金雀花根水提物和乙醇提取物對小鼠高尿酸血癥的影響Δ

趙俊杰，張金娟，張春雷，朱勤鳳，廖尚高#（.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，貴陽 550002；.貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴陽 550025）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于體內(nèi)尿酸分泌過多或排泄不足而引起的，現(xiàn)已被證實是引起痛風、腎功能不全、高血壓、高脂血癥、糖尿病和肥胖等癥的關(guān)鍵因素[1]。早期預防和治療HUA 對上述疾病的預防具有重要意義。尿酸是黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）氧化黃嘌呤和次黃嘌呤產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。XOD長期過量產(chǎn)生尿酸和/或腎臟排泄尿酸不足可能導致HUA 和尿酸鈉晶體沉積。目前治療HUA 的化學藥主要有2類：一類是減少尿酸過量生成類藥物，如別嘌醇和非布索坦等；另一類是促進尿酸排泄類藥物，如苯溴馬隆和丙磺舒等[2]。這2 類藥物雖療效尚可，但靶點較單一、副作用較大，患者的耐受性、依從性均較差[3－4]。

金雀花根又名錦雞兒根、陽雀花根，是豆科植物錦雞兒Caragana sinica（Buc’hoz）Rehd.的根，主要分布在我國河北、陜西、江蘇、四川、云南等地，具有補肺健脾、活血祛風的功效，臨床上主要用于風濕骨痛、痛風、肺虛、久咳等癥的治療[5]。本課題組前期考察了27種中草藥的醇提物和水提物對XOD 的抑制活性，發(fā)現(xiàn)金雀花根水提物（water extract ofC.sinica，WCS）及乙醇提取物（ethanol extract ofC.sinica，ECS）具有顯著的XOD抑制活性[6]。本研究采用氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤建立HUA小鼠模型，研究WCS及ECS對HUA模型小鼠尿酸生成和排泄的影響，初步探討其可能機制，以期為抗HUA藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ELX815型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國Bio-Tek 公司）、5200 型全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、P50002F型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、BS223S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、ZYCGF-Ⅱ-10T 型超純水機（四川卓越水處理設(shè)備有限公司）、TGL16M型臺式低速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、DYY-6C 型電泳儀（北京六一儀器廠）、ECLIPSE E100型正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

金雀花根藥材于2020 年9 月采自河北省保定市定州市，經(jīng)貴州醫(yī)科大學標本館館長龍慶德教授鑒定為豆科植物錦雞兒C.sinica（Buc’hoz）Rehd.的根，標本存放在貴州醫(yī)科大學天然藥物化學教研室（標本號202009）。別嘌醇、苯溴馬隆、次黃嘌呤、氧嗪酸鉀（批號分別為L2001089、L2010564、L2007066、D0901A，純度均大于98%）和高效RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳制備試劑盒、彩虹180廣譜蛋白Marker、HRP Substrate Peroxide Solution超敏發(fā)光液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗（批號分別為R0010、PC0020、P1200、PR1910、PE0010、G202117）均購自北京索萊寶科技有限公司；XOD 測定試劑盒（比色法）、血清尿酸（serum uric acid，SUA）測定試劑盒（微板法）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒（微板法）、肌酐測定試劑盒（微板法）（批號分別為A002-1-1、20191011、20190907、20190916）均購自南京建成生物工程研究所；小鼠源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9）、尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1（urate transporter 1，URAT1）、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）單克隆抗體（批號分別為14937-1-AP、NBP1-05054、ab135924）均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；小鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號T0004）購自美國Affinity 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號P2938）購自德國Merck 公司；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 動物

SPF級雄性昆明種小鼠，100只，體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（黔）2018-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，溫度18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h 光照晝夜循環(huán)。本實驗通過貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批（編號2000069）。

2 方法

2.1 WCS與ECS的制備

分別稱取金雀花根2 kg，加16 L水煎煮提取或16 L 75%乙醇回流提取，均提取2 h，再同法提取1 h，過濾，合并相應的濾液，減壓濃縮為浸膏，得WCS 400 g、ECS 519 g，備用。

2.2 分組、建模與給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機分為正常對照組、模型組、別嘌醇組（陽性對照，5 mg/kg[7]）、苯溴馬隆組（陽性對照，7.8 mg/kg[8]）和WCS 低、中、高劑量組（38、75、150 mg/kg，根據(jù)臨床常用劑量的0.5、1、2 倍換算）以及ECS低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg，根據(jù)臨床常用劑量的0.5、1、2倍換算），每組10只。除正常對照組小鼠腹腔注射和灌胃等體積生理鹽水外，其余各組小鼠于每天早上9：00 腹腔注射氧嗪酸鉀100 mg/kg 聯(lián)合灌胃次黃嘌呤500 mg/kg，連續(xù)7 d，建立HUA 模型[7]。從建模第3 天起，各給藥組小鼠于建模給藥后1 h分別灌胃相應藥物，正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)5 d。

2.3 取樣與體質(zhì)量、臟器指數(shù)分析

分別稱定各組小鼠建模給藥第1、3、5、7 天的體質(zhì)量。末次給藥前，禁食不禁水24 h，末次給藥1 h后小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h，以3 500 r/min離心15 min，取血清，于－20 ℃中保存?zhèn)溆?。采血后脫頸椎處死小鼠，剖取內(nèi)臟，稱定質(zhì)量，計算肝、腎和脾的臟器指數(shù)[臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%]。然后快速將一部分腎組織固定于4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆茫硪徊糠帜I組織與肝組織于－80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清中生化指標和肝組織中XOD活性檢測

取各組小鼠血清適量，按照試劑盒說明書操作，檢測XOD 活性和SUA、BUN、血肌酐（serum creatinine，SCR）含量。另取各組小鼠肝組織100 mg，加入生理鹽水制成10%的勻漿液，以2 500 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測XOD活性。

2.5 肝組織中XOD mRNA表達檢測

采用實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測。取各組3只小鼠的凍存肝組織，研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 預冷的EP 管中，裂解組織后，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后取1 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR檢測。PCR的反應總體系為Takara SYBR Premix Ex Tap 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 2 μL，用ddH2O補至20 μL。反應條件如下：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為參照，采用2－ΔΔCt法計算各組小鼠肝組織中XOD mRNA的相對表達量。引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物長度

2.6 肝組織中XOD 蛋白和腎組織中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表達檢測

采用Western blot 法檢測。分別稱取各組3 只小鼠的凍存肝組織與腎組織樣本各100 mg，加RIPA 組織裂解液1 mL，于冰上研磨成勻漿，于4 ℃以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度。取蛋白終濃度為1 μg/μL的樣本上樣15 μL，加入5×蛋白上樣緩沖液，于100 ℃加熱5 min變性，然后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V 電泳至Marker 紅色條帶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)換電壓120 V 至電泳結(jié)束。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉將膜在室溫下封閉1.5 h，用TBST 緩沖液清洗3 次，每次10 min，分別加入XOD、GLUT9、URAT1、OAT1、GAPDH 一抗（目標蛋白稀釋比例均為1∶1 000，內(nèi)參蛋白稀釋比例均為1∶3 000），4℃孵育過夜；用TBST緩沖液清洗3 次，每次10 min，加入二抗（稀釋比例為1∶3 000），室溫孵育1 h，用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，顯影成像。采用Image J 1.8.0 軟件分析條帶的灰度值，以目標蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值的比值評價蛋白的相對表達量。

2.7 腎組織病理學觀察

取4%多聚甲醛固定的腎組織，乙醇脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，于正置光學顯微鏡下觀察腎組織的病理學變化。

2.8 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 WCS和ECS對HUA模型小鼠體質(zhì)量的影響

如表2所示，與正常對照組比較，別嘌醇組小鼠建模給藥第3、5、7天的體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01），其余各給藥組小鼠體質(zhì)量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明別嘌醇可抑制小鼠體質(zhì)量的自然增長，WCS 和ECS對小鼠體質(zhì)量的增長沒有影響。

表2 WCS和ECS對HUA模型小鼠體質(zhì)量的影響（，n＝10，g）

表2 WCS和ECS對HUA模型小鼠體質(zhì)量的影響（，n＝10，g）

a：與正常對照組比較，P＜0.05

3.2 WCS和ECS對HUA模型小鼠臟器指數(shù)的影響

如表3 所示，各組小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明WCS 和ECS 對小鼠肝臟和脾臟無明顯影響。與正常對照組比較，模型組和別嘌醇組小鼠的腎臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），表明建模劑（氧嗪酸鉀、次黃嘌呤）以及陽性藥物別嘌醇對小鼠腎臟有毒副作用。與模型組比較，WCS 和ECS 各劑量組小鼠的腎臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS能減輕由建模劑引起的腎損傷。

表3 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10，%）

表3 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10，%）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.3 WCS和ECS對HUA模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影響

如表4 所示，與正常對照組比較，模型組小鼠SUA含量顯著升高（P＜0.05），表明HUA 小鼠模型建立成功。與模型組比較，各給藥組小鼠SUA含量均顯著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS均具有抗HUA活性。與正常對照組比較，別嘌醇組小鼠BUN、SCR 含量均顯著升高（P＜0.05），其余各給藥組小鼠BUN、SCR含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明別嘌醇可能會損傷腎功能，WCS和ECS對小鼠腎功能無明顯影響。

表4 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影響（，n＝10）

表4 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠SUA、BUN、SCR含量的影響（，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.4 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠血清和肝組織中XOD活性的影響

如表5所示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清和肝組織中XOD活性均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清、肝組織中XOD活性均顯著降低（P＜0.05），表明WCS和ECS能抑制HUA模型小鼠血清和肝組織中XOD活性。

表5 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠血清和肝組織中XOD活性的影響（，n＝10）

表5 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠血清和肝組織中XOD活性的影響（，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.5 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠肝組織中XOD mRNA和蛋白表達的影響

如圖1和表6所示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中XOD mRNA和蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中XOD mRNA、蛋白的相對表達量均顯著降低（P＜0.05），表明WCS 和ECS 可能通過下調(diào)XOD 的表達來發(fā)揮抗HUA作用。

表6 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠肝組織中XOD mRNA和蛋白表達的影響（，n＝3）

表6 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠肝組織中XOD mRNA和蛋白表達的影響（，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

圖1 各組小鼠肝組織中XOD蛋白表達的電泳圖

3.6 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠腎組織中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表達的影響

如圖2和表7所示，與正常對照組比較，模型組小鼠腎組織中GLUT9、URAT1 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05），OAT1 蛋白的相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，苯溴馬隆組和ECS 高劑量組小鼠腎組織中GLUT9蛋白的相對表達量以及各給藥組小鼠腎組織中URAT1蛋白的相對表達量均顯著降低（P＜0.05），苯溴馬隆組和WCS低、高劑量組以及ECS低劑量組小鼠腎組織中OAT1 蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05），表明WCS和ECS抗HUA作用的機制可能與下調(diào)URAT1表達有關(guān)。

圖2 各組小鼠腎組織中GLUT9、URAT1、OAT1 蛋白表達的電泳圖

表7 WCS和ECS對HUA模型小鼠腎組織中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表達的影響（，n＝3）

表7 WCS和ECS對HUA模型小鼠腎組織中GLUT9、URAT1、OAT1蛋白表達的影響（，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.7 WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠腎組織病理變化的影響

如圖3所示，正常對照組小鼠腎小管邊界清晰，上皮細胞排列整齊；模型組小鼠出現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變，以腎小管擴張和輕度腎水腫為特征；別嘌醇組小鼠出現(xiàn)重度腎水腫和腎小管嚴重擴張；苯溴馬隆組小鼠出現(xiàn)腎小管輕度擴張和輕度腎水腫。與模型組小鼠比較，WCS 和ECS各劑量組小鼠的腎小管擴張均有所減輕，腎水腫程度均明顯減輕，其中WCS 高劑量組和ECS 高劑量組小鼠已恢復到正常水平，表明WCS 和ECS 可在不同程度上改善HUA模型小鼠的腎損傷狀態(tài)。

圖3 WCS和ECS對HUA模型小鼠腎組織病理變化的影響（×200）

4 討論

氧嗪酸鉀是選擇性競爭性尿酸酶抑制劑，次黃嘌呤是尿酸代謝產(chǎn)物的前體。已有研究報道，上述2種藥物聯(lián)合使用可使小鼠體內(nèi)尿酸含量上升并減少尿酸的排泄量[9]。本研究通過腹腔注射氧嗪酸鉀聯(lián)合灌胃次黃嘌呤成功建立了HUA小鼠模型。

XOD是一種分布于臟器和血管的鉬羥化酶，為還原酶的一種，能催化次黃嘌呤與黃嘌呤產(chǎn)生尿酸。當嘌呤代謝紊亂時，可使患者血清中XOD水平增加，進而導致體內(nèi)尿酸增加。正常機體中，尿酸多從腎臟排泄；當尿酸水平過高或腎功能低下時，易導致尿酸積聚在各臟腑和關(guān)節(jié)中，引發(fā)HUA 或痛風性關(guān)節(jié)炎，因此抑制XOD活性或改善腎功能是治療HUA 的主要途徑[10]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，WCS和ECS各劑量組小鼠體內(nèi)的SUA含量、XOD活性以及XOD mRNA和蛋白的相對表達量均明顯降低，表明WCS 和ECS 通過抑制XOD的活性，下調(diào)其mRNA和蛋白的表達，從而降低HUA模型小鼠體內(nèi)SUA含量。

腎臟指數(shù)、BUN 和SCR 是檢測腎功能的靈敏指標[11]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，WCS 和ECS 可降低小鼠腎臟指數(shù)和血清中SUA含量，改善腎小管間質(zhì)病變，減輕腎小管擴張和腎水腫程度，表明WCS和ECS對HUA模型小鼠腎功能損傷具有一定的改善作用。

據(jù)研究報道，尿酸轉(zhuǎn)運蛋白是促尿酸排泄藥物的主要作用靶點，臨床上約90%的HUA 是由腎尿酸排泄不足而產(chǎn)生[12]。GLUT9與URAT1是尿酸鹽在腎小管重吸收的主要轉(zhuǎn)運體；OAT1是尿酸排泄的轉(zhuǎn)運體，其作用是將尿酸從血液吸收到細胞內(nèi)腎小管細胞[13－14]。抑制URAT1 和GLUT9 轉(zhuǎn)運體的表達以及促進OAT1 轉(zhuǎn)運體的表達是降低體內(nèi)尿酸的有效方式[15－16]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，WCS和ECS對HUA模型小鼠腎組織中OAT1和GLUT9的表達影響不顯著，但可明顯下調(diào)URAT1 的表達，表明WCS 和ECS 可能是通過減少腎臟對尿酸的重吸收來調(diào)節(jié)HUA 模型小鼠體內(nèi)的尿酸水平。

綜上所述，WCS 和ECS 能夠顯著降低HUA 模型小鼠SUA 含量，改善其腎臟的病理狀態(tài)，其作用機制可能與抑制XOD 活性和尿酸重吸收、下調(diào)XOD 蛋白和mRNA 表達有關(guān)。本研究僅為WCS 和ECS 對HUA 模型小鼠藥效機制的初步驗證，HUA的病理機制還與炎癥因子、免疫等因素密切相關(guān)，本課題組會繼續(xù)探究WCS和ECS 對HUA 干預的機制，為臨床尋找新型降尿酸藥提供有效的數(shù)據(jù)支撐。