優(yōu)質(zhì)肉雞硫胺素含量以及TPK1基因的多態(tài)性分析

王海等

摘要：為研究大恒優(yōu)質(zhì)肉雞硫胺素沉積規(guī)律及大恒肉雞不同家系間硫胺素的差異，選取大恒優(yōu)質(zhì)肉雞的4個(gè)品系（S08、S07×S01、D2、D1）為試驗(yàn)材料，采用高效液相色譜法對(duì)硫胺素含量進(jìn)行測定，并對(duì)其相關(guān)基因TPK1進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示：10周齡時(shí)，S08品系胸肌中硫胺素含量極顯著高于品系D1、D2（P<0.01），4個(gè)品系中公雞胸肌中的硫胺素含量均高于母雞，差異不明顯；10周齡時(shí)，公雞、母雞中腿肌的硫胺素含量極顯著高于胸?。≒<0.01），公雞中的腿肌、胸肌硫胺素含量均分別高于母雞的腿肌、胸肌，但都差異不明顯。對(duì)大恒肉雞5個(gè)品系（S07×S05、S07、S08、S07×01、S08×01）TPK1基因的所有外顯子及部分3′非編碼區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性位點(diǎn)的檢測，在3′非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)G878A單堿基突變，該SNP位點(diǎn)對(duì)腹脂質(zhì)量具有顯著影響（P<0.05），該基因座上的基因型NN個(gè)體的腹脂質(zhì)量顯著高于基因型MN個(gè)體的腹脂質(zhì)量，但與大恒優(yōu)質(zhì)肉雞2個(gè)品系雞肉中硫胺素含量差異不顯著。

關(guān)鍵詞：優(yōu)質(zhì)肉雞；硫胺素；TPK1基因；基因多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S831.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0237-03

硫胺素（Thiamine）即維生素B1，不僅是維持機(jī)體代謝的重要物質(zhì)，而且是肉產(chǎn)品產(chǎn)生芳香物質(zhì)的關(guān)鍵前體物質(zhì)。熱降解硫胺素可以產(chǎn)生許多含硫化合物，包括硫醇、硫化物、二硫化合物等芳香化合物[1-2]，其中2-甲基-3-巰基呋喃、2/3-巰基-3/2-戊酮是重要的揮發(fā)性化合物，5-羥基-3-巰基-2-戊酮不僅是硫胺素降解過程中的重要中間產(chǎn)物，而且是一類芳香化合物。因此，硫胺素及其衍生物的含量已經(jīng)成為了肉食品品質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究以4個(gè)優(yōu)質(zhì)肉雞品系為樣本，研究硫胺素的含量差異，同時(shí)對(duì)硫胺素合成代謝關(guān)鍵酶中硫胺焦磷酸激酶（TPK1）基因進(jìn)行多態(tài)性分析[3]，以期為優(yōu)質(zhì)肉雞的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)材料為四川大恒家禽有限公司培育的S08、S07×S01、D2、D1、S07×05、S07、S08×S01 共7個(gè)品系總，試驗(yàn)雞有專人飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件及營養(yǎng)水平一致，統(tǒng)一在70日齡屠宰，屠宰前翅下靜脈采血保存于真空采血管中，4 ℃保存用于DNA的提取。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1肌肉中硫胺素含量的測定采用高效液相色譜法（熒光檢測）。準(zhǔn)確稱取4～6 g肉樣，使用電動(dòng)勻漿器勻質(zhì)后置于250mL三角瓶中，加入50 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液混勻，于高壓滅菌鍋中121 ℃處理30 min，室溫冷卻。用2 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)水解液使pH值為4.0～4.5，加入高峰氏淀粉酶，置于水浴鍋中45～50 ℃酶解3 h，冷卻后全部移至100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，混勻后用濾紙過濾，將濾液放置于4 ℃冰箱中保存。吸取5 mL試樣加入到50 mL EP管中，再加入1.5 g氯化鈉、3 mL氧化劑混勻，然后加入10 mL異丁醇萃取，靜置分層后取上清液過0.45 μm濾膜，即可上樣檢測。

高效液相色譜儀為安捷倫高效液相色譜儀（配有1200熒光檢測器）。流動(dòng)相：乙酸鈉（0.05 mol/L，pH值4.5） ∶甲醇（35% ∶65%）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：激發(fā)波長365 nm；發(fā)射波長：435 nm；進(jìn)樣量：15 μL。

1.2.2雞基因組的提取采用Axygen公司AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒來提取雞血樣中的基因組DNA。獲得的DNA樣品分為2份，1份用于試驗(yàn)，放置于4 ℃條件；另一份放在-70 ℃中長期保存，用以單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

10周齡大恒優(yōu)質(zhì)肉雞肌肉中不同品系間硫胺素含量的差異顯著性比較采用SPSS 17.0 軟件包中廣義線性模型（general linear model，GLM）進(jìn)行最小顯著差異（least significant difference，LSD ）分析，采用 Correlate 程序進(jìn)行體質(zhì)量與硫胺素含量的相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1硫胺素含量的變化

2.1.110周齡肉雞不同品系肌肉中硫胺素含量10周齡大恒優(yōu)質(zhì)肉雞S08、S07×S01、D2、D1等4個(gè)品系的硫胺素含量如表1所示。可以看出，在母雞中S08品系胸肌中的硫胺素含量最高，D1品系胸肌中的硫胺素含量最低；S08、S07×S01品系間差異不顯著，但與D2、D1差異極顯著（P<001），D2、D1品系間差異不顯著。在公雞中S08、S07×S01品系間差異不顯著，但分別與D2、D1差異極顯著（P<0.01），D2、D1品系間差異不顯著。在4個(gè)品系中所有公雞胸肌中的硫胺素與

2.1.210周齡不同組織及性別的硫胺素含量在10周齡時(shí)，公雞中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，并且達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；母雞中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，也達(dá)到了極顯著水平；公雞中的胸肌、腿肌的硫胺素含量分別高于母雞（表2）。

表2不同組織及性別硫胺素的含量

組織公雞母雞硫胺素含量

（mg/kg）數(shù)量

（羽）硫胺素含量

（mg/kg）數(shù)量

（羽）胸肌1.021±0.453B270.701±0.217B17腿肌1.483±0.267A291.231±0.346A15注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

2.2TPK1基因多態(tài)性分析

2.2.1樣品DNA的提取及引物的設(shè)計(jì)合成引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)（表3），設(shè)計(jì)的結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST對(duì)引物進(jìn)行在線比對(duì)驗(yàn)證，鑒定合格后由上海Invitrogen公司合成，所有引物均為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純度。表3TPK1基因所有外顯子及部分非編碼區(qū)的擴(kuò)增引物

本研究總共設(shè)計(jì)了9對(duì)引物，對(duì)TPK1基因所有外顯子及部分非編碼區(qū)進(jìn)行了掃描，以大恒肉雞5個(gè)品系（S07×SO5、S07、S08、S07×01、S08×01）為研究材料。結(jié)果顯示，所有9對(duì)引物的PCR擴(kuò)增效果都很好，目的片段與所設(shè)計(jì)的片段大小一致，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，都可以用于SSCP研究。PCR-SSCP研究結(jié)果顯示，TPK13′UTR引物在大恒肉雞5個(gè)品系內(nèi)存在多態(tài)性，3′UTR引物所擴(kuò)增的片段存在3種基因型，分別定義為MN、MM、NN（圖1）。

2.2.2序列分析結(jié)果取MN、NN、MM 3種基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測序，結(jié)果顯示MM基因型與數(shù)據(jù)庫Ensembl

（登錄號(hào)：ENSGALT00000020200）中的序列一致，將其定義為野生型。MM型與NN型相比存在1個(gè)G878A單堿基突變，將其定義為突變型。測序結(jié)果如圖2所示。

2.2.35個(gè)品系TPK1不同基因型差異檢驗(yàn)根據(jù)PCR-SSCP的檢測結(jié)果，對(duì)TPK1各種基因型在5個(gè)品系中的分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)各個(gè)群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡。由表4可知，大恒肉雞5個(gè)品系都符合Hardy-Weinberg 平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有5個(gè)品系都以等位基因M為主。對(duì)5個(gè)品系的基因雜合度及多態(tài)信息含量分析顯示，5個(gè)品系多態(tài)性均屬于高度多態(tài)。

3結(jié)論與討論

3.1硫胺素含量分析

對(duì)大恒優(yōu)質(zhì)肉雞S08、S07×S01、D2、D1 4個(gè)品系的硫胺

素的含量進(jìn)行檢測及比較結(jié)果顯示，在10周齡時(shí)S08品系公雞、母雞胸肌中的硫胺素含量都是最高的，D1品系中硫胺素的含量較低，4個(gè)品系中公雞胸肌中的硫胺素含量都高于母雞，這與陳國宏等研究的結(jié)果一致[4-6]。在相同的飼養(yǎng)條件及營養(yǎng)水平下，大恒優(yōu)質(zhì)肉雞腿肌中的硫胺素含量都比胸肌高，這與陳國宏等的研究結(jié)果[4]基本一致。在大恒優(yōu)質(zhì)肉雞中各個(gè)品系的胸肌、腿肌的平均硫胺素含量分別為0.816、1.357 mg/kg，比陳國宏等所研究的地方雞在12周齡時(shí)的平均硫胺素含量0.44mg/kg還要高[4]，這可能是檢測方法不一樣或飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)水平不同導(dǎo)致的，但也表明了大恒優(yōu)質(zhì)肉雞肌肉中的硫胺素含量還是相對(duì)較高的。

3.2TPK1基因多態(tài)性分析

本研究對(duì)大恒雞5個(gè)品系TPK1基因的所有外顯子及部分3′非編碼區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性位點(diǎn)的檢測，在3′非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)G878A單堿基突變，對(duì)TPK1各種基因型在5個(gè)品系中的分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及SNP位點(diǎn)基因型、基因頻率研究。結(jié)果顯示，大恒雞5個(gè)品系都符合Hardy-Weinberg 平衡，表明這5個(gè)品系在該位點(diǎn)受到的選擇作用比較微弱，或是在經(jīng)過選擇后又重新達(dá)到了平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有的5個(gè)品系都以等位基因M為主。在所有的5個(gè)品系中NN基因型只占總基因型的16%，這可能是由于群體數(shù)量相對(duì)來說還比較少。

綜上所述可見大恒優(yōu)質(zhì)肉雞不同品系肌肉中硫胺素在肌肉中的沉積規(guī)律及大恒雞不同家系間硫胺素的差異，TPK1 3′UTR發(fā)現(xiàn)了1個(gè)G878A單堿基突變，但與大恒優(yōu)質(zhì)肉雞雞肉中硫胺素含量差異不顯著。這些結(jié)果對(duì)于今后從育種角度開發(fā)利用地方優(yōu)質(zhì)雞種資源有重要意義。

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