基于多維拉曼光譜的乳粉表征及判別分析

顧 穎，趙姝彤，熊藍(lán)萍，季 娜，洪 浩，張正勇

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 管理科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

乳制品作為消費(fèi)者日常食品購買的重要組成部分，尤其是滿足嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)需求的重要食品來源，其質(zhì)量安全問題一直深受我國市場(chǎng)主管部門和大眾的關(guān)注，然而近年來，國內(nèi)外乳制品相關(guān)質(zhì)量安全問題仍時(shí)見報(bào)道，為此，國家“十四五規(guī)劃綱要”明確提出要加強(qiáng)和改進(jìn)食品安全監(jiān)管制度，完善食品安全法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系，深入實(shí)施食品安全戰(zhàn)略，著力提高食品安全檢測(cè)技術(shù)[1]。針對(duì)乳制品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)，目前管控和研究策略主要包括：① 建立健全國家乳制品相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；② 研究開發(fā)各類先進(jìn)檢測(cè)方法。如李濤等[2]研究建立了一種基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的乳粉中16種喹諾酮類藥物檢測(cè)方法；Mendes等[3]運(yùn)用拉曼光譜結(jié)合主成分分析、偏最小二乘回歸法進(jìn)行了生牛奶中乳清的檢測(cè)；Li等[4]研究構(gòu)建了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的側(cè)向流免疫傳感器，可實(shí)現(xiàn)牛乳中黏菌素的快速識(shí)別。

不過現(xiàn)有研究主要集中于乳制品具體指標(biāo)成分的測(cè)定方面，在乳制品整體品質(zhì)控制方面研究案例還相對(duì)較為匱乏，突出表現(xiàn)在目前“海淘”過程中偽品、次品時(shí)有出現(xiàn)，以次充好“假乳粉”事件等，而偽次品各項(xiàng)指標(biāo)可能是符合國家最低限定標(biāo)準(zhǔn)，造成新的監(jiān)管困境，因此，迫切需要發(fā)展乳制品的品質(zhì)快速判別新方法。本文提出了乳制品特征譜圖分析思路，以牛、羊乳粉為例，從傳統(tǒng)拉曼光譜、二維相關(guān)拉曼光譜兩個(gè)方面構(gòu)建牛、羊乳粉特征譜圖，并進(jìn)一步結(jié)合相似度分析算法量化分析了牛、羊乳粉譜圖間的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用牛、羊乳粉：南京蘇果超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Prott-ezRaman-D3型激光拉曼光譜儀：激光波長(zhǎng)785 nm，激光最大功率約為450 mW，CCD檢測(cè)器溫度控制在-85 ℃，積分時(shí)間為50 s，掃描次數(shù)為1次，光譜采集范圍為250～2 000 cm-1，光譜分辨率為1 cm-1，美國Enwave Optronics公司；96孔板：美國Corning Incorporated公司。

1.3 方法

1.3.1 譜圖數(shù)據(jù)采集方法

取適量乳粉粉末樣品置于96孔板的各自獨(dú)立小孔內(nèi)，使得小孔恰好處于充滿狀態(tài)。而后，使用激光拉曼光譜儀光纖探頭對(duì)準(zhǔn)樣品直接進(jìn)行照射測(cè)試，收集信號(hào)，即得到樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)。調(diào)節(jié)激光功率，分別在約255、320、385、450 mW條件下獲取實(shí)驗(yàn)樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)，用以構(gòu)建三維拉曼光譜圖。

1.3.2 譜圖數(shù)據(jù)分析方法

拉曼光譜數(shù)據(jù)經(jīng)光譜儀自帶軟件進(jìn)行基線校正（SLSR Reader software 8.3.9，美國Enwave Optronics公司）、小波降噪處理（Matlab軟件，美國Math Works公司），而后，使用2D-Shige軟件（Shigeaki Morita，日本Kwansei-Gakuin大學(xué)）進(jìn)行動(dòng)態(tài)拉曼光譜數(shù)據(jù)的二維相關(guān)分析，得到樣品的二維相關(guān)拉曼光譜圖。

針對(duì)羊、牛乳粉的拉曼光譜和二維相關(guān)拉曼光譜數(shù)據(jù)，分別從相似性相似度、差異性相似度兩方面進(jìn)行樣品的相似度分析。相似性相似度是衡量各光譜內(nèi)在化學(xué)成分配比的相似程度，研究選取了相關(guān)系數(shù)法、向量夾角余弦法；差異性相似度是衡量?jī)勺V圖間的差異，研究選取了歐氏距離法。

運(yùn)算平臺(tái)：MATLAB R2018a（美國MathWorks公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛、羊乳粉的拉曼光譜分析

羊乳不含牛乳中某些可能導(dǎo)致過敏的異性蛋白，因其脂肪和蛋白質(zhì)顆粒也相對(duì)較小更易于被人體消化吸收，乳蛋白、免疫球蛋白含量較高，脂肪碳鏈較短等特點(diǎn)，受到消費(fèi)者的廣泛認(rèn)可[5]。由于羊乳的產(chǎn)量較牛乳少很多，且價(jià)格普遍高于牛乳，因此，有必要建立牛、羊乳制品的特征譜圖，加強(qiáng)對(duì)牛、羊乳的品質(zhì)管控。拉曼光譜是近年來得到飛速發(fā)展的一種散射光譜技術(shù)，具有譜圖數(shù)據(jù)采集速度快，樣品前處理耗時(shí)少甚至無需樣品前處理等特點(diǎn)，并且可便攜化，十分適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[6]。實(shí)驗(yàn)以牛、羊乳粉為研究對(duì)象，采集了其在不同激光功率條件下的拉曼光譜信號(hào)，如圖1、圖2所示。首先，可以參考已有文獻(xiàn)[7-12]對(duì)譜圖中的光譜峰進(jìn)行物質(zhì)歸屬分析，如在1 750 cm-1附近出現(xiàn)的拉曼光譜峰主要可能是源于與脂肪有關(guān)的酯C＝O伸縮振動(dòng)，牛乳的光譜最高峰出現(xiàn)在1 460 cm-1，其主要是與源自糖類、脂肪的CH2變形振動(dòng)有關(guān)，而羊乳的光譜最高峰出現(xiàn)在1 090 cm-1附近，主要是與源自糖類有關(guān)的C—O伸縮振動(dòng)、C—C伸縮振動(dòng)以及C—O—H變形振動(dòng)，在1 010 cm-1附近出現(xiàn)的拉曼光譜峰是一個(gè)較為特殊的峰，其主要是與樣品所含的蛋白質(zhì)中苯丙氨酸的苯環(huán)振動(dòng)有關(guān)，此外，通過譜圖分析還可發(fā)現(xiàn)，羊乳在1 025 cm-1處出現(xiàn)的光譜峰較牛乳更為尖銳，羊乳在882 cm-1和385 cm-1處出現(xiàn)光譜峰，而牛乳在這兩處沒有明顯的光譜峰，更多的光譜峰歸屬見表1。由此看出，通過拉曼光譜表征可以顯示出牛、羊乳粉豐富的物質(zhì)組成信息，主要含有脂肪、糖類和蛋白質(zhì)分子，有個(gè)別拉曼光譜峰僅羊乳顯現(xiàn)，在拉曼光譜的峰型、峰位置、峰強(qiáng)度方面，牛、羊乳粉譜圖表現(xiàn)出明顯不同，反映出牛、羊乳物質(zhì)組成有一定差異。其次，從圖中還可以看出，不同激光功率條件下，牛、羊乳樣品的拉曼光譜峰呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，比如在255 mW時(shí)，僅有少量的譜峰出現(xiàn)，隨著激光功率增大，大量的譜峰開始出現(xiàn)，且譜峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出一定的動(dòng)態(tài)變化特征。

表1 牛、羊乳粉主要的拉曼光譜峰可能歸屬

圖1 不同激光功率下牛乳粉拉曼光譜圖

圖2 不同激光功率下羊乳粉拉曼光譜圖

2.2 牛、羊乳粉的二維相關(guān)拉曼光譜分析

前述分析揭示出牛、羊乳粉拉曼光譜隨著外界條件變化呈現(xiàn)出一定的動(dòng)態(tài)變化特征，據(jù)此可進(jìn)一步開展二維相關(guān)分析，該技術(shù)是由Noda等[13-15]提出的一種新型光譜數(shù)據(jù)處理方案，基本思路就是收集樣品在外擾作用下動(dòng)態(tài)譜圖，而后運(yùn)用相關(guān)分析方法，實(shí)現(xiàn)多張譜圖的重構(gòu)融合，構(gòu)建樣品在三維空間中的特征譜圖。為減少光譜采集過程中隨機(jī)噪聲對(duì)后續(xù)三維譜圖構(gòu)建的影響，實(shí)驗(yàn)采用小波降噪的方法進(jìn)行了光譜預(yù)處理，選擇coif1小波基，有效消除了光譜噪聲[16]。進(jìn)一步對(duì)上述降噪后的4張光譜數(shù)據(jù)，以平均峰為參考峰，運(yùn)用二維相關(guān)分析法進(jìn)行了三維譜圖構(gòu)建，圖3為牛乳粉的二維相關(guān)拉曼光譜同步圖，其最大的自動(dòng)峰為（1 666，1 666），其他自動(dòng)峰有（1 455，1 455）、（1 326，1 326）、（1 100，1 100）、（856，856）等，交叉峰有（1 455，1 660）、（1 290，1 440）、（1 100，1 290）、（870，1 110）等，由于動(dòng)態(tài)光譜信號(hào)是隨著激光強(qiáng)度增強(qiáng)依次增大的，故在新構(gòu)建的三維光譜圖中相關(guān)光譜信號(hào)均為正相關(guān)，數(shù)值為正值。采用同樣的處理方法，得到羊乳粉的二維相關(guān)拉曼光譜同步圖，如圖4所示，自動(dòng)峰有（1 666，1 666）、（1 455，1 455）、（1 265，1 265）、（1 100，1 100）、（870，870）、（366，366）等，交叉峰有（1 455，1 666）、（1 300，1 445）、（1 100，1 300）、（1 100，1 460）、（876，1 090）、（870，1 455）等，可以看出，牛、羊乳粉在三維空間特征譜圖上差異顯著，羊乳粉的出峰數(shù)量明顯較多。

圖3 牛乳粉二維相關(guān)拉曼光譜同步圖

圖4 羊乳粉二維相關(guān)拉曼光譜同步圖

2.3 羊、牛乳粉的拉曼光譜相似度分析

基于拉曼光譜、二維相關(guān)拉曼光譜可表征樣品豐富的化學(xué)組成、光譜特征信息，并可進(jìn)行直觀的肉眼鑒別，但是尚難給出樣品間定量化的判別分析，因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步結(jié)合相似度算法，進(jìn)行量化分析[17]。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取了3個(gè)牛乳粉樣品數(shù)據(jù)和3個(gè)羊乳粉樣品數(shù)據(jù)，分別計(jì)算這6個(gè)樣品數(shù)據(jù)之間的相似度。以各樣品在450 mW條件下測(cè)試獲取得拉曼光譜并經(jīng)小波降噪后數(shù)據(jù)為輸入，相關(guān)系數(shù)法計(jì)算得到牛乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.996 5～0.998 2，羊乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.985 7～0.998 6，而牛、羊乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.947 0～0.972 2。向量夾角余弦系數(shù)計(jì)算得到牛乳粉樣品間夾角余弦值為0.997 7～0.998 8，羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.990 8～0.999 1，牛、羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.965 8～0.981 7。歐氏距離計(jì)算得到牛乳粉樣品間歐氏距離為4.286 0×103～8.813 0×103，羊乳粉樣品間歐氏距離為1.028 9×104～1.434 1×104，羊、牛乳粉樣品間歐氏距離為2.080 9×104～3.847 9×104，如表2所示。

表2 拉曼光譜歐氏距離計(jì)算結(jié)果 ×104

以樣品二維相關(guān)拉曼光譜數(shù)據(jù)為輸入，相關(guān)系數(shù)法計(jì)算得到牛乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.994 9～0.997 3，羊乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.978 2～0.997 9，而牛、羊乳粉樣品間相關(guān)系數(shù)值為0.921 9～0.958 0。向量夾角余弦系數(shù)計(jì)算得到牛乳粉樣品間夾角余弦值為0.995 5～0.997 6，羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.980 5～0.998 1，牛、羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.931 0 ～0.962 6。歐氏距離計(jì)算得到牛乳粉樣品間歐氏距離為6.395 0×107～1.632 5×108，羊乳粉樣品間歐氏距離為2.019 8×108～3.097 2×108，牛、羊乳粉樣品間歐氏距離為4.679 0×108～8.510 3×108，如表3所示。

表3 二維相關(guān)拉曼光譜歐氏距離計(jì)算結(jié)果 ×108

定量化的分析結(jié)果揭示出：① 無論是相關(guān)系數(shù)、夾角余弦，還是歐氏距離，結(jié)果均顯示出牛、羊乳粉同品種樣品間具有較高的相似度，而牛、羊乳粉不同品種樣品間則表現(xiàn)出較大的差異度。同時(shí)，較之相關(guān)系數(shù)、夾角余弦值，歐氏距離刻畫牛、羊乳粉樣品間的差異性更為明顯。② 與直接使用拉曼光譜結(jié)合相似度運(yùn)算相比，二維相關(guān)拉曼光譜在揭示牛、羊乳粉樣品內(nèi)相似樣品之間的差異方面，可提供更高的譜圖分辨率，因而相關(guān)系數(shù)、夾角余弦值表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，歐氏距離值則表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)提出并構(gòu)建了牛、羊乳粉的多維拉曼光譜特征譜圖表征方案，系統(tǒng)論證并定量化評(píng)估了牛、羊乳粉同品種樣品間相似、不同品種樣品間差異情況。拉曼光譜呈現(xiàn)了樣品豐富的特征組分信息，二維相關(guān)拉曼光譜則呈現(xiàn)了樣品動(dòng)態(tài)變化特征，進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)系數(shù)、夾角余弦和歐氏距離算法，定量化分析結(jié)果揭示出牛、羊乳粉間的差異性較大，且二維相關(guān)拉曼光譜圖分辨率更高，可實(shí)現(xiàn)樣品有效判別。該實(shí)驗(yàn)方案具備在牛、羊乳粉鑒別、質(zhì)量控制等多個(gè)方面的潛在應(yīng)用價(jià)值，并且這種多維特征譜圖構(gòu)建和多層次分析思路也可為其他食品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供借鑒。