腫瘤患者糞菌移植偏好調(diào)查及其腸道菌群組成特征分析

李明霞，楊與珍，岳志瑛，李俊英，鄭儒君

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 a.胸部腫瘤科，b.生物研究治療病房，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西護(hù)理學(xué)院，四川 成都 610041)

糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是指從健康供體的糞便中提取功能菌群移植到患者腸道，以達(dá)到治療疾病的目的[1, 2]。人體胃腸道內(nèi)生存著一千多種微生物，維持人體微環(huán)境的平衡,參與調(diào)節(jié)免疫、新陳代謝、細(xì)胞反應(yīng)等生理功能[3]。越來(lái)越多的研究表明腸道菌群可以促進(jìn)免疫治療功效，影響放療、化療的療效及相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生[4,5]，對(duì)腫瘤患者有利。除此以外，研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌與減少抑郁癥的發(fā)生有關(guān)[6],可見(jiàn)腸道菌群組成甚至能影響情緒、認(rèn)知和心理健康。已有研究發(fā)現(xiàn)FMT可以治愈抑郁癥，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[7]，從而提示了FMT或?qū)⒊蔀橐环N有效的嶄新的腫瘤治療方法[4, 8]。但至今我們卻處于了解腸道菌群作用機(jī)制復(fù)雜性的早期階段[9]，關(guān)于患者對(duì)FMT偏好的相關(guān)研究極少，并且腫瘤患者腸道菌群的組成特征與患者心理健康有何關(guān)聯(lián)更待進(jìn)一步研究和探索。研究表明，心理痛苦與焦慮、抑郁、恐懼等負(fù)性情緒密切相關(guān)[10]，已成為第6大生命體征，可反應(yīng)腫瘤患者的心理健康狀態(tài)?；谝陨?，本研究旨在通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查腫瘤患者是否愿意選擇FMT，探究他們對(duì)FMT的態(tài)度和偏好及影響因素，并將心理痛苦作為反映腫瘤患者心理健康的指標(biāo)，通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)有無(wú)心理痛苦的腫瘤患者腸道菌群的組成特征及結(jié)構(gòu)差異, 以期為今后的臨床實(shí)踐及機(jī)制研究提供重要參考和循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用便利抽樣的方法，選擇2018年9月1日至2018年9月30日四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的120例腫瘤患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過(guò)病理學(xué)診斷為惡性腫瘤；②年齡≥18歲；③生存時(shí)間≥3個(gè)月，了解疾病進(jìn)展；④能夠讀寫中文。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于危急狀態(tài)；②有認(rèn)知障礙或精神病；③由于各種原因未能完成問(wèn)卷，導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失。本研究符合赫爾辛基宣言。在知情同意后由研究者對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料調(diào)查表 采用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查問(wèn)卷以評(píng)估腫瘤患者對(duì)FMT的態(tài)度和偏好。問(wèn)卷包括調(diào)查患者一般資料和臨床指標(biāo)的10個(gè)問(wèn)題(性別、年齡、教育程度、醫(yī)保類型、腫瘤分期、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體力狀況(performance status，PS)評(píng)分和直接與FMT相關(guān)的3個(gè)問(wèn)題(患者對(duì)FMT的意愿、供體、途徑的偏好)[11, 12]。

1.2.2心理痛苦溫度計(jì)(Distress Thermometer,DT)

采用DT對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行評(píng)估，并根據(jù)結(jié)果將其分為有心理痛苦組和無(wú)心理痛苦組。DT的評(píng)估方法為視覺(jué)評(píng)分法，0分表示沒(méi)有痛苦，10分表示極度痛苦，患者在0～10之間評(píng)分，當(dāng)DT≥4分即存在顯著心理痛苦。DT臨界值取4分時(shí)敏感度和特異度分別為0.82和0.73, 具有良好的信效度[7]。本研究無(wú)心理痛苦6例患者(評(píng)分1～3)，有心理痛苦5例患者(評(píng)分4～8)，共11例患者同意研究者收集自己的糞便樣本做高通量測(cè)序。

1.2.316S rRNA高通量測(cè)序技術(shù) 采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本腸道菌群進(jìn)行群落組成分析和差異物種分析。

1.3 數(shù)據(jù)收集本研究結(jié)合了橫斷面調(diào)查和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。研究者使用統(tǒng)一的指導(dǎo)語(yǔ)告知患者研究目的，并向他們解釋糞菌移植的概念、目的和意義，之后進(jìn)行調(diào)查。研究者僅僅記錄患者的回答，不能試圖影響或引導(dǎo)患者的立場(chǎng)和觀點(diǎn)。本次調(diào)查收回有效問(wèn)卷101份(回收率84.2%)。

詢問(wèn)患者是否愿意將糞便送檢，征得同意之后由一名研究者收集糞便,置于滅菌凍存管中,液氮凍存,隨后轉(zhuǎn)置于-80 ℃冰箱保存。使用脫氧核糖核酸(DNA)試劑盒進(jìn)行基因組DNA 抽提后，電泳檢測(cè)DNA。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得16S rDNA基因V4標(biāo)簽片段，選擇Illumina公司構(gòu)建平臺(tái)文庫(kù)，并于Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。研究中的所有數(shù)據(jù)都將嚴(yán)格保密，并且只作研究使用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)推斷不同人口學(xué)特征的患者對(duì)FMT供體、移植途徑的偏好的差異。Logistic二元回歸分析與FMT意愿有關(guān)的影響因素。使用定量分析微生物生態(tài)學(xué)(quantitative insights into microbial ecology,QIIME)軟件將操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)的代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋；根據(jù)OTU分析結(jié)果，進(jìn)行群落組成分析和差異物種分析。統(tǒng)計(jì)和作圖主要使用R6、python和java軟件完成。采用機(jī)器學(xué)習(xí)中的隨機(jī)森林法對(duì)菌群組成差異進(jìn)行比對(duì)分析，找出差異性菌屬。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料本研究納入了符合標(biāo)準(zhǔn)的101例腫瘤患者，平均年齡為53.6歲(20～81歲)，大多數(shù)患者(99例)的腫瘤分期是Ⅱ～Ⅳ期。研究對(duì)象的一般資料見(jiàn)表1。

表1 101例患者一般資料 [n(%)]

2.2 患者對(duì)FMT意愿的影響因素分析101例患者中92例(91.1%)表示愿意選擇FMT，9例(8.9%)沒(méi)有選擇。Logistic多元回歸分析顯示，文化水平和腫瘤分期是FMT意愿的影響因素，見(jiàn)表2?；颊吣挲g、性別、民族、宗教、醫(yī)療保險(xiǎn)、婚姻狀況、生活狀況、原發(fā)腫瘤部位、收入和體力狀況評(píng)分等因素與是否接受FMT無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表2 患者對(duì)FMT意愿的影響因素分析

2.3 患者對(duì)FMT供體的選擇Kruskal-Wallis檢驗(yàn)表明，不同年齡和不同文化水平的腫瘤患者在選擇FMT供體的偏好上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。老年患者更希望接受陌生人的糞菌，初中或初中以下文化程度的腫瘤患者更傾向于接受親屬的糞便進(jìn)行FMT。

表3 不同人口學(xué)特征腫瘤患者FMT供體偏好的差異 (n)

2.4 患者對(duì)FMT途徑的選擇Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果表明，不同性別和不同PS評(píng)分的患者在選擇FMT移植途徑方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。 PS評(píng)分較低的腫瘤患者表明更愿意通過(guò)口服的途徑進(jìn)行FMT。同時(shí)，較高比例的女性患者也愿意采取口服的方式來(lái)完成FMT。

表4 不同人口學(xué)特征腫瘤患者FMT途徑偏好的差異 (n)

2.5 腫瘤患者腸道細(xì)菌群落組成的差異高通量測(cè)序技術(shù)分析顯示：心理痛苦組(Con)變形菌門的豐度明顯高于無(wú)心理痛苦組(Dis)，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度明顯低于無(wú)心理痛苦組(圖1a)。在屬水平上，心理痛苦組擬桿菌豐度低于無(wú)心理痛苦組(圖1b)。機(jī)器學(xué)習(xí)中的隨機(jī)森林分析顯示，兩組患者的糞便樣本中Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌的豐度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

圖1 無(wú)心理痛苦腫瘤患者與有心理痛苦腫瘤患者糞便微生物群優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度 a:患者糞便微生物群在門分類級(jí)別的豐度；b:屬分類水平高豐度微生物群?；鶊D

表5 無(wú)心理痛苦組與有心理痛苦組糞便微生物群優(yōu)勢(shì)菌群屬分類水平豐度比較

3 討論

腸道菌群已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，基于FMT的潛在治療前景，本研究調(diào)查了腫瘤患者對(duì)于FMT的意愿、供體、途徑的態(tài)度和偏好，研究結(jié)果有一定臨床價(jià)值。國(guó)外一項(xiàng)隨訪研究表明，97%的復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染患者較抗生素而言更喜歡FMT[11]。Jalanka等[12]研究報(bào)告也與我們的結(jié)果相似，本研究表明91.1%的腫瘤患者愿意選擇FMT作為腫瘤治療的一個(gè)可選方案。腫瘤患者對(duì)糞菌移植的態(tài)度是積極的，當(dāng)未來(lái)FMT療法成為一種新的惡性腫瘤輔助治療方法時(shí)，能被患者接受。醫(yī)護(hù)人員應(yīng)根據(jù)患者的文化水平進(jìn)行個(gè)體化的指導(dǎo)，有助于患者理解和接受FMT。

FMT的供體包括配偶、直系親屬、其他家庭成員、朋友或伴侶以及陌生人[11]。盡管患者與直系親屬和/或配偶有共同的遺傳背景和生活習(xí)慣，但在未患病的親屬的腸道菌群中沒(méi)有觀察到與患者一致的特征，因此受者和供體之間的親密關(guān)系不會(huì)影響FMT的效果[13]。在我們的研究中，腫瘤患者更喜歡選擇配偶和親屬作為供體，比例占65.2%。這是因?yàn)榕渑己陀H屬作為家屬，與患者形成了一種持久的情感聯(lián)系，是患者認(rèn)為的能夠給予自己安全感的特定對(duì)象[14]，所以患者更愿意選擇他們。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)和文化水平的提高，選擇陌生人作為其供體的患者比例也有所增加，這與他們的閱歷和知識(shí)儲(chǔ)備有關(guān)。糞菌移植作為一項(xiàng)新型的“器官移植”，涉及到供體的選擇和篩查，而隨著糞便銀行和糞菌庫(kù)逐步建立，供體的糞便樣本逐漸增多[15]，患者可能在陌生人中篩選到更合適的供體。因此，不論患者偏好的供體是什么身份，更重要的是供體的菌群是否合格。

國(guó)內(nèi)外研究顯示，可通過(guò)保留灌腸、鼻胃管、結(jié)腸鏡、胃鏡和食管胃十二指腸鏡來(lái)進(jìn)行FMT[16,17]。一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示，通過(guò)保留灌腸或結(jié)腸鏡進(jìn)行的FMT比通過(guò)胃鏡或鼻胃管更有效[18]。但在我們的研究中，大多數(shù)腫瘤患者希望通過(guò)口服來(lái)完成糞菌移植，這是因?yàn)榭诜绕渌o藥途徑更便捷且易于接受。Zhang等[19]著力于糞菌凍干與膠囊制劑等技術(shù)研發(fā)，隨著糞便制備設(shè)備和口服膠囊制劑的工業(yè)發(fā)展，更多患者可能受益，不僅減少了傳統(tǒng)觀念下對(duì)糞便的顧慮，還考慮到患者的偏好，提高了用藥方便性，甚至療效。

既往研究表明腸道菌群與慢性應(yīng)激存在直接關(guān)系[7]。本研究對(duì)11例腫瘤患者進(jìn)行了腸道菌群多樣性組成和差異性物種分析，發(fā)現(xiàn)在無(wú)心理痛苦的腫瘤患者的腸道菌群中，F(xiàn)lavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌豐度均高于有心理痛苦組(P<0.05)。有研究表示，F(xiàn)lavonifractor菌是重要的腸道細(xì)菌，有助于緩解Th2主導(dǎo)環(huán)境中抗原特異性Th2的免疫應(yīng)答，可以作為益生菌治療過(guò)敏反應(yīng)[20]；Akkermansia菌擁有粘附粘液層的能力，可以保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受微生物攻擊，并為微生物提供生長(zhǎng)能量，Akkermansia菌含量低可能導(dǎo)致腸屏障功能減弱，使毒素更容易侵入宿主。Akkermansia菌被認(rèn)為是一種很有研究前景的益生菌[21]；Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)橋本甲狀腺炎患者的Lachnoclostridium菌的數(shù)量比正?；颊邷p小，說(shuō)明Lachnoclostridium菌有利于機(jī)體的免疫應(yīng)答；Zhou等[5]發(fā)現(xiàn)Tyzzerella-3菌的豐度水平與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度之間存在負(fù)相關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)心理痛苦組的糞便樣本中不存在Tyzzerella-3菌。以上這些研究結(jié)論與本研究結(jié)論類似，提示Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌對(duì)腫瘤患者有益。Anaeroglobus菌是一種厭氧菌,F?k等[23]研究認(rèn)為，口腔內(nèi)大量的Anaeroglobus菌會(huì)加重全身炎性反應(yīng)，不利于宿主健康，這與我們的研究結(jié)果不同，原因可能在于：研究對(duì)象不同，各研究對(duì)象在基礎(chǔ)疾病、年齡、生活飲食習(xí)慣等方面存在差異[24]。我們的研究結(jié)果顯示發(fā)生心理痛苦的腫瘤患者腸道菌群的組成發(fā)生了變化，特定菌屬可能會(huì)通過(guò)某種機(jī)制影響宿主的心理健康，這一發(fā)現(xiàn)為今后腸道菌群與腫瘤患者心理的機(jī)制研究開拓了思路。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者愿意接受糞菌移植作為一種腫瘤綜合治療方法，有心理痛苦與無(wú)心理痛苦的腫瘤患者的腸道菌群組成存在差異，提示腸道菌群的組成會(huì)影響腫瘤患者的心理狀態(tài)，為開展腸道菌群與腫瘤心理應(yīng)激之間的環(huán)路機(jī)制及調(diào)控因子的研究提供了新的思路和循證醫(yī)學(xué)依據(jù)，對(duì)臨床具有重要的參考價(jià)值。本研究局限性在于問(wèn)卷調(diào)查和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的樣本來(lái)自單中心，且樣本量較小，需要更大的樣本和更多更完善的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。