中菌落總數(shù)的比較

周東海，趙旭坤，王晉宇，郭志宇，楊燁

（1.蘇州蘇水環(huán)境監(jiān)測服務(wù)有限公司，江蘇蘇州 215131；2.愛德士緬因生物制品貿(mào)易（上海）有限公司，上海 200336）

近些年，人們對生活品質(zhì)的追求越來越高，生活飲用水品質(zhì)提升的呼聲不斷，上海和深圳分別發(fā)布了地方《生活飲用水水質(zhì)標準》（DB31/T 1091—2018）和（DB4403/T 60—2020），其產(chǎn)品指標的數(shù)目和要求與2006年原衛(wèi)生部發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749—2006）均有一定的提升，其中表征水體微生物污染程度的菌落總數(shù)限值均由100 CFU/mL調(diào)整為50 CFU/mL。目前測定水中菌落總數(shù)的標準方法主要為傳統(tǒng)的平皿計數(shù)法，即用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在36～37 ℃有氧靜置培養(yǎng)48 h然后計數(shù)，由于該方法的培養(yǎng)條件限制，部分已被證實存在于水體中的有害細菌，如弧菌（Vibrio）、沙門氏菌（Salmonella）等，難以在此條件下生長，導(dǎo)致檢測值偏低[1-2]。同時該方法存在諸如培養(yǎng)基配制、滅菌等步驟多，操作過程易引入污染，對檢測環(huán)境要求高，結(jié)果讀數(shù)耗時且人工讀數(shù)誤差大等不足，不能滿足實驗室大宗樣品的快速檢測和突發(fā)應(yīng)急檢測的需求，雖然該方法在近期有一定更新，但是其原理和操作步驟并沒有顯著變化[3]。水中菌落總數(shù)檢測的酶底物法（EPA9215），已于2013年寫入廣東省地方標準《水中菌落總數(shù)復(fù)合酶底物檢測方法》（DB44/T 1163—2013），同時該方法已經(jīng)在《生活飲用水標準檢驗方法》（GB/T 5750）征求意見稿中進行了公示，可以認為是相對成熟的方法。其他菌落總數(shù)檢測方法如定量盤檢測法（HPC for Quanti-tray）[4]或者ATP檢測法[5]，存在樣品取樣量大或耗材不易保存等缺點，均未得到大面積推廣。

EasyDisc法是一種檢測水中菌落總數(shù)的新方法，基本原理是EasyDisc內(nèi)置了添加顯色底物的脫水PCA培養(yǎng)基，微生物在此培養(yǎng)基上能代謝生成特異性酶，促進顯色底物反應(yīng)生成藍色物質(zhì)，方便計數(shù)[6]。操作時僅需要將1 mL樣品加入EasyDisc平皿，水平搖晃使樣品均勻分布，室溫下靜置后放入36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。與傳統(tǒng)平皿計數(shù)法相比，該法無需煩瑣的人工配制培養(yǎng)基環(huán)節(jié)，操作時間短，顯著降低檢測流程可能引入的污染。本文使用EasyDisc法和傳統(tǒng)平皿計數(shù)法，同時檢測NSI質(zhì)控樣和蘇州地區(qū)供水生產(chǎn)和供水管網(wǎng)樣品中的菌落總數(shù)，并將檢測結(jié)果進行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

平板計數(shù)瓊脂（PCA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；定性標準菌株大腸埃希氏菌和腸球菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；硫代硫酸鈉，國產(chǎn)分析純，配制0.1 mol/L溶液，高壓蒸汽滅菌備用；EasyDisc試劑、NSI質(zhì)控樣、無菌磷酸緩沖液，美國IDEXX公司；水樣品，蘇州地區(qū)X水廠水源水和出廠水，X水廠對應(yīng)供水管網(wǎng)的末梢水和二次供水；樣品采集和保存參照《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）進行；上海森信GRP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱，控溫精度達到0.5 ℃，經(jīng)權(quán)威計量測試機構(gòu)計量合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 平皿計數(shù)法

參照標準方法《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）（1.1）進行檢測，將方法中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）替換成平板計數(shù)瓊脂（PCA）。

1.2.2 EasyDisc法

取下EasyDisc蓋子，向平皿中加入1 mL樣品，輕輕回旋平皿，使樣品均勻遍布于整個平皿，室溫靜置20 min后放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±3）h。

1.2.3 NSI質(zhì)控樣使用方法

將質(zhì)控樣從冷藏箱中取出，室溫平衡15 min后全部移入100 mL無菌磷酸緩沖液中，溶解后30 min內(nèi)使用。

1.2.4 其他定性標準菌株使用方法

按照說明書復(fù)壯后，接入營養(yǎng)肉湯（NB），振蕩培養(yǎng)24 h得到菌懸液，使用無菌磷酸緩沖液梯度稀釋103、104倍，獲得不同濃度的菌懸液備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSI質(zhì)控樣檢測結(jié)果分析

按照1.2.3方法的準備質(zhì)控樣，按照1.2.1和1.2.2分別采用兩種方法對其進行檢測，檢測結(jié)果見表1和圖1，可以發(fā)現(xiàn)平皿計數(shù)法和EasyDisc法檢測NSI質(zhì)控樣，其結(jié)果均在其可接受范圍內(nèi)。

表1 EasyDisc和平皿計數(shù)法檢測NSI質(zhì)控樣的結(jié)果

圖1 EasyDisc和平皿計數(shù)法檢測圖片

2.2 實際樣品檢測結(jié)果分析

選取蘇州地區(qū)40個實際樣品，采用2種方法進行檢測，結(jié)果見表2。傳統(tǒng)平皿計數(shù)法和EasyDisc法具有相近的實驗結(jié)果，適用于該地區(qū)水中菌落總數(shù)的檢測。

表2 EasyDisc和平皿計數(shù)法檢測蘇州地區(qū)實際樣品的結(jié)果

選取蘇州地區(qū)1個出廠水樣品和1個管網(wǎng)水樣品，采用硫代硫酸鈉脫氯后，分別加入采用1.2.4方法制備得到的大腸埃希氏菌、腸球菌及兩種菌的混合懸液，檢測結(jié)果如表3所示。

表3 EasyDisc和平皿計數(shù)法檢測蘇州地區(qū)出廠水和管網(wǎng)水加標樣品的結(jié)果

對表2中水源水數(shù)據(jù)和表3中所有數(shù)據(jù)進行EasyDisc和平皿計數(shù)法檢測結(jié)果的配對t檢驗，由于微生物的檢測數(shù)據(jù)結(jié)果屬于偏態(tài)分布，對其以10取對數(shù)計算后再進行t檢驗[7]，結(jié)果P=0.058＞0.05，說明2種方法不存在顯著性差異，可以認為EasyDisc和平皿計數(shù)法的實驗結(jié)果具有一致性，均可有效檢測水中的菌落總數(shù)。大腸埃希氏菌和腸球菌可分別代表腸道微生物中的革蘭氏陰性和陽性菌，通過實驗可以發(fā)現(xiàn)采用EasyDisc檢測兩個菌種加標樣品和平皿計數(shù)法并無明顯差異，并且混合菌種檢測并未見顯著競爭抑制現(xiàn)象，可以認為EasyDisc在檢測水源水和生活飲用水樣品中具有一定的普適性。

3 結(jié)語

EasyDisc是檢測水中菌落總數(shù)的新方法，與傳統(tǒng)平皿計數(shù)法相比，從比對數(shù)據(jù)結(jié)果上看未發(fā)現(xiàn)明顯差異。EasyDisc法具有操作便捷、結(jié)果清晰、環(huán)境需求低、讀數(shù)誤差少等明顯優(yōu)點，能夠為實驗室便捷檢測水中菌落總數(shù)提供支持，一定程度上提高了檢測效率。由于EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)還未有相關(guān)正式檢測標準方法，且該法檢測成本相對于平皿計數(shù)法略高，因此可作為傳統(tǒng)平皿計數(shù)法的補充方法。同時考慮EasyDisc法操作快速簡單，在各類應(yīng)急突發(fā)檢測方面也有很大的前景，有望成為水中菌落總數(shù)快速便捷檢測法的一種。