血清腫瘤標(biāo)志物與非小細(xì)胞肺癌中表皮生長因子受體基因突變的相關(guān)性研究

計海芬，羅 銳，陳 彧

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及增長速度高居各惡性腫瘤之首，晚期肺癌的 5 年存活率不超過 15%。全球肺癌病例總數(shù)的三分之一在中國[1]。在過去的幾十年里，科學(xué)家們一直致力于開發(fā)新的藥物和治療方法[2-4]。對于非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)病人，治療方式已經(jīng)從傳統(tǒng)的化療和/或放療發(fā)展到個體化治療，特別是靶向治療的應(yīng)用。近年來，以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為靶標(biāo)的分子靶向治療受到國內(nèi)外腫瘤界的普遍關(guān)注[5-7]。大量的回顧性研究表明，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)一線治療EGFR突變陽性的晚期NSCLC顯示出明顯優(yōu)勢，且可明顯減少不良反應(yīng)[8]，提示EGFR 突變對病人接受TKIs治療的療效評估是一個必不可少的因素。腫瘤手術(shù)標(biāo)本用于EGFR突變基因是檢測目前EGFR突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于部分NSCLC病人不滿足手術(shù)指征，無法正常完成EGFR基因突變的檢測，另外細(xì)針穿刺樣本的量少加之腫瘤的異質(zhì)性，嚴(yán)重影響EGFR突變的檢出率[9-10]。故在無法進行EGFR 測序時，我們希望有其他指標(biāo)間接判斷是否存在EGFR突變。

根據(jù)已發(fā)表的研究，血清腫瘤標(biāo)志物可以輔助臨床診斷腫瘤及其原發(fā)部位，而且在我國縣級和省級醫(yī)院都能快速、準(zhǔn)確地檢測出上述各種血清腫瘤標(biāo)志物。它們也可能對癌癥的預(yù)后和治療，以及隨訪監(jiān)測起重要作用[11]。臨床研究表明，癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)和細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)是肺癌[12]治療效果判斷的理想腫瘤標(biāo)志物。在腫瘤組織難以獲取或無法完成EGFR突變檢測時，采用一種或多種血清腫瘤標(biāo)志物來預(yù)測NSCLC病人是否存在EGFR基因突變及對其相關(guān)性進行評價，為臨床治療NSCLC病人提供了重要理論依據(jù)。因此本文就此展開研究，現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機收集中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院 2018 年1月至2020 年8月肺腺癌住院病人128例，均經(jīng)病理學(xué)確診，年齡38～86歲，其中男58例，女70例；記錄病人是否存在吸煙史，依據(jù)EGFR突變檢測結(jié)果分為EGFR突變組和非突變組，并收集2組病人初診時靜脈血5 mL，分離血清3 mL，至-80 ℃凍存?zhèn)溆?。詳?xì)資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤標(biāo)志物檢測 使用商用化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒進行檢測。胃泌素釋放前體(Pro-GRP)采用羅氏E411免疫發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測，SCC、CYFRA21-1、NSE采用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 2000 Pus免疫發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測，CEA和糖類抗原125(CA125)采用貝克曼DIX800免疫發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測，以下是各指標(biāo)的參考值：CEA<5 ng/mL；SCC<2.5 ng/mL；CYFRA21-1<7.0 ng/mL；NSE<10 ng/mL；Pro-GRP<68.3 pg/mL；腫瘤標(biāo)志物值高于上述參考值為陽性。

1.2.2 EGFR突變檢測方法 收集組織學(xué)(手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或器官等)或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本(細(xì)針穿刺、纖維支氣管鏡活檢、胸腔或心包積液等)用于檢測EGFR突變。所有標(biāo)本均用10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded,FFPE)。根據(jù)試劑盒說明書進行，使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒從組織切片中提取DNA。聚合酶鏈反應(yīng)用ABI7500實時PCR系統(tǒng)進行，通過采用擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)和EGFR 29突變檢測試劑盒(廈門艾德生物技術(shù)有限公司提供)進行檢測標(biāo)本是否存在EGFR基因突變。如果檢測到任何外顯子突變，則該腫瘤被鑒定為“EGFR基因突變陽性”；否則，該腫瘤被鑒定為“EGFR突變陰性”。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Mann-WhiyneyU檢驗、χ2檢驗、logistic回歸分析和ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 在NSCLC病人中EGFR突變與未突變的TMS指標(biāo)特征 在NSCLC病人中EGFR的突變與病人的性別、吸煙史、血清SCC以及血清CA125水平相關(guān)(P<0.05～P<0.01)，NSCLC病人中女性發(fā)生突變頻率高于男性(P<0.01)，有吸煙史病人EGFR的突變頻率低于無吸煙史病人(P<0.01)，血清SCC水平陰性病人EGFR的突變頻率高于血清SCC水平陽性(P<0.05)，血清CA125陰性EGFR的突變頻率高于CA125陽性病人(P<0.05)(見表1)。

2.2 NSCLC病人中EGFR突變因素的logistic回歸分析 以EGFR突變?yōu)橐蜃兞?是=1，否=0)，以表1中的年齡、性別(男：0，女：1)、Pro-CRP(陰性：0，陽性：1)、CA125(陰性：0，陽性：1)、CEA(陰性：0，陽性：1)、SCC(陰性：0，陽性：1)、CYFRA21-1(陰性：0，陽性：1)、NSE(陰性：0，陽性：1)、吸煙史(無0，有1)納入回歸方程，采用Forward Condition方法作Binary logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=64.82，P<0.05)。各因素與EGFR基因突變的關(guān)系顯示，隨著年齡增大、血清SCC水平升高，EGFR基因突變的概率呈下降趨勢(P<0.01)，Pro-GRP水平增高其EGFR突變的概率增加(P<0.01)；而性別、 CA125、CEA、CYFRA21-1、NSE及吸煙史與基因突變關(guān)系未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 NSCLC病人中EGFR突變因素的logistic回歸分析

2.3 EGFR突變ROC曲線評價 通過各指標(biāo)ROC曲線的參數(shù)結(jié)果顯示，在血清腫瘤標(biāo)志物中對EGFR基因突變診斷價值具有統(tǒng)計學(xué)意義的是性別、CA125、SCC以及病人的吸煙史(P<0.05)，指標(biāo)聯(lián)合診斷中，性別 +SCC、性別+CA125+SCC、 性別+SCC+吸煙史、CA125+SCC+吸煙史、性別+CA125+SCC+吸煙史五者的AUC均>0.75(P<0.05)，具有較高的診斷價值(見表3、圖1)。

表3 各指標(biāo)及其聯(lián)合診斷EGFR突變ROC曲線的參數(shù)及其敏感度和特異性

3 討論

肺癌是最常見的癌癥類型，在世界范圍內(nèi)死亡率最高[13]。近年來，通過對NSCLC分子特征的深入研究，晚期NSCLC逐漸進入靶向驅(qū)動基因[14]指導(dǎo)下的個體化治療時代。特別是，EGFR突變的NSCLC分子亞型因其高發(fā)病率而成為靶點，盡管TKIs在EGFR突變的病人中顯示出顯著的療效，但由于EGFR突變的檢出率遠(yuǎn)低于預(yù)期，以至于TKIs無法及時有效的發(fā)揮作用[15]。盡管組織活檢檢測EGFR突變狀態(tài)已成為金標(biāo)準(zhǔn)，但常因為部分病人存在不符合手術(shù)指征或穿刺獲取組織可能增加潛在的癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險，使得獲取組織樣本愈加困難，進而進一步影響了EGFR檢測率[16]。雖然已有大量研究表明，組織與血液樣本的EGFR突變狀態(tài)一致性為60% ～ 80%[17]，但與方便、常用的血清腫瘤標(biāo)志物相比，由于技術(shù)上的局限性，血液EGFR檢測并沒有普遍適用性，特別是在一些基層醫(yī)院無法應(yīng)用于臨床指導(dǎo)。鑒于我國人口基數(shù)大，醫(yī)療資源的分布不均，不同水平的基因測試技術(shù)和測試成本相對較高，病人在接受EGFR-TKI治療時，并不總是先檢測EGFR突變。因此，一種無創(chuàng)易用的方法預(yù)測EGFR突變狀態(tài)是必要的，特別是對于EGFR突變率較高的我國NSCLC病人。

本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中發(fā)生EGFR突變與病人初診的血清腫瘤標(biāo)志SCC和CA125密切相關(guān)，另外和臨床治療性別和吸煙史也存在相關(guān)性，研究顯示在NSCLC病人中SCC和CA125水平越低發(fā)生EGFR突變的概率就越大；同時NSCLC病人中有吸煙史的發(fā)生EGFR突變的概率低于無吸煙史病人，這個結(jié)論與CHAPMAN等[18]報道一致；NSCLC病人中女性的EGFR突變的概率高于男性，這與WANG等[19]報道一致。然而，我們發(fā)現(xiàn)肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物CYRA21-1、CEA、NSE、Pro-GRP與NSCLC病人發(fā)生EGFR突變無相關(guān)性，與CHO等[20]報道一致。

我們還證明，結(jié)合臨床特征和血清腫瘤標(biāo)志物水平可以預(yù)測EGFR突變陽性。多因素分析顯示性別、吸煙史、CA125以及SCC水平是EGFR突變的預(yù)測因子。當(dāng)這4個因素結(jié)合時，ROC曲線的AUC為0.817。這一結(jié)果表明，結(jié)合相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物水平，是可以有效預(yù)測EGFR突變，另外我們組合了不同4個因素的組合，其中性別 +SCC、性別+CA125+SCC、性別+SCC+吸煙史、CA125+SCC+吸煙史、性別+CA125+SCC+吸煙史四者的AUC均>0.75，具有較高的診斷價值。當(dāng)然本研究也有一些局限性,首先，作為一項回顧性研究，一些腫瘤組織難以獲得，并且可能發(fā)生病人納入和樣本選擇偏倚；其次，我們沒有評估EGFR-TKI治療后的各指標(biāo)的反應(yīng)情況，也沒有根據(jù)臨床病理分期及家族遺傳等因素進行分析；最后，本研究選擇的樣本量少，可能存在統(tǒng)計學(xué)上的偏差，因此多中心的大樣本量研究需要進一步的研究。

綜上所述，本文旨在研究血清腫瘤標(biāo)志物水平和/或臨床因素是否可以預(yù)測NSCLC病人的EGFR突變情況，研究顯示EGFR突變與臨床特征和血清腫瘤標(biāo)志物相關(guān)，包括性別、吸煙史、CA125和SCC水平。因此，血清腫瘤標(biāo)志物CA125、SCC和/或臨床因素(性別、吸煙史)可以結(jié)合來預(yù)測無法進行基因檢測的NSCLC病人的EGFR突變狀態(tài)。