外周血單個核細胞Toll樣受體4基因檢測聯合降鈣素原對膿毒癥的診斷價值研究

胡元慧，湯冬玲，張平安

膿毒癥是一種廣義上由感染引起的全身炎癥反應綜合征，常伴發(fā)器官衰竭，是全世界危重癥患者主要死因之一［1-2］。膿毒癥發(fā)病機制復雜，涉及炎性因子、氧化損傷、線粒體功能障礙、凋亡等其他因素［3］。目前對于膿毒癥的診斷有血培養(yǎng)、C反應蛋白、降鈣素原（procalcitonin，PCT）等指標，但無法在單一指標下及時準確診斷［4］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種免疫識別受體，是一種很有前途的新型生物標志物［5］。膿毒癥的常見感染菌是革蘭陰性菌，其細胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）與TLR4結合，激發(fā)機體免疫炎性反應，導致多種促炎遞質和細胞因子的分泌，如白介素（IL）-1β和IL-6，造成細胞因子風暴，導致機體損傷［6］。TLR4 mRNA水平在膿毒癥初期即上升，其水平被認為與炎癥程度相關［7-8］。PCT是一種由116個氨基酸組成的多肽，是降鈣素前體，可作為膿毒癥級聯反應的一部分，水平迅速升高，并在膿毒癥發(fā)病12～48 h后達到峰值，具有較高的靈敏度和特異度［9-11］。目前關于TLR4 mRNA聯合血清PCT對膿毒癥診斷價值的相關研究較少，本研究旨在探討外周血單個核細胞TLR4 mRNA聯合血清PCT對膿毒癥的診斷價值，并分析TLR4 mRNA在不同膿毒癥嚴重程度分級和感染不同病原時的水平變化，為臨床診斷提供理論依據，以達到對潛在膿毒癥患者進行及早發(fā)現和干預的目的。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月至2021年11月武漢大學人民醫(yī)院收治的110例膿毒癥患者為膿毒癥組，同期113例感染性疾病患者為非膿毒癥組，95例體檢健康者為對照組。納入標準：（1）膿毒癥組納入符合2016年《第三版膿毒癥與感染性休克定義國際共識》［1］中膿毒癥診斷標準的患者，即入院時臨床診斷存在感染且序貫器官衰竭評分（SOFA）≥2分或快速SOFA（qSOFA）≥2分。（2）非膿毒癥組選取入院主要診斷為感染性疾病的患者；（3）健康組選取同期健康體檢者。排除標準：（1）年齡＜18歲；（2）合并免疫系統疾病、惡性腫瘤；（3）近半年使用免疫抑制劑；（4）臨床資料不完整；（5）妊娠婦女。膿毒癥組、非膿毒癥組和對照組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組研究對象一般資料比較Table 1 Comparison of general information of three groups of participants

將復蘇后仍需升壓藥維持平均動脈壓≥65 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）且血乳酸＞2 mmol/L定義為休克，將膿毒癥患者進一步分為非休克亞組和合并休克亞組。

本研究經武漢大學人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準（批號：WDRY2020-K223），并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室檢查指標 膿毒癥組和非膿毒癥組患者入院確診并空腹6～8 h后，于次日清晨（對照組于體檢當天）分別采集靜脈血2 ml置于一次性真空采血管（已加乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑的紫色管）中顛倒混勻；另采集靜脈血4～6 ml室溫靜置30 min后，以轉速3 500 r/min（離心半徑16 cm）離心5 min，分離血清。在2 h內完成以下指標的檢測：紅細胞計數（RBC）、白細胞計數（WBC）、中性粒細胞計數（NEU）、血紅蛋白（Hb）、血細胞比容（HCT）、血小板計數（PLT）采用日本Sysmex公司生產的XN-9000全自動血細胞分析儀及其配套試劑進行檢測；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、直接膽紅素（DBiL）和總膽紅素（TBiL）水平采用西門子公司生產的AD2400-1生化分析儀進行測定；PCT采用羅氏診斷公司生產的cobas8000e801全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測。所有指標檢測均在試劑盒說明書規(guī)定的時間內完成，且嚴格遵守實驗相關操作規(guī)程。

1.2.2 qSOFA、感染病原、感染部位 收集研究對象首次實驗室檢查結果和臨床資料，分別計算qSOFA。qSOFA內容：呼吸頻率≥22次/min、收縮壓≤100 mm Hg、意識改變計為1分，總分3分。根據血培養(yǎng)（Bac T/Alert 3D全自動血培養(yǎng)儀，Bruker基質輔助激光解析飛行時間質譜儀），或細菌基因組DNA提取試劑盒（博奧生物集團有限公司）和呼吸道病毒檢測試劑盒（美國Diagnostic Hybrids Inc）的檢測結果，將感染病原種類分為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、病毒、支原體、多重感染和未知病原；按照初發(fā)感染部位分為肺、血液、腹腔、肝膽系統、泌尿系統、皮膚和軟組織、中樞神經系統和其他。

1.2.3 人外周血單個核細胞的分離 采用Ficoll密度梯度離心法。向清潔無菌離心管中加入2 ml人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），再將人外周靜脈血（紫色管）1 ml與經高壓滅菌的0.9%氯化鈉溶液1 ml均勻混合后緩慢加入含有2 ml人淋巴細胞分離液的上層，3 500 r/min離心25 min（離心半徑為16 cm），離心后可觀察到離心管液體由下至上分為3層，取出一二層交界處以單核細胞為主的白色云霧狀液體，加入4 ml無菌0.9%氯化鈉溶液中，充分混勻，1 500 r/min離心10 min（離心半徑為16 cm），重復洗2次，即可得目的細胞。

1.2.4 人外周血單個核細胞總RNA提取 采用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，15596026）提取細胞總RNA，提取完畢后利用Nanodrop 2000C紫外-可見分光光度計（美國Thermo公司）測定RNA濃度及純度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 TLR4 mRNA表達水平檢測 使用Premier 6.0設計TLR4和GAPDH引物，采用PubMed對設計的引物特異性進行驗證，確定最終引物序列，熔解曲線峰單一，可見引物特異性良好（圖1），引物序列見表2。采用Takara逆轉錄試劑盒（日本Takara公司，RR036A）將細胞總RNA逆轉錄為cDNA，并采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒（日本Takara公司，RR901A）對TLR4 mRNA表達水平進行檢測，RT反應條件：37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。在ABI ViiA7實時熒光PCR儀上設置PCR反應程序：（1）95 ℃40 s；（2）95 ℃30 s，64 ℃ 90 s；（4）95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s，循環(huán)數為50，于每次循環(huán)末收集熒光信號。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers for real-time fluorescence quantitative PCR amplification of TLR4 mRNA and GAPDH

圖1 熒光定量PCR熔解曲線圖Figure 1 Fluorescence melting curve analysis of PCR for TLR4 mRNA and GAPDH quantitation

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料采用單樣本Kolmogorov-Smirnov法檢驗各組數據是否符合正態(tài)性，呈正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布采用M（QR）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，采用二元Logistic回歸分析得到TLR4 mRNA與PCT聯合的回歸模型，并繪制TLR4 mRNA與PCT單獨或聯合檢測診斷膿毒癥的受試者工作特征（ROC）曲線，并計算曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異度和約登指數。計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗室檢查指標比較 三組RBC、WBC、NEU、Hb、HCT、PLT、ALT、AST、DBiL比較，差異有統計學意義（P＜0.05），三組TBiL比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中膿毒癥組WBC、NEU、ALT、AST、DBiL較非膿毒癥組、對照組均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；膿毒癥組 RBC、Hb、HCT、PLT較非膿毒癥組、對照組均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組實驗室檢查指標比較〔M（QR）〕Table 3 Comparison of laboratory indicators of three groups of patients

2.2 非膿毒癥組和膿毒癥組qSOFA、感染病原和感染部位情況 非膿毒癥組和膿毒癥組qSOFA比較，差異有統計學意義（P=0.002）。膿毒癥組與非膿毒癥組感染病原比較，差異有統計學意義（P=0.033）；膿毒癥組患者中感染最多的病原微生物是革蘭陰性菌，其次是真菌與革蘭陽性菌；非膿毒癥組中感染最多的病原微生物種類也是革蘭陰性菌，其次是革蘭陽性菌與真菌。膿毒癥組與非膿毒癥組感染部位比較，差異有統計學意義（P=0.003）。膿毒癥組患者感染最多的部位是肺，其次是泌尿系統與肝膽系統；非膿毒癥組患者感染最多的部位是肺，其次是泌尿系統與皮膚和軟組織，見表4。

表4 非膿毒癥組和膿毒癥組qSOFA、感染病原和感染部位比較Table 4 qSOFA scores，pathogens and infected sites in non-sepsis and sepsis groups

2.3 外周血單個核細胞TLR4 mRNA檢測結果 三組外周血單個核細胞TLR mRNA和PCT水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中膿毒癥組外周血單個核細胞TLR mRNA和PCT水平高于非膿毒癥組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；非膿毒癥組外周血單個核細胞TLR4 mRNA和PCT水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表5。

表5 三組外周血單個核細胞TLR4 mRNA和血清PCT水平比較〔M（QR）〕Table 5 TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells and serum PCT in three groups of patients

膿毒癥組革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和其他病原菌感染患者TLR4 mRNA分別為0.154（0.302）、0.139（0.493）、0.119（0.206）和0.151（0.336），膿毒癥組4種感染病原患者TLR4 mRNA比較，差異無統計學意義（H=0.378，P=0.945）。非休克亞組和合并休克亞組分別為35、75例，非休克亞組和合并休克亞組TLR4 mRNA水平分別為0.118（0.323）和0.210（0.330），兩亞組TLR4 mRNA水平比較，差異有統計學意義（Z=1.473，P=0.026）。

2.4 外周血單個核細胞TLR4 mRNA和PCT單獨或聯合檢測對膿毒癥的診斷價值 外周血單個核細胞TLR4 mRNA單獨診斷膿毒癥的AUC為0.813時，對應的截斷值為0.056，95%CI為（0.760，0.859），靈敏度為80.00%，特異度為68.97%，約登指數為0.489 7；血清PCT單獨診斷膿毒癥的AUC為0.818時，對應的截斷值為0.070μg/L，95%CI為（0.768，0.861），靈敏度為87.63%，特異度為75.94%，約登指數為0.635 6；聯合檢測診斷膿毒癥的AUC為0.888時，95%CI為（0.841，0.925），靈敏度為68.04%，特異度為93.10%，約登指數為0.611 4，見圖2。

圖2 外周血單個核細胞TLR4 mRNA和PCT單獨或聯合檢測診斷膿毒癥的ROC曲線Figure 2 ROC analysis of TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells，PCT alone and combination for the diagnosis of sepsis

3 討論

膿毒癥發(fā)展迅速，死亡率高達25%～30%［12］，因此及時診斷膿毒癥對膿毒癥治療至關重要。本研究結果顯示，膿毒癥組較非膿毒癥組和對照組WBC、NEU、ALT、AST、DBiL升高，RBC、Hb、HCT、PLT降低，與HORNIK等［13］研究結果相同。WBC與NEU是臨床判斷有無炎癥的基本指標［1］。中性粒細胞可通過釋放蛋白酶和活性氧自由基促進膿毒癥的過度炎性反應，而全身性的促炎細胞因子大量釋放將引發(fā)細胞因子風暴［14］，從而造成器官損傷。膿毒癥常并發(fā)肝功能障礙，可見ALT、AST與DBiL升高，其機制包括休克和復蘇引起的缺氧性肝損傷以及由中性粒細胞促炎反應產物如組織壞死因子α、IL-1、IL-6、IL-12，由革蘭陰性菌的內毒素激活的Kupffer細胞釋放的活性氧以及來自革蘭陽性菌的脂蛋白和磷壁酸等引起的繼發(fā)性肝損傷［15］。貧血是膿毒癥患者常見的問題，表現為RBC、Hb、HCT與PLT降低，本研究結果與MUADY等［16］研究一致，導致膿毒癥Hb水平急劇下降的機制有全身炎性反應誘導紅細胞生成減少，以及由于溶血和出血導致紅細胞破壞增加。血小板的消耗可能與膿毒癥相關彌散性血管內凝血有關［17］。

LPS是革蘭陰性菌的膜組分，是誘導膿毒癥的重要物質［18］。大量LPS釋放入血與TLR4結合引發(fā)核轉錄因子（NF）-κB信號通路產生大量細胞因子，抗炎-促炎平衡被打破，造成器官損傷，影響預后甚至危及生命［19］。本研究發(fā)現，膿毒癥患者TLR4 mRNA較對照組增高，與KUZMICH等［20］研究發(fā)現的機體感染時TLR4 mRNA上調相符。膿毒癥組與非膿毒癥組TLR4 mRNA表達具有明顯差異，可作為鑒別普通感染與膿毒癥患者的指標。本研究發(fā)現TLR4 mRNA診斷膿毒癥的AUC為0.813時，靈敏度為80.00%，特異度為68.97%。ROHSISWATMO等［5］研究發(fā)現TLR4表達診斷膿毒癥的靈敏度為92.1%、特異度為11.4%，AUC為0.528，可能與該研究對象為新生兒，而本研究對象多為中老年人有關，推測TLR4表達在不同年齡段可能存在差異。

在感染條件下血清PCT的升高受到炎性遞質的刺激，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-1和其他細胞因子［21］。在血液培養(yǎng)確認之前，PCT已被廣泛使用于臨床診斷。本研究發(fā)現PCT診斷膿毒癥的AUC為0.818時，對應截斷值為0.07 μg/L，靈敏度為87.63%，特異度為75.94%，而BOLANAKI等［22］研究發(fā)現PCT診斷急診膿毒癥的AUC為0.86，對應截斷值為0.5μg/L，靈敏度為63.4%，特異度為89.2%，其原因可能是本研究選取全院各科室患者，而BOLANAKI等［22］研究僅選擇急診科室膿毒癥患者。急診科患者病情常更嚴重，手術、腸壁缺血、一些副癌綜合征和癌癥等也會使PCT升高。PCT在燒傷等無感染的情況下也可能升高，且PCT預測革蘭陰性菌血癥的診斷準確性尚有爭議［10，23-24］。TLR4 mRNA聯合PCT診斷膿毒癥的AUC為0.888時，靈敏度為68.04%，特異度為93.10%，優(yōu)于單項檢測結果。

綜上所述，外周血單個核細胞TLR4 mRNA與血清PCT均可作為膿毒癥診斷的有效指標，且二者聯合檢測可進一步提高膿毒癥的診斷效能，對臨床診斷有重要的參考價值。

作者貢獻：胡元慧負責文章的構思與設計、結果的分析與解釋、撰寫并修訂論文，對文章整體負責；湯冬玲進行數據收集、整理及統計學處理、圖表繪制；張平安負責文章的質量控制、監(jiān)督管理及審校。

本文無利益沖突。