高壓結(jié)合熱處理對豬肉中硫胺素含量的影響

李婷婷,黃業(yè)傳,雷裕田

(西南科技大學 生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

?

高壓結(jié)合熱處理對豬肉中硫胺素含量的影響

李婷婷,黃業(yè)傳*,雷裕田

(西南科技大學 生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

為研究不同處理壓力(200～600 MPa)、溫度(20～60 ℃)和時間(10～20 min)對豬肉中硫胺素含量的影響,選擇豬背最長肌為原料,在單因素實驗基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面法分析。結(jié)果表明:在壓力、溫度、時間三種因素中,壓力和溫度對硫胺素含量的影響極顯著(p<0.01),而時間對其影響顯著(p<0.05),壓力和溫度的交互作用對硫胺素含量也有極顯著影響(p<0.01)。當處理溫度在20～47 ℃左右時,硫胺素含量隨壓力的升高逐漸降低;溫度高于48 ℃后,硫胺素含量隨壓力的升高先增加后減少,存在壓力臨界值;當壓力一定時,硫胺素含量隨溫度的升高先增大后減小,存在溫度臨界值,且臨界溫度隨壓力的升高呈線性上升。在高壓處理過程中,中溫結(jié)合中壓處理比單獨的高壓低溫或低壓高溫處理更有利于硫胺素的保留。

壓力,熱處理,豬肉,硫胺素

超高壓技術(shù)是現(xiàn)代食品工業(yè)中的一項高新技術(shù)[1]。與傳統(tǒng)熱處理相比,高壓處理對食品營養(yǎng)物質(zhì)和感官品質(zhì)破壞更小,并能有效鈍化、滅活微生物,延長貨架期[2-4]。目前,高壓處理肉類的研究主要集中在改善肉的嫩度和延長貯藏期兩個方面,而對風味影響研究很少[5]。在肉類研究時,大都是研究高壓在肉類中的應(yīng)用,但一些耐壓微生物需要高壓結(jié)合熱處理才會失活[6-7]。所以高壓結(jié)合熱處理是現(xiàn)在肉產(chǎn)品加工業(yè)中高壓應(yīng)用的趨勢,但相關(guān)的理論研究還很少。

硫胺素作為一種風味前體物質(zhì),經(jīng)過熱降解產(chǎn)生多種風味化合物,對風味的形成具有重要的作用[8]。現(xiàn)在肉制品加工中對硫胺素的研究主要集中在烹飪方式對其含量的影響、硫胺素的添加與否對肉類風味形成的影響以及肉制品個體間硫胺素含量差異的對比研究[9-10]。關(guān)于高壓對食品中硫胺素影響的報道比較少,在詹耀等的研究中發(fā)現(xiàn)500 MPa,20 min以后硫胺素含量顯著下降[11];Kim等人認為加壓時間對牛乳中硫胺素的影響并不顯著[12]。而關(guān)于溫度對肉類中硫胺素的影響以及其熱降解過程的研究已經(jīng)很細致了,但是將高壓與熱處理結(jié)合研究肉類中硫胺素的報道幾乎沒有。所以研究高壓結(jié)合熱處理對豬肉中硫胺素的影響具有重要意義。

本實驗以豬背最長肌中硫胺素含量為測定指標,研究不同處理壓力(200～600 MPa)結(jié)合不同溫度(20～60 ℃)處理10～20 min對豬肉中硫胺素含量的影響,為研究高壓結(jié)合熱處理對豬肉風味影響以及高壓在肉類產(chǎn)品加工中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉 四川省綿陽市青義鎮(zhèn)青科市場早上宰殺的新鮮豬肉(熱鮮肉),取同一頭豬最長肌約3 kg,快速運回實驗室后,去掉表面可見脂肪、筋膜及結(jié)締組織,切成小塊,混合均勻后按每袋8 g左右分裝于透明聚乙烯真空封裝袋中進行抽真空封裝,封裝后的樣品立即于-18 ℃條件下冷凍備用;鹽酸、冰乙酸、異丁醇、氯化鈉、乙酸鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、乙醇 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;高峰淀粉酶 生化試劑,Solarbio。

HPP.L2-800/1型食品高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司;DZ400-DZ(2L)型真空封裝機 四川成都瑞昌儀器制造有限公司;HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇常州澳華儀器有限公司;LS-55熒光分光光度計 美國鉑金埃爾默公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高壓處理 根據(jù)超高壓裝置廠家說明書,超高壓設(shè)備的工作參數(shù)條件:最高壓力可達800 MPa,升壓速度為50 MPa/s左右,卸壓速度為100 MPa/s左右,傳壓介質(zhì)為葵二酸二辛酯。取已真空分裝好的樣品在4 ℃條件下解凍24 h后,在設(shè)定的壓力、溫度和時間下進行處理,每個處理重復三次。

1.2.2 硫胺素的測定方法 參照GB/T 9695.27-2008《肉與肉制品 維生素B1含量的測定》[13]采用熒光法進行測定。稱取6 g試樣于錐形瓶中,加入50 mL鹽酸溶液于沸水浴中水解,然后待水解液冷卻后調(diào)節(jié)pH,加入5 mL高峰淀粉酶溶液酶解3 h,酶解后調(diào)節(jié)pH并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用水定容,過濾取適量濾液進行氧化,取上層液待測。標準液的處理與樣品處理步驟一致。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 根據(jù)資料和大量預實驗結(jié)果以及實驗室設(shè)備能達到的實驗條件對單因素實驗實驗水平進行設(shè)計,研究壓力、溫度和保壓時間(保壓時間是指壓力達到設(shè)定值后保持的時間)對硫胺素含量的影響。

1.2.3.1 壓力對硫胺素含量影響的研究 固定溫度30 ℃,保壓時間10 min,將樣品分別在200、300、400、500、600、700 MPa 的條件下處理后測定硫胺素含量。

1.2.3.2 溫度對硫胺素含量影響的研究 固定壓力300 MPa,加壓時間10 min,將樣品分別在20、30、40、50、60 ℃的條件下處理后測定硫胺素含量。

1.2.3.3 時間對硫胺素含量影響的研究 固定壓力300 MPa,溫度30 ℃,將樣品分別在 0、5、10、15、20、25 min的條件下處理后測定硫胺素含量。

1.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計 本實驗中視壓力200 MPa為低壓,400 MPa為中壓,600 MPa為高壓,溫度20 ℃為低溫(常溫),40 ℃為中溫,60 ℃為高溫,在單因素實驗的基礎(chǔ)上運用Design-Expert 8.0中的Box-Behnken 實驗設(shè)計原理[14],以硫胺素含量為響應(yīng)值,壓力、溫度、時間為自變量,進行三因素三水平響應(yīng)面實驗設(shè)計,設(shè)計得到17組實驗,其中包括5個0水平點。實驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

Table 1 Factors and levels of response surface method experiment

水平實驗因素A壓力(MPa)B溫度(℃)C保壓時間(min)-120020100400401516006020

1.3 數(shù)據(jù)處理

硫胺素含量測定結(jié)果利用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0 軟件(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)計算其平均值和標準誤及顯著性分析,溫度臨界值采用Microsoft Excel 2013規(guī)劃求解計算,響應(yīng)面實驗設(shè)計采用Design-Expert.8.05軟件,結(jié)果采用最小二乘法進行二次多項式全回歸統(tǒng)計分析,其基本模型如下:

其中:β0,βi,βii,βij是回歸系數(shù);Xi,Xj是不同自變量;Y是響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對硫胺素含量的影響

由圖1可以看出在30 ℃、10 min處理條件下,隨著處理壓力的增加,硫胺素含量呈逐漸降低的趨勢。壓力在200 MPa時,硫胺素的含量最高,當壓力達到700 MPa時,硫胺素的含量相對較低,與200 MPa時相比,其只保留了48.98%。壓力在200～400 MPa范圍內(nèi)時,硫胺素含量變化不顯著,而當壓力在400～700 MPa范圍內(nèi)時,硫胺素含量隨壓力的增加顯著(p<0.05)降低。文獻中有關(guān)高壓對食品風味方面的研究基本是對感官品質(zhì)和風味成分的研究,而對風味前體物質(zhì)硫胺素的深入研究很少。如姜雪等人研究發(fā)現(xiàn)對牛乳加壓到300 MPa時,硫胺素含量就已損失了約50%,但當壓力不超過300 MPa時,壓力對硫胺素的影響很小[15];而在Hugas的報道中,高壓力處理只會破壞大分子物質(zhì),對B族維生素這類小分子物質(zhì)影響不大[16]。但在實驗中高壓力會對硫胺素產(chǎn)生影響,這可能是因為在較高的壓力下結(jié)合一定溫度促使豬肉組織結(jié)構(gòu)和細胞膜通透性發(fā)生改變,使硫胺素通過細胞通道隨著水分一起流失;也可能是在高壓處理過程中被VB1酶或肌紅蛋白等非酶催化劑降解[17]。

圖1 壓力對硫胺素含量的影響Fig.1 Effect of pressure on the content of thiamine注：標注不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2、圖3同。

2.2 溫度對硫胺素含量的影響

圖2是樣品在固定壓力300 MPa、時間10 min,不同溫度處理條件下硫胺素含量的變化。由圖2可以看出,硫胺素的含量隨著溫度的升高,呈逐漸降低的趨勢,溫度越低,硫胺素的相對含量就越高,當溫度從20 ℃升高至60 ℃時,硫胺素含量具有顯著性(p<0.05)變化,而60 ℃時硫胺素的含量相對20 ℃時保留了57.69%。硫胺素是一種熱不穩(wěn)定維生素,特別是在堿性條件下易被氧化和熱降解[18]。硫胺素熱降解的溫度在121 ℃左右,在中低溫條件下,硫胺素本身很難發(fā)生熱降解[19]。而在方亮[20]的研究中,高壓處理并不會對水溶性維生素產(chǎn)生明顯的影響,但是結(jié)合溫度時水溶性維生素會隨著溫度和壓力的升高發(fā)生較大變化?？墒乾F(xiàn)在關(guān)于高壓結(jié)合熱處理對硫胺素含量影響的報道幾乎沒有,因此在一定壓力條件下,溫度對硫胺素影響變化的本質(zhì)還有待進一步研究。

圖2 溫度對硫胺素含量的影響Fig.2 Effect of temperature on the content of thiamine

2.3 時間對硫胺素含量的影響

圖3是樣品在固定的壓力300 MPa、溫度30 ℃,不同時間處理條件下硫胺素含量的變化。由圖3可以看出在0～10 min內(nèi),硫胺素含量先降低后增大,但是變化并不顯著,而當時間從10 min增加到25 min時,硫胺素含量顯著(p<0.05)降低,此時硫胺素的含量相對0 min時保留了70.00%。這可能是因為隨著加壓時間的延長,肌肉組織發(fā)生變化,細胞膜的通透性增大,具有水溶性的硫胺素隨著水分一起流失,也可能是因為隨著時間的增加,硫胺素在細胞內(nèi)逐漸被氧化或降解。該結(jié)果與詹耀、Nisha等的結(jié)論類似[10,19],在一定壓力或溫度下,硫胺素含量會隨著處理時間的延長而降低。而Kim等[12]則認為加壓時間對水溶性維生素的影響不顯著。

圖3 時間對硫胺素含量的影響Fig.3 Effect of time on the content of thiamine

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面方案及響應(yīng)值

Table 2 Program of RSM and response value

實驗號A壓力(MPa)B溫度(℃)C保壓時間(min)硫胺素含量(mg/100g)14002020038±00224006010032±00432004020046±00144004015037±00354004015042±00564004015038±00072004010048±00784002010040±00296006015023±005106004010035±001114006020028±006122006015031±001132002015051±008146004020026±001154004015036±001164004015039±002176002015024±003

注:表中硫胺素含量均表示為平均值±標準誤,是3次重復測定的結(jié)果。

利用Design-Expert8.0軟件,對表2中的硫胺素數(shù)據(jù)進行分析,可得到硫胺素含量(Y)對壓力、溫度以及保壓時間的二次多項回歸方程,其表達式如下:

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果

Table 3 ANOVA results for response surface quadratic model

方差來源平方和自由度均方F值p值模型010900113093<00001??A(壓力)00581005815592<00001??B(溫度)001910019512900002??C(時間)3612E-00313612E-00397400168?AB9025E-00319025E-003243400017??AC1225E-00311225E-00333001119BC1000E-00411000E-00402706195A23800E-00413800E-00410303450B2001110011307100009??C27116E-00417116E-00419202085殘差2595E-00373707E-004失擬項4750E-00431583E-00403008257凈誤差2120E-00345300E-004總離差01116R2=09755R2Adj=09439信噪比=18115

注:“**”表示差異極顯著(p<0.01),“*”表示差異顯著(p<0.05)。

表4 不同壓力下溫度對硫胺素影響的臨界值

Table 4 Temperature threshold of the impact of thiamine under the conditions of different pressure

壓力(MPa)回歸方程溫度臨界值(℃)臨界點硫胺素含量(mg/100g)200Y=-130E-004B2+5587E-004B+4439E-0022099050300Y=-130E-004B2+6775E-004B+3610E-0022555045400Y=-130E-004B2+7962E-004B+2734E-0023012040500Y=-130E-004B2+9150E-004B+1810E-0023469034600Y=-130E-004B2+001B+84E-0023926029

注:上面所有回歸方程中的字母B表示溫度變量,Y表示硫胺素含量。Y=+0.6412-4.4750E-004A+3.9625E-003B-0.01085C+1.1875E-005AB-1.7500E-005AC-5.0000E-005BC-2.3750E-007A2-1.3000E-004B2+5.2000E-004C2

其中:A為壓力(MPa);B為溫度(℃);C為時間(min)。

回歸模型方程的方差分析結(jié)果見表3。

2.4.2 壓力和溫度對硫胺素含量的交互作用 響應(yīng)面實驗中評價和分析兩種實驗因素的交互作用是根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)的3D響應(yīng)面圖和二維等高線圖,由圖形的形狀反映出兩實驗因素交互作用的強弱[20]。

圖4顯示了固定加壓時間15 min時,壓力和溫度對硫胺素含量的交互影響。由圖4可看出壓力和溫度的交互作用對硫胺素含量的影響比較明顯。當處理溫度在20～47 ℃左右時,硫胺素含量隨壓力的升高逐漸降低;當溫度達到48 ℃后,硫胺素含量隨壓力的升高先增加后減少,因此在48～60 ℃間存在壓力臨界值,且在這個范圍內(nèi),壓力臨界值隨溫度的升高逐漸增大。當溫度為48 ℃時,臨界壓力約為202 MPa;當溫度升高54 ℃時,臨界壓力在352 MPa左右;當溫度達到60 ℃時,臨界壓力約為502 MPa。這種變化可能是因為在48 ℃以前,硫胺素含量主要受壓力影響,隨壓力的增加其降解也越多;在48 ℃以后,溫度和壓力同時顯著影響硫胺素含量,一方面,溫壓聯(lián)合作用下肉中水份流失會增加硫胺素的相對含量,另一方面,硫胺素酶也受到溫度和壓力的影響從而影響到硫胺素含量,因此其含量的變化較復雜,先隨壓力的增加而增加,到臨界點后又逐漸降低。而當處理壓力不變時,硫胺素含量隨溫度的升高先增大后減小,因此存在溫度臨界值。當處理壓力為200 MPa時,溫度臨界值約為21 ℃,臨界點硫胺素含量約為0.50 mg/100 g;當處理壓力升高到為300 MPa時,溫度臨界值大約在26 ℃,此時硫胺素含量約0.45 mg/100 g;直到壓力繼續(xù)升高到600 MPa時,臨界溫度升高到39 ℃左右,硫胺素降低到0.29 mg/100 g。這說明升高壓力增大了使硫胺素變化的臨界溫度,而在不同臨界溫度時硫胺素含量隨溫度的升高而減小。由回歸方程計算得關(guān)于不同壓力下溫度對硫胺素影響的臨界值結(jié)果如表4。

將表4中的溫度臨界值對壓力進行線性回歸分析,可看出臨界溫度隨處理壓力的升高呈線性上升趨勢(y=45.68×10-3x+11.85,R2=1.00)。同時將臨界硫胺素含量對臨界溫度值進行線性回歸分析,結(jié)果(y=-(1.16×10-3)x+0.75,R2=1.00)表明硫胺素含量隨臨界溫度升高呈線性下降趨勢。

由圖4也可看出硫胺素含量隨壓力和溫度的升高呈總體下降趨勢,而中溫中壓處理后硫胺素的含量比低溫高壓和高溫低壓處理后的含量高。如當處理條件為400 MPa,40 ℃時,硫胺素含量為0.38 mg/100 g;當處理條件為200 MPa,60 ℃和600 MPa,20 ℃時硫胺素含量分別約為0.34 mg/100 g和0.24 mg/100 g,說明低溫高壓以及高溫低壓處理對硫胺素的破壞更大。因此在高壓處理過程中,中溫結(jié)合中壓處理比單獨的高壓低溫或低壓高溫處理更有利于硫胺素的保留。

圖4 壓力和溫度對硫胺素含量交互影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of the interactive effect of pressure and temperature on the content of thiamine

3 結(jié)論

在高壓結(jié)合熱處理對豬肉處理過程中,壓力是影響硫胺素含量的最顯著因素,其次是溫度,而處理時間的影響最小。壓力和溫度的交互作用對硫胺素含量有顯著影響,處理溫度為20～47 ℃左右時,硫胺素含量隨壓力的升高逐漸降低;48 ℃后,硫胺素含量隨壓力的升高先增加后減少,存在壓力臨界值,且臨界值隨溫度的升高逐漸增大;壓力一定時,硫胺素含量隨溫度的升高先增大后減小,存在溫度臨界值,且臨界溫度隨壓力的升高呈線性上升趨勢;同時升高壓力和溫度時,硫胺素含量呈總體下降趨勢。而且高壓處理過程中,中溫結(jié)合中壓處理比單獨的高壓低溫或低壓高溫處理更有利于硫胺素的保留。

[1]孫斌,錢海剛.超高壓技術(shù)在食品中的應(yīng)用[J].科技資訊,2008(3):20-21，23.

[2]J C Cheftel,J Culioli .Effects of high pressure on meat:A review[J].Meat Science,1997,46(3):211-233.

[3]Ma Hanjun,D.A. Ledward.High pressure processing of fresh meat-Is it worth it?[J].Meat Science,2013,95(4):897-903.

[4]殷紅,葛長榮.食品冷殺菌技術(shù)[J].保鮮與加工,2005,5(1):40-41.

[5]張海峰,白杰,劉姍姍,等.超高壓在肉類工業(yè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科學研究,2009,30(2):61-64.

[6]Y Yagiz,H G Kristinsson .Effect of high pressure processing and cooking treatment on the quality of Atlantic salmon[J].Food Chemistry,2009,116(4):828-835.

[7]陳銀基.不同影響因素條件下牛肉脂肪酸組成變化研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學,2007.

[8]M.Güntert,H-J Bertram,R Emberger,et al.New aspects of the thermal generation of flavour compounds from thiamin[M]//In P Schreier & P Winterhalter(Eds.).Progress in flavour precursor studies.Carol Stream:Allured Publishing Corporation,1993:361-378.

[9]S.Al-Khalifa Abdulrahman,A Dawood Abdelbary .Effects of cooking methods on thiamin and riboflavin contents of chicken meat[J].Food Science,1992(48):69-74.

[10]Caroline Thomas,Frédéric Mercier,Pascal Tournayre,et al. Effect of added thiamine on the key odorant compounds and aroma of cooked ham[J].Food Chemistry,2015,173(15):790-795.

[11]詹耀.超高壓處理對糙米物性品質(zhì)的影響研究[D].杭州:浙江大學,2014.

[12]K M Considine,A L Kelly,F G F itzgerald,et al.High pressure processing-effects on microbial food safety and food quality[J].FEMS Microbiology Letters,2008,281(1):1-9.

[13]GB/T 9695.27-2008,《肉與肉制品 維生素B1含量測定》[S].2009.

[14]李莉,張賽,何強,等.響應(yīng)面法在實驗設(shè)計與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實驗室研究與探索,2015,34(8):41-54.

[15]姜雪,于鵬,肖楊,等.超高壓處理對生鮮牛乳品質(zhì)的影響[J].食品科技,2015,40(4):99-102.

[16]M Hugas,M Garriga,J M Monfort.New mild technologies in meat processing:high pressure as a model technology[J].Meat Science,2002,62:359-371.

[17]覃益民.生物化學[M].北京：化學工業(yè)出版社,2010.

[18]N Gerber,M R L Scheeder,C Wenk.The influence of cooking and fat trimming on the actual nutrient intake from meat[J].Meat Science,2009,81(1):148-154.

[19]P Nisha Rekha,S Singhal,et al.A study on degradation kinetics of thiamine in red gram splits[J].Food Chemistry,2004,85(4):591-598.

[20]方亮.超高壓處理對獼猴桃果汁殺菌鈍酶效果和品質(zhì)的影響[D].無錫:江南大學,2008.

[21]閆忠心,靳義超,王倩.響應(yīng)面法優(yōu)化自然風干牦牛肉風味研究[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2015,45(5):7-10.

Effect of high pressure combined with heat treatment on thiamine content in pork

LI Ting-ting,HUANG Ye-chuan*,LEI Yu-tian

(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

Toinvestigatetheeffectofhigh-pressureprocessingonthiaminecontentinpork,thelongsissimusmusclesweretreatedwithdifferentconditions(200～600MPa,20～60 ℃and10～20min),thenaccordingtotheBox-Behnkenexperimentdesign,thethreefactorsandthreelevelsofresponsesurfacemethodwasappliedonthebasisofthesinglefactorexperiment.Theresultsshowedthataboutthethreefactorsthepressureandthetemperaturehadextremelysignificanteffect(p<0.01)onthethiaminecontent,whilethetimehadsignificanteffect(p<0.05).Theinteractionofthepressureandtemperaturealsohadextremelysignificanteffect(p<0.01)onthethiaminecontent.Thethiaminecontentwasdecreasedwithincreasingpressurewhentheprocessingtemperaturewasbetween20 ℃and47 ℃.Whiletemperaturereached48 ℃,thiaminecontentwasfirstincreasedandthendecreasedwiththeincreasingpressure,andtherewerecriticalpressurevalues.Whenthepressurewascertain,withtheincreasingtemperaturethethiaminecontentwasfirstincreasedandthendecreased,andatthesametimeithadcriticaltemperaturevaluesthatlinearlyincreasedwithincreasingpressure.Mediumtemperaturewithmediumpressuretreatmentwasmoreadvantageoustothethiamineretentionthanlowtemperaturewithhighpressureorlowpressurewithhightemperaturetreatment.

highpressure;heattreatment;pork;thiamine

2016-03-16

李婷婷(1990-)，女，在讀碩士，研究方向:食品化學工程，E-mail：1252585610@qq.com。

*通訊作者:黃業(yè)傳(1975-)，男，博士，副教授，研究方向:肉制品加工與食品酶技術(shù),E-mail：hyc2005@sina.com。

國家自然科學基金項目(31271892)；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心科研創(chuàng)新團隊建設(shè)基金項目(14tdgc03 )。

TS201.1

A

1002-0306(2016)19-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.002