IL-33增強胃癌細胞順鉑抵抗的機制研究

謝先澤 樊俏玫 黃偉 翁婭韻 姚文棟 陳云云 施政

據(jù)統(tǒng)計，胃癌是男性第四大、女性第七大最常見的癌癥，全球每年有超過100萬的新病例?；熆稍谝欢ǔ潭壬暇徑饣颊卟∏椋娱L生存期，但由于耐藥性和腫瘤轉移，胃癌患者預后較差[1]，接受手術治療的Ⅲ期胃癌患者5年生存率僅為18%～50%[2]。目前胃癌化療仍然以傳統(tǒng)的細胞毒性藥物為主，但常由于藥物無法有效控制腫瘤轉移而導致患者死亡[3-4]。順鉑是胃癌，尤其是晚期胃癌的主要化療藥物，但由于長期使用，患者可出現(xiàn)耐藥性，順鉑對腫瘤的抑制能力逐漸減弱，最終導致化療失敗[5]。隨著對胃癌發(fā)生、發(fā)展分子機制的深入探索，靶向治療已經(jīng)成為胃癌有效的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)：自噬在胃癌的發(fā)展中起關鍵作用。在缺氧或營養(yǎng)的條件下，腫瘤細胞通過自噬降解衰老的細胞器或蛋白質來維持線粒體功能和能量平衡[6]。Zhuang等[7]發(fā)現(xiàn)：胃泌素17作用下胃癌細胞自噬增強，細胞增殖加快，其機制為胃泌素17誘導了自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1高表達。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)：miR-181a通過靶向自噬相關基因ATG5提高胃癌細胞對順鉑的敏感性，減少裸鼠異種移植胃癌組織的體積。可見，探索自噬相關機制已成為胃癌治療的新方向。本研究通過分析IL-33對胃癌細胞的作用，闡明其功能和被調(diào)控的機制，為胃癌的早期診斷和判斷預后提供新的候選靶標，為未來基于IL-33/生長刺激表達基因2蛋白（growth STimulation expressed gene 2,ST2）的基因治療提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞及來源 胃癌細胞MKN45細胞系（Cellbank-436）和胃癌旁正常胃上皮細胞GES-1（Cellbank-035）均購自浙江如耀生物科技有限公司。所有細胞在RPMI1640培養(yǎng)基（批號：L210KJ，上海源培生物公司）和10%FBS（批號：FBS500，上海源培生物公司）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2，正常傳代。

1.2 主要材料 四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（批號：C0009S）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012S）、超敏電化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）試劑盒（批號：P0018S）均購自上海碧云天生物科技有限公司；依托泊苷（批號：E809313-25 mg）、5-氟尿嘧啶（批號：F809394-1 g）、阿霉素（批號：A864033-25 mg）及順鉑（批號：D807330-250 mg）均購自上海麥克林試劑有限公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA，批號：M129496-1 g）購自上海阿拉丁試劑有限公司；兔抗Beclin1抗體（批號：R1509-1）、兔抗微管相關蛋白1輕鏈 3α/β（LC3A/B）抗體（批號：ab128025）、ST2抗體（批號：ab25877）、兔抗β-微管蛋白（β-tubulin）抗體（批號：ab18207）和羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（批號：ab6721）均購自英國Abcam公司；ST2抑制劑iST2-1（批號：DC12393）購自上海東蒼生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IL-33對MKN45和GES-1細胞增殖的影響 采用MTT法。在96孔板中接種MKN45和GES-1細胞，分別添加0、8、16、32、64、128和256 ng/L的IL-33，正常培養(yǎng)48 h；各樣品加入0.5 g/L的MTT溶液，孵育4 h；加入100 μl二甲基亞砜溶解沉淀的甲臜，搖動15 min；測定每孔中細胞在波長570 nm處的吸光度，計算細胞增殖率。

1.3.2 IL-33作用下胃癌細胞對化療藥物敏感性的檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期胃癌細胞，依次加入0、20、40、60和80 ng/L 的IL-33；分別添加10 μmol/L的依托泊苷（依托泊苷組）、5-氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶組）、阿霉素（阿霉素組）及順鉑（順鉑組），共培養(yǎng)48 h。計算細胞增殖率。

1.3.3 IL-33作用下胃癌細胞對順鉑及其抑制劑敏感性的檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期胃癌細胞，依次加入 0、20、40、60和 80 ng/L 的 IL-33；設置順鉑組（樣品中添加10 μmol/L順鉑）和自噬抑制劑組（樣品中添加10 μmol/L順鉑，同時添加10 mmol/L的3-MA），共培養(yǎng)48 h。計算細胞增殖率。

1.3.4 IL-33對胃癌細胞自噬相關蛋白表達的影響 采用Western blot法。取對數(shù)生長期胃癌細胞，給予0、20、40和80 ng/L IL-33處理，提取細胞總蛋白并檢測自噬相關蛋白Beclin1和LC3A/B。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離包含等量蛋白質的樣品，電轉移到聚偏氟乙烯膜上，并在4℃下用一抗孵育過夜。洗膜緩沖液洗滌后，加入二抗，室溫下孵育1 h。檢測到的蛋白帶通過增強的ECL化學發(fā)光液曝光，并使用Image J軟件進行評估，量化后的數(shù)值以β-tubulin為內(nèi)參，計算Beclin1和LC3A/B相對表達量。

1.3.5 IL-33對胃癌細胞ST2表達的影響 取對數(shù)生長期胃癌細胞，給予10 μmol/L順鉑處理后，分成3組：即順鉑組，順鉑+IL33組（添加終質量為60 ng/L的IL-33）和順鉑+IL-33+iST-2組（添加終質量濃度為60 ng/L的IL-33和10 μmol/L的 iST2-1），以不添加任何試劑的胃癌細胞為空白對照組；分別在培養(yǎng)的第12、24、36和48 h收集細胞。采用MTT法檢測并計算各組細胞增殖率。采用Western blot法檢測Beclin1、LC3A/B和ST2的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0繪圖和統(tǒng)計軟件，所有實驗均重復3次。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同質量濃度IL-33對MKN45和GES-1細胞增殖影響的比較 不同質量濃度IL-33對GES-1細胞增殖影響不大；0、8、16、32、64 ng/L IL-33處理下，MKN45細胞增殖無大變化，IL-33質量濃度＞64 ng/L時，MKN45細胞增殖率上升，128 ng/L IL-33時增殖率為96.81%，256 ng/L IL-33時增值率為97.99%，與不添加IL-33相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量IL-33對GES-1和MKN45細胞增殖影響的比較

2.2 IL-33作用下胃癌細胞對化療藥物敏感性的比較 阿霉素組胃癌細胞增殖率低，不同質量濃度IL-33處理的細胞增殖率變化不大；5-氟尿嘧啶組及依托泊苷培養(yǎng)組，不同IL-33質量濃度下細胞增殖率變化無統(tǒng)計學意義；順鉑培養(yǎng)組，60、80 ng/L IL-33處理與不添加IL-33（0 ng/L）相比，胃癌細胞增殖率均升高（均P＜0.05）。即在IL-33質量濃度≥60 ng/L時，胃癌細胞可能出現(xiàn)順鉑耐藥性。見圖2。

圖2 不同質量濃度IL-33處理下，胃癌細胞對4種化療藥物敏感性的比較

2.3 IL-33處理下胃癌細胞對順鉑及自噬抑制劑敏感性的比較 順鉑組，IL-33處理下胃癌細胞增殖率上升，即IL-33可能促進了胃癌細胞的增殖；給予自噬抑制劑3-MA后，20、40、80 ng/L IL-33處理下胃癌細胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見3-MA有逆轉IL-33對胃癌細胞增殖的作用。見圖3。

圖3 IL-33對順鉑及自噬抑制劑共培養(yǎng)的胃癌細胞增殖率的影響

2.4 不同質量濃度IL-33對胃癌細胞自噬相關蛋白表達的影響 與0 ng/L IL-33組比較 ，20、40、80 ng/L的IL-33處理胃癌細胞，自噬相關蛋白LC3A/B和Beclin1的相對表達量顯著上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 IL-33對胃癌細胞自噬相關蛋白表達的影響（a：自噬相關蛋白電泳圖；b：Beclin蛋白的相對表達量；c：LC3A/B蛋白的相對表達量）

2.5 IL-33對胃癌細胞ST2表達的影響 順鉑組，胃癌細胞增殖率在24 h時最高；順鉑+IL-33組，細胞增殖率持續(xù)上升，36 h時才達到最高值；至培養(yǎng)的第36 h開始，順鉑+IL-33+iST2-1組與順鉑＋IL33組細胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5a。提示iST2-1逆轉了IL-33對順鉑處理的胃癌細胞增殖率的抑制作用。Western blot檢測結果顯示：與對照組比較，順鉑+IL33組LC3A/B及Beclin1蛋白相對表達量提高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；順鉑組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，順鉑+IL33組ST2蛋白相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與順鉑+IL33組比較，順鉑+IL-33+iST-2組ST2蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。可見ST2的抑制劑iST2-1能夠有效逆轉胃癌細胞自噬蛋白的提高，見圖5b-c。

圖5 IL-33對胃癌細胞ST2及自噬相關蛋白表達的影響（a：4組細胞增殖率；b：ST2和自噬相關蛋白電泳圖；c：ST2和自噬相關蛋白的相對表達量）

3 討論

IL-33是IL-1細胞因子家族的新成員[9]，在免疫細胞、胃、肺和前列腺等不同組織中都有表達，生物學活性廣泛；除可以活化Th1，Th2，CD8+T細胞和自然殺傷細胞（NK）等細胞外，IL-33還被認為是一種損傷相關分子模式分子[10]，在組織修復、變態(tài)反應、自身免疫性疾病、感染性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用[11]。本研究用不同質量濃度IL-33處理胃癌細胞和胃上皮細胞，結果發(fā)現(xiàn)：高劑量IL-33提高了胃癌細胞增殖率，這提示IL-33的存在可能對胃癌具有促進作用。順鉑是胃癌治療的經(jīng)典藥物，本研究發(fā)現(xiàn)：不同質量濃度IL-33處理下，與順鉑共培養(yǎng)的胃癌細胞增殖率上升，這提示IL-33能提高胃癌細胞的順鉑耐藥性，即IL-33誘導了胃癌細胞對化療藥物的抵抗。

自噬受一系列自噬相關基因的嚴格調(diào)控，是至關重要的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程，通常在不利的微環(huán)境壓力下激活[12]。在饑餓、缺氧或其他特定的細胞應激條件（如化療藥物等）下，有缺陷的蛋白質和細胞器可通過該過程降解和再循環(huán)來應對壓力，為腫瘤細胞生長提供有利條件。自噬被激活能夠介導化療中某些癌細胞獲得性耐藥表型。研究表明：上調(diào)不同腫瘤細胞系的自噬會增強腫瘤對包括放射療法、化學療法和靶向療法在內(nèi)的抗癌療法的抵抗力[13]。對胃癌細胞的順鉑耐藥性研究表明：抑制甲基轉移酶介導的自噬抑制作用能夠降低胃癌細胞的順鉑敏感性[14]。這說明自噬可能在胃癌細胞順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。自噬抑制可以使以前耐藥的癌細胞重新敏感，并增加化學治療劑的細胞毒性[14-15]。本研究檢測了自噬相關蛋白Beclin1和LC3A/B的表達量，結果發(fā)現(xiàn)：IL-33處理下，胃癌細胞自噬相關蛋白出現(xiàn)高表達，提示IL-33激活自噬；給予自噬抑制劑3-MA后，這些自噬相關蛋白相對表達量顯著下降。證實了IL-33處理下胃癌細胞通過自噬產(chǎn)生順鉑耐藥，而3-MA能有效逆轉IL-33作用下的胃癌細胞順鉑耐藥。

IL-33通過與特異性受體ST2結合后發(fā)揮功能。Zhou等[16]指出：腫瘤細胞與激活的成纖維細胞在TNF-α/IL-33/膜結合受體形式的ST2（ST2L）信號介導下相互作用，促進胃癌轉移。IL-33通過ST2-蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）通路促進胃癌細胞侵襲和遷移[16]。Huang等[17]研究表明：ST2在胃癌組織中高表達。IL-33/ST2通過誘導細胞外調(diào)節(jié)ERK1/2、氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kainse,JNK）和激活p38蛋白，促進了胃癌細胞的惡性進展。因此，IL-33/ST2通路在胃癌進展過程中發(fā)揮極其重要作用。本研究表明：IL-33處理后，順鉑誘導的胃癌細胞ST2出現(xiàn)顯著上調(diào)，給予iST2-1顯著降低ST2的蛋白相對表達量。檢測自噬相關蛋白的表達量可見：在ST2抑制后，LC3A/B與Beclin1也隨即出現(xiàn)下調(diào)；結合MTT結果表明：胃癌細胞對順鉑的敏感性隨著ST2的抑制顯著增加。即IL-33極有可能是通過靶向ST2來介導胃癌細胞自噬從而產(chǎn)生順鉑耐藥。

綜上所述，本研究觀測了IL-33作用下胃上皮細胞與胃癌細胞的增殖率，發(fā)現(xiàn)IL-33可促進胃癌細胞生長；IL-33影響下胃癌細胞對化療藥順鉑產(chǎn)生耐藥效應，其機制是IL-33可誘導自噬發(fā)生，增強胃癌細胞對順鉑的抵抗；ST2的抑制可逆轉IL-33帶來的自噬激活及順鉑耐藥效應。IL-33/ST2途徑可為胃癌順鉑耐藥導致的治療失敗提供新的治療靶點及方向。