維生素D受體基因多態(tài)性與原發(fā)性癲癇的相關(guān)性

朱文葉 陳新元 李敏

摘要：目的：研究維生素D受體多態(tài)性與原發(fā)性癲癇的相關(guān)性。方法：通過病例對照研究，納入71例原發(fā)性癲癇患者作為病例組，同期97例健康者作為對照組，抽取所有研究對象外周靜脈血提取DNA，采用PCR-LDR法檢測維生素D受體單核苷酸位點Cdx-2、 FokI、BsmI及ApaI的多態(tài)性。結(jié)果：病例組和對照組Cdx-2、FokI、BsmI、ApaI的基因型、等位基因、顯性模型及隱性模型均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：維生素D受體單核苷酸位點Cdx-2、FokI、BsmI及ApaI可能與原發(fā)性癲癇的發(fā)生不相關(guān)。

關(guān)鍵詞：維生素D受體;基因多態(tài)性;原發(fā)性癲癇

ABSTRACT： OBJECTIVE To investigate the association between vitamin D receptor gene polymorphism and primary epilepsy. METHEDS A case-control study was conducted in 71 patients with primary epilepsy and 97 healthy controls. DNA was extracted from peripheral venous blood of all subjects. Polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2、FokI、BsmI and ApaIwere detected by PCR-LDR direct sequencing. RESULTS There was no significant difference in all genotype frequency 、allele frequency 、dominant model and recessive model between case group and control group （P >0.05）. CONCLUSION The polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2 （rs11568820）、 FokI （rs2228570）、BsmI （rs1544410） and ApaI （rs7975232） may not be associated with primary epilepsy.

KEY WORDS： vitmin D receptor; gene polymorphism; primary epilepsy

癲癇是最常見及最具潛在危險性的、多種病因參與的一種慢性中樞系統(tǒng)疾病。目前關(guān)于癲癇確切的發(fā)病機制仍不清楚，一般認為是由多種大腦病理性改變的共同終點，如機械性創(chuàng)傷、出生缺氧、產(chǎn)傷、感染、中風(fēng)、腫瘤。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，遺傳因素作為內(nèi)因在癲癇的發(fā)病機制中扮演重要的作用[1-2]。進來年發(fā)現(xiàn)越來越多的基因通過多種機制參與機體功能和發(fā)育過程，對癲癇的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。不同個體應(yīng)用抗癲癇藥物治療的反應(yīng)性有很大的差異，這些差異性可能源于影響藥物代謝動力學(xué)的基因、影響藥物藥效學(xué)的基因和導(dǎo)致癲癇發(fā)作的基因突變[3-7]。

維生素D（vitamin D， VD）屬于脂溶性維生素，是一種維持人體生命所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，除調(diào)節(jié)鈣磷代謝、促進骨骼發(fā)育、調(diào)節(jié)生物細胞分化和免疫功能外，VD在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著獨特作用。VD缺乏會引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病以及癲癇等[8-11]。維生素D受體（vitamin D receptor， VDR）是核受體超家族成員之一，主要位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的細胞核中[12-13]。VDR與VD結(jié)合后通過信號通路的傳導(dǎo)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用。研究表明糾正VD缺乏狀態(tài)可以控制癲癇發(fā)作，此外，動物實驗研究表明 [11]增加小鼠海馬區(qū)VD3 水平可以提高誘發(fā)癲癇的閾值;相反，敲除VDR會增加癲癇的發(fā)生風(fēng)險?；谝陨涎芯?，我們推測VDR基因的多態(tài)性可能參與了癲癇的發(fā)生。因此，本研究將進行VDR SNPs Cdx-2 （rs11568820， G>A）， FokI （rs2228570， T>C）， BsmI （rs1544410， G>A）， ApaI （rs7975232， C>A）的多態(tài)性分析，探討VDR基因多態(tài)性是否與原發(fā)性癲癇發(fā)生相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2020年3月至7月來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的原發(fā)性癲癇患者共71例，其中男性26例（36.6%），女性45例（63.3%），年齡中位數(shù)為29（23，44），診斷標準符合《2017年國際抗癲癇聯(lián)盟制訂的癲癇發(fā)作及癲癇分類診斷指南》[14]。同期收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康受試者97例作為對照組，其中男性35例（36.0%），女性62例（63.9%），年齡中位數(shù)為37（30，47）。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取以及純度和濃度測定 采集研究對象外周靜脈血2 ml，按照TIANamp Blood DNA Kit， DP348的說明書提取全血DNA，使用核酸蛋白分析儀對提取出的DNA 樣本進行純度和濃度鑒定， OD260值和OD280值在1.6～1.8之間為合格。

1.2.2 PCR反應(yīng)和SNP檢測 引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司采用Primer3.0設(shè)計。PCR擴增：15 μL 體系：DNA 1 μL，10*bμffer1.5 μL，25 mmol/L 的 MgCl21.5 μL，10 mmol/L 的 DNTP 0.3 μL，10 μmol/L 上下游引物 0.15 μL，5 μmol/μL 的Tap 酶 0.3 μL，加 H2O 補足至15 μL。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30s，55℃退火30 s;72℃延伸90 s;共35個循環(huán)，然后72℃延伸3min。 連接反應(yīng)：10 μL體系：取 3μL PCR產(chǎn)物，10* Taq DNA ligase buffer 0.15 μL，Taq DNA ligase（40U/ul）0.125 μL，探針（10p） 0.01 μL，加 H2O 補足至10 μL。連接條件：94°C 30s，56°C 3min;共30個循環(huán)。然后取取1μL延伸產(chǎn)物，加8ul上樣，95℃變性3min，立即冰水浴，上測序儀。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運用IBM SPSS （version 25.0; Armonk， NY， USA）進行統(tǒng)計分析。分類變量采用卡方檢驗?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg 平衡定律檢驗。采用Logisitc回歸模型校正年齡、性別等變量，所有統(tǒng)計分析采用雙側(cè)檢驗，P <0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 經(jīng)χ2在檢驗，病例組與對照組的性別構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.943），兩組性別構(gòu)成均衡。

2.2 遺傳平衡檢驗 病例組和對照組VDR 4個SNPs 的基因型其觀察值與期望值之間分布近似（P >0.05），表明兩組樣本來自遺傳平衡群體，具有群體代表性。

2.3 VDR基因多態(tài)性與原發(fā)性癲癇的易感性分析

所有樣本進行VDR基因測序，BsmI未檢測到AA基因型，經(jīng)χ2檢驗病例組和對照組VDR 四個SNPs基因型頻率無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）（見表1）;進一步采用多因素二元Logistic回歸，對受試者的年齡、性別進行校正，分析各位點等位基因模型、顯性模型和隱性模型與成人原發(fā)性癲癇的關(guān)系。結(jié)果顯示： Cdx-2 、FokI、BsmI及ApaI在病例組和對照組中其不同模型的分布均無統(tǒng)計學(xué)意義（見表2）。

3 討論

VD在神經(jīng)系統(tǒng)中有調(diào)控腦發(fā)育、神經(jīng)營養(yǎng)和保護、神經(jīng)遞質(zhì)合成和神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)等重要作用，是人體必需的神經(jīng)類固醇，參與大腦復(fù)雜的功能活動[7]。VD缺乏與癲癇具有相關(guān)性。人體內(nèi)VD水平降低會增加癲癇發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險;而癲癇人群中，內(nèi)在或外在因素會導(dǎo)致體內(nèi)VD水平下降[15]。本研究選取了其中4個SNPs進行研究。

FokI位于VDR基因的5’末端，其多態(tài)性與神經(jīng)保護相關(guān)，發(fā)生突變會增加帕金森病、阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險[17-18]。Jiang[19]等發(fā)現(xiàn) FokI AC基因型、ApaI AA基因型在顳葉癲癇組和對照組中的分布有統(tǒng)計學(xué)意義。Cdx-2位于VDR基因的5’啟動子區(qū)域，其多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素分泌受損相關(guān)[20]。戴[21]等發(fā)現(xiàn)Cdx-2的基因型在癲癇組和對照組的分布具有統(tǒng)計學(xué)意義，而等位基因的分布沒有統(tǒng)計學(xué)意義，AG/（AA+GG）有統(tǒng)計學(xué)意義，Cdx-2的多態(tài)性可能與癲癇的發(fā)生相關(guān)。BsmI位于VDR基因的3’端第8內(nèi)含子，其多態(tài)性研究主要集中在骨質(zhì)疏松、糖尿病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明VDR基因3’端BsmI、ApaI 均與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[22-23] 。

在本研究中所選取的VDR 4個SNPs在原發(fā)性癲癇和對照組中無論是基因型，還是各種基因模型中其分布均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，其中BsmI （rs1544410）突變純合子 AA基因型在所有研究對象中均未檢出，這與戴[21]等的研究結(jié)果一致，同樣Jiang[19]等的研究中AA基因型的頻率也極低，很可能是樣本量太小導(dǎo)致的。VDR基因多態(tài)性可受種族、地域等因素影響，本研究所有樣本來自云南地區(qū)的人群，因樣本量較少且遺傳背景不同，病例組和對照組統(tǒng)計可能存在偏倚，后續(xù)將擴大樣本量，控制混雜因素如日照、VD攝入、種族、地域等，對原發(fā)性癲癇發(fā)病機制做進一步研究，若可以進行不同地區(qū)多中心研究。

參考文獻：

[1]Hildebrand MS， Dahl HH， Damiano JA， et al. Recent advances in the molecular genetics of epilepsy[J]. J Med Genet. 2013， 50（5） ： 271-279.

[2]Thomas RH and Berkovic SF. The hidden genetics of epilepsy-a clinically important new paradigm. Nat Rev Neurol. 2014， 10（5） ： 283-292.

[3]張凱琳，江泓，李楠.遺傳性全面性癲癇的分子遺傳學(xué)研究進展[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2018，35（6）：908-911.

[4]吳懷寬，劉學(xué)伍，蘇永鑫，等. 癲癇遺傳學(xué)研究進展[J].精準醫(yī)學(xué)雜志，2019，34（2）：183-186，188.

[5] Turner TJ， Zourray C， Schorge S， Lignani G. Recent advances in gene therapy for neurodevelopmental disorders with epilepsy. J Neurochem. 2021 Apr;157（2）：229-262.

[6] Cui X， Gooch H， Petty A， et al.Vitamin D and the brain： Genomic and non-genomic actions. Mol Cell Endocrinol. 2017 Sep 15;453：131-143.

[7]陳良文.維生素D在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究進展[J].兒科藥學(xué)雜志， 2021， 27（2）：59-62

[8] DeLuca GC， Kimball SM， Kolasinski J， et al. Review： the role of vitamin D in nervous system health and disease. Neuropathol Appl Neurobiol. 2013 Aug;39（5）：458-84.

[9] Wang L， Song Y， Manson JE， et al. Circulating 25-hydroxy-vitamin D and risk of cardiovascular disease： a meta-analysis of prospective studies. Circ Cardiovasc Qual Outcomes. 2012 Nov;5（6）：819-29.

[10] Br?ndum-Jacobsen P， Nordestgaard BG， Schnohr P， et al. 25-Hydroxyvitamin D and symptomatic ischemic stroke：An original study and meta-analysis[J]. Ann Neurol，2013，73（1）：38-47.

[11] Kalueff AV， Minasyan A， Tuohimaa P. Anticonvulsant effects of 1， 25-dihydroxyvitamin D in chemically induced seizures in mice[J]. Brain Res Bull，2005，67（1 /2）：156-160.

[12]CUI X， PELEKANOS M， LIU P Y， et al. The vitamin D receptor in dopamine neurons; its presence in human substantia nigra and its ontogenesis in rat midbrain[J]. Neuroscience， 2013， 236（ 1） ： 77-87.

[13] Wang Y， Zhu J， DeLuca HF. Where is the vitamin D receptor？ Arch Biochem Biophys. 2012 Jul 1;523（1）：123-33.

[14] Salas-Puig J. A new proposal for the classification of epileptic seizures and epilepsies by the International League Against Epilepsy（ILAE）[J]. Rev Neurol，2017，52（9） ：513-514.

[15] Miratashi-Yazdi SA， Abbasi M， Miratashi Yazdi SM. Epilepsy and vitamin D：A comprehensive review of current knowledge[J]. Rev Neurosci，2017，28（2）：185-201.

[16] Offermann G， Pinto V， Kruse R. Antiepileptic drugs and vitamin D supplementation[J]. Epilepsia，1979，20（1）：3-15.

[17] Kumar R， Himani， Gupta N， et al. Unveiling molecular associations of polymorphic variants of VDR gene （FokI， BsmI and ApaI） in multiple myeloma patients of Indian population. J Steroid Biochem Mol Biol. 2020 May;199：105588..

[18]Emerah AA， E1-Shal AS. Role of vitamin D receptor e polymorphisms and serum 25-hydroxy vitamin d level in Egyptian female patients with systemic lupus erythematosus[J]. Mol Biol Rep，2013，40：6151-6162

[19]Jiang P， Zhu WY， He X， et al. Association between Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms with Childhood Temporal Lobe Epilepsy. Int J Environ Res Public Health. 2015 Oct 30;12（11）：13913-22.

[20]Sentinelli F， Bertoccini L， Barchetta I， et al. The vitamin D receptor （VDR） gene rs11568820 variant is associated with type 2 diabetes and impaired insulin secretion in Italian adult subjects， and associates with increased cardio-metabolic risk in children. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2016 May;26（5）：407-13.

[21]王丹， 張亞男， 馬尚寅，等. 維生素D受體基因多態(tài)性與特發(fā)性癲癇的相關(guān)性[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2020， 40（10）：4.

[22] Kuningas M， Mooijaart SP， Jolles J， et al. VDR gene variants associate with cognitive function and depressive symptoms in old age. Neurobiol Aging. 2009 Mar;30（3）：466-73.

[23] Petersen MS， Bech S， Christiansen DH， et al. The role of vitamin D levels and vitamin D receptor polymorphism on Parkinson's disease in the Faroe Islands. Neurosci Lett. 2014 Feb 21;561：74-9.

[基金項目] 云南省教育廳科學(xué)研究基金教師類項目（編號：2018JS197）

[作者簡介]朱文葉，主管藥師，研究方向：臨床藥理學(xué)，郵箱：ZWYkyfyy@163.com

[通訊作者]李敏，男，醫(yī)師，研究方向：哮喘與基因組學(xué)，郵箱：869116714@qq.com