福林酚分光光度法測定蜂毒中總蛋白質

苗會娟，胡衛(wèi)國，徐艷梅，郝麗娟，高燕霞

(1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050011； 2.華北制藥股份有限公司，石家莊 050200； 3.天津大學化工學院，天津 300350)

蜂毒是意大利蜂用電刺激方法采集的毒腺分泌物，經過醇沉、萃取等工藝，提取而制得的凍干粉末，是一種成分復雜的混合物，主要包括肽類、酶類、生物胺、有機酸、礦物質等[1-4]，其中蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，是其最主要的成分[5]。蜂毒具有祛風除濕的功效，可用于治療關節(jié)疼痛、肢體沉重，急性風濕病、風濕性關節(jié)炎等癥候[6-8]，同時還可以增強人體免疫力，是一種潛在的新冠肺炎治療藥物。

由于蜂毒結構復雜，影響藥物穩(wěn)定性的成分較多[9]，而總蛋白質量的變化在一定程度上可以反映藥物的穩(wěn)定性。準確測定蜂毒中總蛋白質含量一方面可以作為質量控制的目標和手段，另一方面可以提高用藥的科學性和精準性，因此建立規(guī)范科學的方法測定蜂毒中總蛋白質含量具有重要意義。現(xiàn)行蜂毒標準收載于國家藥品標準化學藥品地標升國標第十六冊，標準號為WS1-XG-016—2001。該標準中總蛋白含量采用雙縮脲法測定，但該方法在配制對照品溶液和樣品溶液時所用的溶劑不同，前者采用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，后者則采用純水配制，測定波長設定為660 nm，而不是蛋白質-鉬-鎢復合物的最大吸收波長750 nm 或者650 nm[10]，影響測定結果的準確性?，F(xiàn)有文獻多對蜂毒中某一種或者某一類特定組分，如蜂毒肽[5]、蜂毒明肽[11]、磷脂酶A2[12]含量等進行測定。例如采用高效液相色譜法結合熒光檢測器對蜂毒中蜂毒肽類的含量進行測定[13]，但該方法存在定量限較高、準確度和精密度較差，且抗干擾能力差等缺點。隨著液相色譜-質譜(LC-MS)技術的發(fā)展與普及，LC-MS 法在各種基質中蜂毒肽的定量中均有應用[14-16]。然而LC-MS 法離子化效率不高，導致靈敏度較低[13-14]。

《中國藥典》2020 年版[17]通則0731 中共收錄了紫外-可見分光光度法、凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、考馬斯亮藍染色法及2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二羧酸法(BCA 法) 6 種測定蛋白質含量的方法。其中紫外-可見分光光度法只適用于蛋白質的初步篩查；凱氏定氮法和雙縮脲法靈敏度低，且無機含氮化合物干擾測定結果。因為蜂毒略偏堿性，考馬斯亮藍法和BCA 法不適用于測定蜂毒中蛋白質含量。蛋白質中含有酚基的氨基酸殘基(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，在堿性條件下能夠將福林試液中的六價鎢還原成五價鎢，而使溶液顯藍色，并且溶液顏色的深淺與溶液濃度成正比，因此福林酚法廣泛應用于酚類及蛋白質含量的測定[18-20]。但通則中的堿性銅溶液未加入二硫蘇糖醇，測定波長未選用反應產物的最大吸收波長，同樣影響測定結果的準確性。筆者在此基礎上對測定波長和反應時間進行了優(yōu)化，建立了福林酚法測定蜂毒中總蛋白質含量的方法。該方法操作簡單，準確度及精密度良好，可為蜂毒的生產、質量控制和臨床用藥提供實驗依據，同時為蜂毒標準的制定提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外-可見分光光度儀：UV2600 型，日本島津公司。

移液槍：1 mL、5 mL，A 級，美國Eppendorf 公司。

電子天平：XS105 型，感應量為0.01 mg，美國梅特勒-托利多公司。

蜂毒樣品：批號分別為FD20211101、FD20211102、FD20211103，華北制藥華坤河北生物技術有限公司。

血清白蛋白(牛)對照品：22.2 mg/支，批號為140619-202125，中國食品藥品檢定研究院。

福林酚貯備液：酸濃度為1 mol/L，批號為210807，北京索萊寶科技有限公司。

碳酸鈉、酒石酸、硫酸銅、氫氧化鈉：均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

實驗用水為純化水。

1.2 溶液配制

堿性銅溶液：稱取氫氧化鈉10 g、碳酸鈉50 g，加入400 mL水溶解，作為甲溶液；稱取酒石酸0.5 g，加入50 mL 水溶解，另稱取硫酸銅0.25 g，加入30 mL 水溶解，將兩溶液混合作為乙溶液。臨用前，合并甲、乙溶液，并加水定容至500 mL。

福林酚溶液：酸濃度為0.125 mol/L，移取福林酚貯備液12.5 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。

血清白蛋白(牛)對照品溶液：222 μg/mL，取血清白蛋白(牛)對照品1 支，加水約1 mL 溶解，將溶液轉移至100 mL 容量瓶中，用水多次洗滌西林瓶，洗液并入同一容量瓶中，加水稀釋至標線，混勻。

血清白蛋白(牛)系列對照品溶液：用水將血清白蛋白(牛)對照品溶液逐級稀釋成蛋白質的質量濃度分別為44、88、132、176、220 μg/mL 的系列對照品溶液。

蜂毒樣品溶液：200 μg/mL，精密稱取蜂毒樣品約0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至標線，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加水稀釋至標線，搖勻。

1.3 測定方法

精密量取血清白蛋白(牛)系列對照品溶液各1 mL，分別置于具塞試管中，分別精密加入堿性銅溶液1 mL，搖勻，于室溫下放置10 min，然后分別精密加入福林酚溶液4 mL，立即混勻，于25 ℃下反應40 min，在750 nm 波長處測定溶液的吸光度。以蛋白質的質量濃度為自變量、以相應的吸光度為因變量進行線性回歸，計算線性方程和相關系數。另精密量取0.5 mL 蜂毒樣品溶液和0.5 mL 水，置于具塞試管中，同法測定。利用線性方程計算蜂毒樣品溶液中蛋白質的質量濃度，根據稱樣量、定容體積和稀釋倍數換算成樣品中的含量，以質量分數表示。以水代替對照品溶液作為空白，同法測定。

2 結果與討論

2.1 溶劑選擇

蜂毒樣品和血清白蛋白(牛)對照品均易溶于水，故選擇純水作為溶劑。

2.2 檢測波長選擇

分別取血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法進行反應，于490～900 nm 可見光波長范圍內進行掃描，吸收光譜如圖1 所示。由圖1 可以看出，血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液均在750 nm 處有最大吸收，因此選擇檢測波長為750 nm。

圖1 血清白蛋白(牛)對照品溶液和蜂毒樣品溶液吸收光譜圖

2.3 樣品溶液質量濃度選擇

取蜂毒樣品(批號為FD20211101)，按照1.2 方法配制5 種質量濃度的樣品溶液，按照1.3 方法分別進行測定，結果見表1。由表1 可知，隨著樣品溶液質量濃度的增加，總蛋白質含量測定值基本不變，表明樣品的質量濃度在線性范圍內時，測量結果具有良好的重復性。但測定結果的相對標準偏差隨著溶液質量濃度的增加呈現(xiàn)先降低后基本穩(wěn)定的趨勢。當樣品溶液質量濃度為200 μg/mL，即參加反應的樣品溶液質量濃度為100 μg/mL 時，RSD 趨于穩(wěn)定，因此選擇樣品溶液質量濃度為200 μg/mL。

表1 樣品溶液不同質量濃度時的測定結果

2.4 福林酚溶液用量選擇

取蜂毒樣品溶液5 份，各加入堿性銅溶液1 mL，然后分別加入福林酚溶液1.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按照1.3 方法測定溶液的吸光度，結果如圖2所示。由圖2 可以看出，當福林酚溶液加入量為4.0～6.0 mL 時，吸光度趨于平穩(wěn)，故選擇福林酚溶液用量為4.0 mL。

圖2 不同福林酚溶液用量的吸光度

2.5 堿性銅溶液用量選擇

取蜂毒樣品溶液5 份，分別加入堿性銅溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，然后各加入福林酚溶液4.0 mL，按照1.3 方法測定溶液的吸光度，結果如圖3所示。由圖3 可以看出，當堿性銅溶液加入量為1.0 mL 時，吸光度最大。較大的吸光度數值有利于提高測定結果的靈敏度和準確性，因此選擇堿性銅溶液用量為1.0 mL。

圖3 不同堿性銅溶液用量的吸光度

2.6 反應溫度選擇

取蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法，設定反應時間為40 min，分別考察反應溫度為25、40、55 ℃時的測定結果，結果表明，3 種反應溫度條件下總蛋白質質量分數的測定值分別為94.5%、94.2%和94.6%，沒有統(tǒng)計學上的差別。相比之下25 ℃時操作更加簡單、便捷，故選擇反應溫度為25 ℃。

2.7 反應時間選擇

取蜂毒樣品溶液，按照1.3 方法，設定反應溫度為25 ℃，分別考察反應時間為20、30、40、50、60 min時的測定結果，不同反應時間時的吸光度如圖4 所示。由圖4 可以看出，隨著反應時間的延長，吸光度逐漸增大，當反應時間達到40 min 時，吸光度達到最大值并趨于穩(wěn)定，因此選擇反應時間為40 min。

圖4 不同反應時間的吸光度

2.8 線性方程與定量限

取血清白蛋白(牛)系列對照品溶液，按照1.3方法分別進行測定，以蛋白質的質量濃度為自變量(x)、以相應的吸光度為因變量(y)進行線性回歸，計算得線性方程為y=3.078 8x+0.025 7，相關系數為0.999 0，質量濃度線性范圍為44.4～222.0 μg/mL。

按照1.3 方法，對空白溶液連續(xù)測定11 次，根據標準偏差和線性方程的斜率[21]，計算方法定量限為4.6 μg/mL。

2.9 精密度試驗

稱取蜂毒樣品(批號為FD20211103) 0.107 5、0.111 0、0.114 2、0.113 6、0.107 2、0.113 3 g，分別置于100 mL 容量瓶中，按1.2 方法配制樣品溶液，按照1.3 方法分別進行測定，結果見表2。由表2 可知，測定結果的相對標準偏差為1.6%，表明該方法具有良好的精密度，滿足測定要求。

表2 精密度試驗結果

2.10 加標回收試驗

平行移取3 份蜂毒樣品溶液，各0.25 mL，分別精密加入血清白蛋白(牛)對照品溶液0.15、0.25、0.35 mL，按1.3 方法每份樣品測定3 次，結果見表3。由表3 可知，低、中和高3 種加標水平的回收率分別為104.53%、100.46%和96.56%，表明該方法具有良好的準確度。

表3 加標回收試驗結果

3 結語

建立了福林酚分光光度法測定蜂毒中總蛋白質的方法，并考察了該法的精密度、準確度、回收率和定量限。結果表明，各技術參數均滿足檢測要求，建立的方法科學可行，可為蜂毒的質量控制提供技術依據。